成端輝 黃韋政 賴(lài)應(yīng)森 雷國(guó)堅(jiān)

癌癥轉(zhuǎn)移是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，且仍然是癌癥治療中的主要挑戰(zhàn)之一。癌癥轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，包括癌細(xì)胞在原發(fā)部位的侵襲、血管內(nèi)滲入循環(huán)、循環(huán)中的存活、循環(huán)外滲及轉(zhuǎn)移部位的附著和定植[1]。癌細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤脫落滲入血液并在血液中循環(huán)后被稱(chēng)為循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）[2]。CTC 具有移動(dòng)、遷移和侵入血管的能力，被認(rèn)為是體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移的主要原因[3]。由于CTC 直接來(lái)源于腫瘤且是活的細(xì)胞，因此CTC 攜帶有原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的分子和生物學(xué)信息，可用于早期疾病檢測(cè)、治療反應(yīng)和疾病進(jìn)展評(píng)估、疾病機(jī)制闡明和藥物開(kāi)發(fā)的治療靶點(diǎn)識(shí)別等，是一種有前景的生物標(biāo)志物[4-5]。結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，常見(jiàn)于40～50 歲男性，是全球第三大常見(jiàn)的癌癥，每年導(dǎo)致近100 萬(wàn)人死亡[6]。結(jié)腸癌在我國(guó)的發(fā)病率與死亡率低于胃癌、食管癌、肺癌等常見(jiàn)惡性腫瘤，但近年隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[7]。早期發(fā)現(xiàn)和精準(zhǔn)治療是改善結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。過(guò)去，結(jié)腸癌的確診主要依靠活檢技術(shù)，但單個(gè)靜態(tài)活檢標(biāo)本無(wú)法實(shí)時(shí)反映腫瘤的特征。因此，迫切需要一種更安全、更實(shí)時(shí)的方法來(lái)獲取全面、動(dòng)態(tài)的信息，以反映癌癥的發(fā)展和治療反應(yīng)，以補(bǔ)充或替代實(shí)體組織活檢[8]。CTC 具有提供大量生物信息的潛力，同時(shí)支持單細(xì)胞分析，引起了研究人員的廣泛關(guān)注。

多項(xiàng)研究表明，CTC 對(duì)評(píng)估結(jié)腸癌的預(yù)后很有價(jià)值。CTC 檢測(cè)有利于結(jié)腸癌的早期診斷和監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)，CTC 的表型和分子特征與原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶類(lèi)似，有助于揭示結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制和轉(zhuǎn)移機(jī)制，并識(shí)別靶基因中的特定突變[9]。但是，CTC的稀有性和異質(zhì)性及檢測(cè)和分析技術(shù)的發(fā)展限制了CTC 作為一種新的生物標(biāo)志物的推廣應(yīng)用。本綜述將概述CTC 的研究現(xiàn)狀，并討論CTC 檢測(cè)在結(jié)腸癌患者中的效用以及前景。

1 CTC富集和分離技術(shù)

有研究表明，CTC 在醫(yī)學(xué)影像學(xué)檢查檢測(cè)到腫瘤病變前就存在于血液，但含量極低[10]。即便到了腫瘤晚期，患者1 mL 外周血中通常只有1 個(gè)CTC[11]。此外，當(dāng)腫瘤細(xì)胞脫離原來(lái)的組織后容易發(fā)生表型變化，易受細(xì)胞凋亡和固有的脆性影響，只有少數(shù)細(xì)胞可以存活[11]。因此，CTC 的捕獲難度較大，尤其是發(fā)明可有效檢測(cè)活CTC 以進(jìn)行后續(xù)深入分析的分離方法仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

