安廣杰，衛(wèi)夢(mèng)雅，王章存*，趙學(xué)偉，賀志錚，李秀芳

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001；3.河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001）

小麥?zhǔn)俏覈?guó)的主要糧食作物，近幾年全國(guó)小麥產(chǎn)量超億噸。但目前小麥面粉食品的消費(fèi)量卻呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此小麥深加工和資源轉(zhuǎn)化成為我國(guó)小麥利用的主要研究方向。

小麥面粉主要由淀粉和蛋白質(zhì)組成。淀粉具有糊化、回生、凍融穩(wěn)定性、凝膠性等功能特性[1]，可作增稠劑、穩(wěn)定劑和脂肪替代品等；谷朊粉是小麥蛋白質(zhì)常用的商品名稱(chēng)[2]，主要由醇溶蛋白和麥谷蛋白組成，具有黏性、彈性、延伸性、成膜性和吸脂性，但因其疏水性強(qiáng)、溶解度低，應(yīng)用范圍有限[3]。谷朊粉含有豐富的蛋白肽，蛋白肽中的谷氨酰胺具有多種生理功能，如抗氧化[4-5]、解酒[6]、免疫調(diào)節(jié)[7-8]、降血糖[9]、保護(hù)腸黏膜[10-11]、促進(jìn)胃黏膜修復(fù)[12-14]等，是其他任何蛋白質(zhì)無(wú)法比擬的優(yōu)質(zhì)蛋白，不僅在食品領(lǐng)域有廣泛用途，也可大量用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的添加，市場(chǎng)前景廣闊[15]。

目前小麥蛋白肽的生產(chǎn)是以高純度的小麥蛋白為原料，通過(guò)加入不同蛋白酶水解，將大分子蛋白質(zhì)降解為不同長(zhǎng)度的小分子（即蛋白肽）。生產(chǎn)小麥蛋白肽的過(guò)程需要較長(zhǎng)的工藝路線和較為復(fù)雜的生產(chǎn)設(shè)備，且消耗大量的水，并產(chǎn)生大量廢水，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，而且，谷朊粉的干燥過(guò)程需要消耗大量的能量[16-17]。因此，市場(chǎng)以及企業(yè)迫切需要新的工藝技術(shù)來(lái)生產(chǎn)小麥蛋白肽，從而為小麥資源轉(zhuǎn)化開(kāi)發(fā)新的市場(chǎng)和道路。

聯(lián)合制備淀粉糖和小麥蛋白肽的工藝是以小麥面粉為原料，采取先用蛋白酶水解生產(chǎn)蛋白肽，經(jīng)離心分離后，再用淀粉酶水解淀粉生成相應(yīng)的淀粉糖，省去了單純生產(chǎn)小麥淀粉和谷朊粉的過(guò)程，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝流程，可大大減少設(shè)備投資、縮短生產(chǎn)周期、實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)、提高生產(chǎn)效率[18]；生產(chǎn)過(guò)程也大大減少了水的用量和排放，有利于減少環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)綠色化生產(chǎn)[19]。目前還未出現(xiàn)此工藝的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。作者是在此研究的基礎(chǔ)上，以小麥面粉為原料，以小麥蛋白肽純度、得率等為指標(biāo)，研究了不同浸泡預(yù)處理工藝和不同酶對(duì)制備小麥蛋白肽的影響，為小麥蛋白肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥面粉：購(gòu)于中糧面業(yè)集團(tuán)（蛋白質(zhì)9%，碳水化合物75%，脂肪1.5%，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；Alcalase 2.4 L：丹麥諾維信公司產(chǎn)品；中性蛋白酶（200 000 U/g）：索萊寶（北京）公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司產(chǎn)品；UV-8100 B 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京萊伯泰科儀器有限公司產(chǎn)品；FD-1-50 型真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 工藝路線及實(shí)驗(yàn)內(nèi)容采用兩種工藝路線（見(jiàn)圖1）生產(chǎn)小麥蛋白肽，兩者主要區(qū)別在于浸泡處理（55 ℃，2 h）和加酶順序不同。采用堿性蛋白酶時(shí)，pH 為8.5；采用中性蛋白酶時(shí)，pH 為7。

圖1 工藝路線Fig.1 Process route

首先，通過(guò)考察不同工藝路線下蛋白酶水解效果，得到最佳工藝路線。其次，在路線中依次改變浸泡溫度和浸泡時(shí)間，通過(guò)對(duì)酶解物中蛋白肽純度、得率、水解度和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分析，比較兩種酶的水解效果。

