石詩影，巨曉軍，屠云潔，單艷菊，姬改革，劉一帆,2，章 明，束婧婷*

(1. 江蘇省家禽科學(xué)研究所/江蘇省家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225125；2. 江蘇省家禽科學(xué)研究所 科技創(chuàng)新有限公司，江蘇 揚(yáng)州 211412)

肌肉中的氧化型肌纖維(慢肌)含量越高、酵解型肌纖維(快肌)含量越低時(shí)，肌肉的主要品質(zhì)指標(biāo)趨好，如pH、肉色、系水力、肌內(nèi)脂肪和風(fēng)味物質(zhì)含量等[1-3]。而肌纖維的類型在動(dòng)物生長過程中并不是固定的，不同類型肌纖維之間的轉(zhuǎn)化十分常見。因此，骨骼肌肌纖維類型轉(zhuǎn)化規(guī)律是肉質(zhì)研究的關(guān)鍵切入點(diǎn)。解析骨骼肌肌纖維類型轉(zhuǎn)化機(jī)理并應(yīng)用于育種生產(chǎn)，對于加速優(yōu)質(zhì)肉雞品種培育、加快優(yōu)質(zhì)肉雞行業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展有著重要的理論和實(shí)踐意義。

microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們能夠在動(dòng)植物中廣泛參與基因表達(dá)調(diào)控，從而參與機(jī)體的細(xì)胞增殖、分化、凋亡、能量代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[4]。已經(jīng)證實(shí)許多miRNA在肌肉功能的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中大部分miRNA在各個(gè)組織中廣泛表達(dá)，少部分在肌肉中特異性表達(dá)，即myomiRs(muscle-specific miRNAs)[5]。miR-499是最新報(bào)道的myomiRs成員，在骨骼肌和心肌中特異性表達(dá)[6]。越來越多的研究表明，miR-499在骨骼肌肌纖維類型轉(zhuǎn)化過程發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Van Rooij等[7]報(bào)道m(xù)iR-499-5p敲除后小鼠比目魚肌的I型肌纖維數(shù)目明顯減少。Nachtigall等[8]在羅非魚的研究發(fā)現(xiàn)miR-499在骨骼肌慢肌纖維中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于快肌。SOX6已經(jīng)被證實(shí)是miR-499的關(guān)鍵靶基因。在心肌中，miR-499能通過抑制SOX6的表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化[9]。

在前期的高通量測序表明，miR-499在雞快肌和慢肌組織中差異表達(dá)顯著，推測miR-499在雞骨骼肌肌纖維類型轉(zhuǎn)化也具有重要的作用[10]。為了進(jìn)一步研究miR-499在雞骨骼肌肌纖維類型調(diào)控的功能，本研究通過對miR-499進(jìn)行序列進(jìn)化分析、靶基因預(yù)測、鑒定和表達(dá)量分析，旨在為進(jìn)一步揭示miR-499在骨骼肌肌纖維類型轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)采用的清遠(yuǎn)麻雞來自廣東天農(nóng)食品集團(tuán)股份有限公司。種蛋孵化后，在同樣的環(huán)境和飼養(yǎng)條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，全程自由采食和飲水。

1.1.2 主要試劑和儀器 TRNzol總RNA提取試劑(DP405)、熒光定量預(yù)混試劑 (SYBR Green) (FP215)，F(xiàn)astKing cDNA第一鏈合成試劑盒( KR116)購自TIANGEN公司；DNA Marker DL2000為TaKaRa公司產(chǎn)品。9700PCR儀和Max3000P熒光定量PCR儀(愛普拜斯)；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 2500)；紫外分光光度計(jì)(Nano Drop One，Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 獲取miR-499序列和基因組位置信息 從miRBase數(shù)據(jù)庫22.1(http://www.mirbase.org/)中下載所有脊椎動(dòng)物的miR-499前體序列和成熟序列。利用BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，以10種典型脊椎動(dòng)物的miRNA-499基因家族前體序列作為查詢序列(Query sequence)，在基因組中進(jìn)行比對，以確定miR-499的基因組位置以及來源基因。

1.2.2 多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 利用ClustalX 1.83軟件對所有的miR-499成熟序列進(jìn)行多序列比對(Multiple sequences alignment)。以前體序列為輸入序列，通過MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，選擇基于距離參數(shù)的鄰接法(Neighbor-joining，NJ)，并自舉檢驗(yàn)1000次。

1.2.3 靶基因預(yù)測 選擇在線軟件targetscan(http://www.targetscan.org/)和miRDB(http://mirdb.org/)分別預(yù)測雞miR-499-5p和miR-499-3p的靶基因，取兩種工具輸出結(jié)果的交集作為候選靶基因。

1.2.4 靶基因功能分析 利用DAVID在線工具(https://david.ncifcrf.gov/)對預(yù)測到的靶基因進(jìn)行GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，采用超幾何分布檢驗(yàn)方法計(jì)算各個(gè)條目或通路中差異基因富集的顯著性。

1.2.5 miR-499-5p和SOX6在雞骨骼肌中的表達(dá)檢測 選擇體重接近的20周齡清遠(yuǎn)麻雞母雞6只，放血屠宰后采集胸大肌(pectoralis major)和腿縫匠肌(sartorius)組織。肌肉總RNA提取用Trizol法，RNA樣品檢測合格后，取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR),使用的引物見表1。反應(yīng)體系如下：2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL( 10 μmol/L)， cDNA模板2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加dd H2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件為： 95 ℃ 2 min； 95 ℃ 20 s， 60 ℃ 20 s， 72 ℃ 60 s， 共 40 個(gè)循環(huán)。 每次反應(yīng)均設(shè)空白樣品為陰性對照，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。