1.1 基于CTC 物理特性捕獲技術(shù) 物理富集和分離方法是基于CTC 的物理特性，利用尺寸、膜電荷和密度等方面與血細(xì)胞的差異，通過(guò)特定平臺(tái)進(jìn)行分離[12]。如AccuCyte 系統(tǒng)的原理是利用CTC 的特定密度。CTC 的密度介于血漿和紅細(xì)胞之間，利用密度介質(zhì)的不同沉降系數(shù)梯度離心，不同密度的細(xì)胞在分離液中分層分布，實(shí)現(xiàn)CTC 的分離[13]。也可利用膜電位差異來(lái)檢測(cè)和計(jì)數(shù)CTC。阿尼爾等構(gòu)建了雙電層門(mén)控AlGaN/GaN 高電子遷移率晶體管生物傳感器陣列實(shí)現(xiàn)了CTC 的捕獲[14]。但白細(xì)胞和CTC 之間存在一些物理性質(zhì)的重疊，這導(dǎo)致物理方法獲取的CTC 特異性差及一些CTC 丟失。

1.2 基于CTC 生物特性捕獲技術(shù) 生物富集和分離方法是利用CTC 特定的表面標(biāo)記分子，使用分子探針，如抗體、肽鏈和配體等靶向識(shí)別標(biāo)記分子，再通過(guò)分選系統(tǒng)篩出CTC，常見(jiàn)的標(biāo)記分子有EpCAM+、DAPI+、CD45-、細(xì)胞角蛋白+等[15]。最具代表性的分選系統(tǒng)是CellSearch 系統(tǒng)[16]。CellSearch 系統(tǒng)首先利用涂有EpCAM 抗體的免疫磁珠與樣本細(xì)胞孵育和分離，然后使用抗細(xì)胞角蛋白抗體識(shí)別CTC 細(xì)胞，使用CD45 抗體識(shí)別混雜的白細(xì)胞，最后通過(guò)流式分選出高純度的CTC。CellSearch 系統(tǒng)已被美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于結(jié)直腸癌、乳腺癌和前列腺癌患者的診斷。

近年來(lái)，也出現(xiàn)了多種基于EpCAM 的CTC 富集和分離新技術(shù)。Cui 等[17]構(gòu)建了一種具有特異性捕獲和非破壞性釋放癌細(xì)胞雙重功能的新型三維微納生物芯片，該芯片可以高效捕獲的CTC，且對(duì)細(xì)胞活力損傷小。纖維墊是一種可用于分選特異性CTC 的納米材料，Lee 等[18]優(yōu)化了以尼龍6 為主要材料的纖維墊，將環(huán)氧乙烷混合到尼龍6 中，提高了纖維墊的細(xì)胞基質(zhì)親和力和低白細(xì)胞吸附能力，提高了對(duì)CTC 的分離效率和樣品純度。但基于生物特性的方法仍存在缺點(diǎn)，即不能有效地分離具有非特異性表面抗原表達(dá)的CTC。

1.3 最新CTC 捕獲技術(shù) 除了上面討論的經(jīng)典CTC 富集與分離技術(shù)外，近年來(lái)還出現(xiàn)了一些較新的技術(shù)，如基于微流體和基于納米技術(shù)的CTC 富集與分離。

微流體捕獲技術(shù)結(jié)合了生物和物理捕獲技術(shù)兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，利用循環(huán)內(nèi)在特性（如流體動(dòng)力）與人為外在干預(yù)（如磁場(chǎng)、電場(chǎng)、聲學(xué)和光學(xué)力）來(lái)分離細(xì)胞，提高了CTC 富集與分離的靈敏度和特異度。Jiang 等[19]設(shè)計(jì)集成了一種微流控系統(tǒng)，可以快速、高靈敏度檢測(cè)CTC。該系統(tǒng)利用流體特性，在血液中捕獲綠色熒光蛋白（GFP）陽(yáng)性細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了90%的捕獲率、50%的純度和90%以上的成活率。在轉(zhuǎn)移性癌癥患者中該系統(tǒng)的陽(yáng)性捕獲率為83.3%。該系統(tǒng)與CellSearch 系統(tǒng)的捕獲率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但該系統(tǒng)具有血量、時(shí)間和成本的優(yōu)勢(shì)，且對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有影響。

基于納米技術(shù)的CTC 富集與分離方法目前在疾病早期檢測(cè)CTC 和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)癌癥發(fā)展方面展現(xiàn)出了良好的前景。納米材料的優(yōu)點(diǎn)是具有大的表面積與體積比，因此可以結(jié)合更多的抗體或配體與CTC 特異性結(jié)合，進(jìn)而高效分離純化CTC。目前用于CTC檢測(cè)的納米材料包括磁性納米粒子、金納米粒子、量子點(diǎn)等[20]。