1.3.2 酶水解實(shí)驗(yàn)按照工藝路線2 設(shè)定單因素實(shí)驗(yàn)的基本條件為：面粉與水按1 g∶7 g 混合，浸泡溫度為50 ℃，浸泡2.5 h 后調(diào)pH 并加酶酶解，加酶量為1.2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），以淀粉質(zhì)量計(jì)，酶解時(shí)間2 h。

以蛋白肽純度、得率、水解度和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，不加酶組為對(duì)照組，分別考察浸泡溫度、浸泡時(shí)間對(duì)兩種酶水解效果的影響。各因素梯度設(shè)定：浸泡溫度分別為：45、50、55、60、65 ℃；浸泡時(shí)間分別為：1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。

1.3.3 蛋白肽純度和得率測(cè)定采用Folin-酚試劑法[20]測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量，并依此計(jì)算蛋白肽純度和得率。

式中：P為蛋白肽純度，%；M1為上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；M2為上清液中固形物總質(zhì)量，g；Y為蛋白肽得率，%；M3為初始樣品總蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g。

1.3.4 水解度測(cè)定采用OPA（鄰苯二甲醛）法[21]測(cè)定，水解度按下式計(jì)算：

式中：DH 為水解度，%；h為被水解的肽鍵數(shù)；htot為蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)。

1.3.5 還原糖的測(cè)定為了驗(yàn)證蛋白酶中含有少量的淀粉酶可以酶解淀粉產(chǎn)生還原糖進(jìn)入上清液。采用斐林試劑法[22]測(cè)定上清液中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。根據(jù)下式計(jì)算還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)：

式中：C為還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；M4為上清液中還原糖質(zhì)量，g；M5為初始樣品總糖質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同浸泡預(yù)處理工藝對(duì)兩種酶制備小麥蛋白肽的影響

為了滿足不同的生產(chǎn)要求，考察了堿性蛋白酶和中性蛋白酶兩種酶的水解效果。

2.1.1 對(duì)堿性蛋白酶水解效果的影響兩種工藝路線下堿性蛋白酶水解效果 （包括蛋白肽純度、得率等）見(jiàn)表1，工藝路線2 得到的蛋白肽純度明顯比路線1 高，但兩種路線的蛋白肽得率和水解度差異較小，另外路線2 的上清液中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯較路線1 低。這可能是因?yàn)榻萏幚砬凹用?，淀粉和蛋白質(zhì)還未分離，難以進(jìn)行酶解，且隨著酶解時(shí)間的增加，蛋白酶活力下降，酶解效果減弱，但在浸泡處理后加酶，淀粉顆粒膨脹，體積增大，反而使蛋白質(zhì)分散度增加，與酶結(jié)合概率增大，酶解效果得到提升[23-24]，因此，工藝路線2 即浸泡處理后加酶水解效果較佳。

表1 兩種工藝路線下堿性蛋白酶水解效果Table 1 Effect of alkaline protease hydrolysis under two processes

兩種工藝路線的蛋白肽純度都不高，一方面可能是因?yàn)檫€原糖的存在，另一方面可能是因?yàn)榈矸畚蛎浭桂ざ仍黾?，?dǎo)致蛋白質(zhì)被包裹其中難以分離，上清液中蛋白質(zhì)減少。

2.1.2 對(duì)中性蛋白酶水解效果的影響兩種工藝路線下中性蛋白酶水解效果見(jiàn)表2，工藝路線2 得到的蛋白肽純度和得率明顯比路線1 高，但路線2的蛋白質(zhì)水解度明顯較路線1 低，且路線2 的還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與路線1 相比較小。

表2 兩種工藝路線下中性蛋白酶水解效果Table 2 Effect of neutral protease hydrolysis under two processes

比較表1和表2可知，中性蛋白酶水解得到的小麥蛋白肽純度和得率都較堿性蛋白酶高，并且堿性蛋白酶對(duì)還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響較顯著，而中性蛋白酶影響較小。其中原因可能是堿性蛋白酶含有少量淀粉酶能夠水解淀粉產(chǎn)生還原糖，導(dǎo)致肽純度降低。因此，以蛋白肽純度和得率為指標(biāo)，考察兩種工藝路線下中性蛋白酶水解效果，得出工藝路線2 即浸泡處理后加酶提取小麥蛋白肽效果最佳。

其中，中性蛋白酶水解所得蛋白肽純度較堿性蛋白酶高，但總量仍然較低，這可能是因?yàn)楸M管還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低使其純度較高，但淀粉的黏度增加導(dǎo)致了上清液中蛋白質(zhì)減少。