2 CTC的生物學(xué)信息

CTC 是從原發(fā)性腫瘤脫落滲入血液并在血液中循環(huán)癌細(xì)胞。它的來(lái)源決定了它攜帶有與原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞相似的生物學(xué)信息，識(shí)別CTC 的生物學(xué)信息有助于理解原發(fā)疾病的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)識(shí)別等[21]。

2.1 CTC 的分子特征 CTC 主要的分子特征包括上皮標(biāo)志物、間充質(zhì)標(biāo)志物和癌癥特異性CTC 標(biāo)志物[22]。掌握CTC 的分子特征將有助于癌癥的早期診斷和預(yù)防轉(zhuǎn)移。目前乳腺癌、前列腺癌、大腸癌、胃癌、食道癌等10 余種癌癥的CTC 特異性分子已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用[23]。如乳腺癌中的上皮標(biāo)志物EpCAM/CK/E-鈣黏蛋白、間充質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白、特定標(biāo)記HER2；前列腺癌中的特定標(biāo)記PSMA；腎癌中的特定標(biāo)記CD147；大腸癌中的特定標(biāo)記PI3Kα/CEA 等。

由于大多數(shù)癌癥是上皮起源的，因此最常用于識(shí)別CTC 的標(biāo)志分子是EpCAM。但使用EpCAM 作為CTC 標(biāo)記有局限性。它不能用于EpCAM 陰性或低表達(dá)的腫瘤，如神經(jīng)源性癌癥。即便在EpCAM高表達(dá)的腫瘤中，僅檢測(cè)EpCAM 陽(yáng)性CTC 可能會(huì)低估了實(shí)際的CTC 數(shù)量，在某些癌癥類(lèi)型中，在EpCAM 高表達(dá)的腫瘤中存在大量EpCAM 陰性CTC[24]。因此，綜合使用上皮標(biāo)志物、間充質(zhì)標(biāo)志物和癌癥特異性CTC 標(biāo)志物的檢測(cè)方法，在檢出CTC 上更具可靠性。

2.2 CTC 的基因組特征 組織基因分型是傳統(tǒng)上公認(rèn)的癌癥診斷金標(biāo)準(zhǔn)方法，用于識(shí)別人類(lèi)基因組改變。然而，這種技術(shù)是一種高侵入性、昂貴且耗時(shí)的方法，不適用于少量腫瘤組織或癌癥的后續(xù)治療。CTC 基因組分析可以提供有關(guān)腫瘤細(xì)胞突變譜的信息，幫助臨床醫(yī)生選擇治療方法和對(duì)患者進(jìn)行隨訪。

特別是使用非侵入性液體活檢連續(xù)取樣分離CTC 檢測(cè)腫瘤的基因組的穩(wěn)定性，可早期發(fā)現(xiàn)腫瘤進(jìn)化和耐藥腫瘤亞克隆的出現(xiàn)，有助于評(píng)估治療反應(yīng)和精準(zhǔn)醫(yī)療。但許多癌癥的CTC 基因突變分析顯示，CTC 和相應(yīng)的原發(fā)性腫瘤之間的突變不完全一致，因此可能會(huì)干擾對(duì)病情的評(píng)估[25]。如一項(xiàng)結(jié)直腸癌CTC 的研究顯示，CTC 和原發(fā)腫瘤之間的突變一致性率為37%～90%[26]。因此，CTC和腫瘤樣本的突變檢測(cè)相結(jié)合才能更準(zhǔn)確地指導(dǎo)治療。

隨著單細(xì)胞測(cè)序的發(fā)展，目前針對(duì)CTC 轉(zhuǎn)錄組的研究被應(yīng)用在了癌癥的診斷和預(yù)后上。如Magbanua 等[27]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中CTC 高表達(dá)Ki-67 的預(yù)后不良。

3 CTC的臨床應(yīng)用

目前，臨床上對(duì)乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌等多種癌癥已經(jīng)將CTC 檢測(cè)作為組織活檢的替代或補(bǔ)充方案。通過(guò)液體活檢定期監(jiān)測(cè)循環(huán)中的CTC，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病過(guò)程的監(jiān)測(cè)、檢測(cè)新出現(xiàn)的耐藥性基因、識(shí)別新的分子靶點(diǎn)。CTC是癌癥轉(zhuǎn)移的主要原因，因此監(jiān)測(cè)CTC 在癌癥診斷、治療、預(yù)后評(píng)估上有巨大的應(yīng)用潛力。

3.1 癌癥的早期診斷 計(jì)算機(jī)斷層掃描、磁共振成像等影像學(xué)上檢測(cè)到腫瘤病變時(shí)，腫瘤實(shí)體至少已經(jīng)具有109個(gè)腫瘤細(xì)胞。而在多項(xiàng)小鼠模型實(shí)驗(yàn)中，研究者發(fā)現(xiàn)乳腺癌、胰腺癌80% 的轉(zhuǎn)移灶來(lái)自早期播散性癌細(xì)胞，表明CTC 的出現(xiàn)可能是癌癥進(jìn)展中非常早期的事件[11]。而在人早期乳腺癌研究中，Barrière 等[28]在41%的T1期和47%的腋窩淋巴結(jié)陰性乳腺癌患者中檢測(cè)到CTC，早于影像學(xué)發(fā)現(xiàn)病灶。上述發(fā)現(xiàn)表明CTC 在影像學(xué)未察覺(jué)腫瘤實(shí)體前已經(jīng)存在。因此CTC 可以應(yīng)用在癌癥早期診斷。但CTC 數(shù)量少、和白細(xì)胞生物學(xué)特性有重疊，導(dǎo)致早期檢測(cè)的敏感性有限，阻礙了它們作為早期癌癥診斷中的有效生物標(biāo)志物的使用。

3.2 癌癥的治療方案 通過(guò)檢測(cè)CTC 基因突變，可以監(jiān)測(cè)腫瘤耐藥性和篩選有效的治療靶點(diǎn)。如確定EGFR 突變的狀態(tài)對(duì)于接受酪氨酸激酶抑制劑治療的非小細(xì)胞肺癌患者至關(guān)重要。Maheswaran 等[29]對(duì)29 例非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行CTC 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，發(fā)生癌癥轉(zhuǎn)移的患者中92%發(fā)生了EGFR 激活突變，對(duì)酪氨酸激酶抑制劑治療效果不佳，特別同時(shí)檢測(cè)到T790M 突變的患者，該突變導(dǎo)致患者對(duì)酪氨酸激酶抑制劑耐藥，無(wú)進(jìn)展生存期明顯縮短。

3.3 預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo) CTCs 的預(yù)后價(jià)值已被廣泛研究。迄今為止，大量研究已經(jīng)證明CTC 在患有各種類(lèi)型實(shí)體瘤（尤其是乳腺癌）患者中的預(yù)后意義。一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)研究匯總了21 項(xiàng)研究包含2 239 例乳腺癌患者新輔助化療前的CTC 計(jì)數(shù)，計(jì)算CTC 計(jì)數(shù)對(duì)患者生存的影響，結(jié)果顯示CTC≥5 個(gè)/mL 的患者預(yù)后較差[29]。此外，在治療期間CTC 計(jì)數(shù)增加或未能清除也提示治療反應(yīng)不好，預(yù)后不良。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，CTCs 的分子表型亦具有很強(qiáng)的預(yù)后價(jià)值。如在EpCAM 陽(yáng)性乳腺癌患者中CTC 過(guò)表達(dá)WIST1與較差的預(yù)后相關(guān)[30]。