2.2 浸泡溫度對(duì)酶水解效果的影響

2.2.1 對(duì)蛋白肽純度的影響不同蛋白酶水解所得小麥蛋白肽的純度見(jiàn)圖2，小麥蛋白肽的純度都隨溫度的升高先上升后逐漸下降，在50 ℃時(shí)分別達(dá)到最高值。這可能是因?yàn)樵?5～65 ℃存在一個(gè)臨界點(diǎn)溫度，在臨界點(diǎn)溫度前，蛋白肽被部分糊化的淀粉包裹[25-26]，難以分離，因此純度較低；在臨界點(diǎn)時(shí)，淀粉顆粒膨脹，體積增大反而增加蛋白質(zhì)分散度，使其更易被酶解，因此純度升高；但高于此溫度，糊化度升高，蛋白質(zhì)逐漸變性，黏度增加，膨脹的淀粉顆粒難以分離并發(fā)生酶解反應(yīng)，酶活力也在逐漸下降[27-28]，上清液中蛋白質(zhì)減少，蛋白酶中淀粉酶活力逐漸上升，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，因此，小麥蛋白肽純度降低。臨界點(diǎn)溫度為50 ℃。

圖2 浸泡溫度對(duì)蛋白肽純度的影響Fig.2 Effect of soaking temperature on peptide purity

2.2.2 對(duì)蛋白肽得率的影響不同蛋白酶水解所得蛋白肽得率見(jiàn)圖3，蛋白肽得率都隨著溫度升高先增加后逐漸減少，但中性蛋白酶水解效果更佳。由圖2可知，50 ℃為臨界點(diǎn)溫度，此時(shí)蛋白質(zhì)分散度增加，更易被酶解，得率最高，但高于此溫度，淀粉逐漸膨脹，黏度增加，與蛋白質(zhì)難以分離，酶活力也在高溫下逐漸失活，上清液中蛋白質(zhì)減少，因此得率逐漸降低。

圖3 浸泡溫度對(duì)蛋白肽得率的影響Fig.3 Effect of soaking temperature on peptide yield

2.2.3 對(duì)蛋白肽水解度的影響不同蛋白酶作用下蛋白肽水解度見(jiàn)圖4，蛋白肽水解度都隨著溫度升高先增加后逐漸減少，這可能是因?yàn)榕R近50 ℃，蛋白質(zhì)的分散度增加，使其更易被水解，因此水解度逐漸增加，但高于50 ℃，酶逐漸失去活性，淀粉顆粒膨脹，黏度增加，吸水量變大，與蛋白質(zhì)難以分離[29]，小肽難以進(jìn)入上清液，因此，上清中蛋白質(zhì)減少，使其水解度逐漸下降。

圖4 浸泡溫度對(duì)蛋白肽水解度的影響Fig.4 Effect of soaking temperature on peptide hydrolysis degree

2.2.4 對(duì)還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響由于提取過(guò)程中存在部分雜質(zhì)和糖進(jìn)入酶解物，因此對(duì)兩種酶解物中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行分析（見(jiàn)圖5）。還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)都隨著溫度升高先增加后降低。55 ℃時(shí)，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高，證明蛋白酶中確實(shí)存在少量淀粉酶，能夠酶解淀粉產(chǎn)生還原糖。堿性蛋白酶處理組還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)高于中性蛋白酶處理組。隨著溫度升高，淀粉酶活力逐漸提升[30]，淀粉被降解為小分子低聚糖，使還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。離心使物料中的還原糖進(jìn)入上清液，其還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高；高于55 ℃時(shí)，淀粉逐漸糊化，底物黏度升高，流動(dòng)性差，沉淀物逐漸增多，上清液質(zhì)量減少，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)也逐漸降低。

圖5 浸泡溫度對(duì)還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.5 Effect of the soaking temperature on the reducing sugar content

綜合以上結(jié)果，浸泡溫度選擇50 ℃為最佳。

2.3 浸泡時(shí)間對(duì)酶水解效果的影響

2.3.1 對(duì)蛋白肽純度的影響不同蛋白酶水解所得蛋白肽純度見(jiàn)圖6，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白肽純度都先增加后減少，浸泡2.5 h 時(shí)，蛋白肽純度達(dá)到最高，中性蛋白酶水解得到蛋白肽純度為27%，堿性蛋白酶水解得到蛋白肽純度為25%。因此，浸泡時(shí)間2.5 h 較為合適。這可能是因?yàn)殡S著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶水解效果逐漸增加，蛋白肽純度逐漸增加，當(dāng)浸泡時(shí)間超過(guò)2.5 h，淀粉吸水膨脹，黏度增加，與蛋白質(zhì)難以分離，上清液中蛋白質(zhì)減少，蛋白肽純度逐漸下降。

圖6 浸泡時(shí)間對(duì)蛋白肽純度的影響Fig.6 Effect of soaking time on peptide purity

2.3.2 對(duì)蛋白肽得率的影響不同蛋白酶水解所得蛋白肽得率見(jiàn)圖7，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白肽得率都先增加后減小。浸泡2.5 h 時(shí)，蛋白肽得率最高，堿性蛋白酶處理組達(dá)到85%，中性蛋白酶處理組為75%，因此，確定浸泡時(shí)間為2.5 h。隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，淀粉顆粒膨脹可能增加蛋白質(zhì)的分散度，使其更易被酶水解，超過(guò)2.5 h，淀粉顆粒體積過(guò)大且臨近糊化狀態(tài)，物料流動(dòng)性變差，可能會(huì)阻隔蛋白質(zhì)與酶反應(yīng)，因此，得率逐漸降低。堿性蛋白酶水解效果較中性蛋白酶佳。

圖7 浸泡時(shí)間對(duì)蛋白肽得率的影響Fig.7 Effect of soaking time on the peptide yield

2.3.3 對(duì)蛋白肽水解度的影響不同蛋白酶作用后，蛋白肽水解度見(jiàn)圖8，隨著時(shí)間增加，水解度都逐漸降低。這是因?yàn)殡S著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，淀粉顆粒膨脹，體積變大，糊化度升高，臨近糊化狀態(tài)，流動(dòng)性變差，可能會(huì)阻隔蛋白質(zhì)與酶反應(yīng)，時(shí)間越久，黏度越大，可被水解的蛋白質(zhì)包裹其中，難以分離，同時(shí)酶活力也逐漸下降，因此水解度逐漸降低，但相同條件下，堿性蛋白酶水解效果較中性蛋白酶佳。

圖8 浸泡時(shí)間對(duì)蛋白肽水解度的影響Fig.8 Effect of soaking time on peptide hydrolysis degree

綜上可知，以小麥蛋白肽純度和得率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇時(shí)間為2.5 h 最佳。

2.3.4 對(duì)還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響對(duì)兩種酶解物中的還原糖進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖9，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)都隨著浸泡時(shí)間的增加逐漸降低，這可能是因?yàn)榻輹r(shí)間越久，淀粉顆粒越膨脹，結(jié)合水分的含量越高，因此離心得到的上清液質(zhì)量越少，其還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低。堿性蛋白酶水解得到的還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較中性蛋白酶高，證明堿性蛋白酶中淀粉酶較多。

圖9 浸泡時(shí)間對(duì)還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.9 Effect of soaking time on the reducing sugar content

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

以不加酶組為空白對(duì)照組，測(cè)得蛋白肽純度為5.5%，得率為17.1%，水解度為2.4%，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.1%，進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白酶中含有少量淀粉酶可以產(chǎn)生還原糖，堿性蛋白酶中淀粉酶含量高于中性蛋白酶。

3 結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)對(duì)不同預(yù)處理和不同酶制備蛋白肽效果的影響進(jìn)行研究，得到以下結(jié)論：1）浸泡預(yù)處理工藝采取浸泡后加酶水解效果更佳。2）通過(guò)對(duì)酶解物中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明堿性蛋白酶中淀粉酶含量較高，會(huì)產(chǎn)生相對(duì)多的淀粉糖。此現(xiàn)象尚未在工業(yè)生產(chǎn)中引起重視，為了提高蛋白肽純度和得率，也需要進(jìn)一步探究和觀察。3）最佳浸泡條件為浸泡溫度50 ℃，浸泡時(shí)間2.5 h。此條件下，中性蛋白酶水解得到蛋白肽純度為27%，得率為75%，水解度為17.6%，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.9%；堿性蛋白酶水解得到蛋白肽純度為25%，得率為85%，水解度為23.7%，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，探討了非糊化工藝及條件對(duì)小麥蛋白肽酶法生產(chǎn)的影響及機(jī)理，要想獲得更科學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，還需要通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。另外，蛋白肽的純度整體較低，主要是酶解時(shí)間有限，在后續(xù)研究中將對(duì)酶解條件做進(jìn)一步探究。