4 CTC在結(jié)腸癌中研究進(jìn)展

結(jié)腸癌是一個(gè)重大的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，是發(fā)達(dá)國(guó)家最常見(jiàn)的實(shí)體癌類(lèi)型之一。早期發(fā)現(xiàn)和精準(zhǔn)治療是改善結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。目前早期結(jié)腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療包括手術(shù)切除原發(fā)性結(jié)腸腫瘤和區(qū)域淋巴結(jié)，以及經(jīng)過(guò)手術(shù)后被認(rèn)為仍有癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者進(jìn)行輔助化療[31]。目前CTC 在結(jié)腸癌診療中的應(yīng)用主要集中在癌癥診斷和病情進(jìn)展檢測(cè)。

4.1 應(yīng)用CTC 診斷結(jié)腸癌 目前，結(jié)腸癌的診斷主要依靠組織病理活檢及影像學(xué)檢查。然而，這兩種方法均是建立在腫瘤實(shí)體組織已經(jīng)較大的基礎(chǔ)上，無(wú)法做到真正的早期診斷。研究已經(jīng)表明CTC比影像學(xué)可見(jiàn)出現(xiàn)更早，因此可以用于癌癥的早期診斷。有研究表明結(jié)腸息肉患者和非轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者的CTC 計(jì)數(shù)存在顯著差異[32]。這些差異為疾病篩查和疑似惡性病變的診斷提供了潛力。2019 年一項(xiàng)臺(tái)灣前瞻性臨床研究使用CellMax 仿生平臺(tái)進(jìn)行早期CRC 篩查，對(duì)667 份樣本（235 名健康對(duì)照、120 例癌前病變患者和312 例Ⅰ～Ⅳ期結(jié)腸癌患者）進(jìn)行CTC 檢測(cè)，將CTC 檢測(cè)結(jié)果與結(jié)腸鏡檢查、活檢等常規(guī)臨床診斷方法的結(jié)果進(jìn)行比較，總體準(zhǔn)確率為86%[33]。該研究進(jìn)一步證明CTC 對(duì)結(jié)腸癌具有較大的診斷價(jià)值。

4.2 應(yīng)用CTC 檢測(cè)結(jié)腸癌進(jìn)展 經(jīng)過(guò)手術(shù)后被認(rèn)為仍有癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者需要進(jìn)行輔助化療。輔助化療的目標(biāo)是根除臨床上未發(fā)現(xiàn)的微小轉(zhuǎn)移性病灶從而到達(dá)治愈。然而，目前缺乏評(píng)估早期癌癥患者是否需要輔助化療的可靠評(píng)估指標(biāo)。在目前的臨床實(shí)踐中，患者選擇輔助化療是基于術(shù)后腫瘤的臨床病理學(xué)特征，但這不精確，會(huì)導(dǎo)致大量患者治療不足或過(guò)度治療。新興研究表明，CTC 是攜帶腫瘤特異性基因組或表觀基因組改變的游離細(xì)胞，可作為是否存在微小轉(zhuǎn)移性病灶的標(biāo)志物，并有助于對(duì)早期結(jié)腸癌患者進(jìn)行高精度的風(fēng)險(xiǎn)分層[34-35]。同時(shí)，研究報(bào)道，連續(xù)監(jiān)測(cè)CTC 可以提供有關(guān)結(jié)腸癌術(shù)后療效的有價(jià)值信息，并且能比影像學(xué)監(jiān)測(cè)方法更早地檢測(cè)到癌癥復(fù)發(fā)[25，36]。

CTC 的檢測(cè)和分析是研究全身腫瘤異質(zhì)性、促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療發(fā)展的新途徑。近年的研究使CTC 在結(jié)腸癌患者中的臨床應(yīng)用取得了重大進(jìn)展。CTC 不僅可以用于早期診斷，更重要的是可以在基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和功能水平上表征和監(jiān)測(cè)腫瘤異質(zhì)性的動(dòng)態(tài)變化。但是CTC 檢測(cè)的敏感性有限，這限制了它在指導(dǎo)輔助治療決策和腫瘤監(jiān)測(cè)方面的廣泛臨床應(yīng)用。CTC 在結(jié)腸癌中的應(yīng)用研究目前主要集中在早期診斷和檢測(cè)微小轉(zhuǎn)移病灶的潛力。CTC 在新輔助治療中評(píng)估治療反應(yīng)的能力是未來(lái)探索有前景的一個(gè)領(lǐng)域。