表1 試驗(yàn)使用的引物序列Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR

1.2.6 miR-499-5p和SOX6靶向調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證 通過PCR擴(kuò)增獲得具有miR-499-5p結(jié)合位點(diǎn)的SOX6 3'UTR序列，并通過重疊PCR獲得結(jié)合位點(diǎn)突變后的3'UTR序列。經(jīng)測序驗(yàn)證后將兩段序列分別克隆至pMIR-RB-ReporterTM雙熒光素酶報(bào)告載體。將野生型和突變型載體分別與miR-499-5p mimic或mimic NC共轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，參照Dual Luciferase Reporter Assay System試劑盒的說明書步驟進(jìn)行操作，并使用酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光素酶活性的測定。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 表達(dá)量結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行處理。采用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，組間差異顯著性用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-samplesttest)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-499基因家族及其在基因組中的定位

在miRBase22.1數(shù)據(jù)庫中共查詢到43種脊椎動(dòng)物的49條miRNA-499基因家族前體序列，其中大部分脊椎動(dòng)物例如小鼠、山羊、雞等具有miR-499基因家族的1個(gè)成員；棉耳狨猴、人、斑點(diǎn)叉尾鮰具有miR-499基因家族的 2 個(gè)成員(miR-499a、miR-499b)；大西洋鮭具有miR-499基因家族的 4 個(gè)成員(miR-499a、miR-499b-1、miR-499b-2、miR-499b-3)。

在數(shù)據(jù)庫中共查詢到43種脊椎動(dòng)物75條miRNA-499基因家族成熟序列，其中大部分脊椎動(dòng)物例如小鼠、山羊、雞等具有miR-499基因家族的兩個(gè)成熟序列(miR-499-5p，miR-499-3p)；慈綢魚、牛、鯉魚、犬、大猩猩、斑點(diǎn)叉尾鮰、大斑馬、鯛魚、青鳉、尼羅羅非魚、奈里樸麗魚、黑猩猩、樹鼩、熱帶爪蟾、大棕蝠只有miR-499基因家族的一個(gè)成熟序列；人、大西洋鮭具有miR-499基因家族的4個(gè)成熟序列。

10種典型脊椎動(dòng)物的miRNA-499在基因組的位置見表2。miR-499均定位在內(nèi)含子區(qū)域，關(guān)聯(lián)基因?yàn)镸YH7B。

表2 miR-499基因家族成員在基因組的分布特征Table 2 Genomic location of miR-499 gene family

2.2 miR-499基因家族序列同源性分析

利用ClustalX軟件對miR-499基因家族43種物種的成熟序列進(jìn)行多序列比對分析(圖1) ,結(jié)果顯示，miR-499基因成熟序列具有較高的同源性。miR-499-5p保守堿基數(shù)為19個(gè)，miR-499-3p保守堿基數(shù)為14個(gè)，說明保守性較高。miRNA的seed序列(5'端第 2-8 個(gè)核苷酸)負(fù)責(zé)在與基因3'UTR特異性結(jié)合，對于miRNA功能的行使十分重要，因此這段序列通常十分保守，本研究亦證實(shí)了這一點(diǎn)。miR-499的部分位點(diǎn)在不同物種發(fā)生了核苷酸突變和缺失，導(dǎo)致miR-499基因家族成員間的成熟序列長度產(chǎn)生變化。

圖1 miR-499基因家族的成熟序列多重比對Fig. 1 Multiple sequences alignment of mature sequence among the miR-499 family

目前，部分miR-499成熟序列并未區(qū)分其來源于前體序列的5p或3p端。經(jīng)過序列比對，其中大棕蝠、斑點(diǎn)叉尾鮰、犬、牛、鯛魚、奈里樸麗魚、大斑馬、慈綢魚、尼羅羅非魚、鯉魚、熱帶爪蟾的miR-499成熟序列與miR-499-5p同源性較高，提示其來源于成熟序列的5p端；黑猩猩、青鳉的miR-499的成熟序列來源于3p端。

2.3 miR-499基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA7.0軟件對43種脊椎動(dòng)物的49條miRNA-499基因家族前體序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由圖2可知，進(jìn)化樹首先被分割為2大支：第1大支是人和普通狨miR-499b，其余前體序列為第2支；第2大支又繼續(xù)分為3支：第1分支主要聚集的是哺乳類動(dòng)物；第2分支主要聚集的是魚類；第3分支主要是爬行類動(dòng)物和鳥類，爬行類聚集在一起，鳥類聚集在一起。進(jìn)化樹分支劃分符合物種分類規(guī)律，由此可以猜測，各物種的miRNA-499基因家族在進(jìn)化過程中符合物種進(jìn)化演變的規(guī)律。

圖2 利用NJ法構(gòu)建脊椎動(dòng)物miR-499前體序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of the miR-499 family constructed based on Neighbor-joining method

2.4 雞miR-499靶基因預(yù)測及功能分析

利用targetscan和miRDB在線工具對雞miR-499-5p和miR-499-3p的靶基因進(jìn)行預(yù)測，取兩者預(yù)測結(jié)果的交集，分別獲得78個(gè)和245個(gè)靶基因。利用DAVID在線工具對靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析(表3&表4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-499-5p的靶基因顯著富集于細(xì)胞應(yīng)對轉(zhuǎn)化生長因子刺激，絲氨酸/蘇氨酸激酶活性調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子活性和細(xì)胞內(nèi)吞信號通路等(P<0.05)。miR-499-3p的靶基因顯著富集于組織發(fā)育，cAMP信號，ARF蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，MAPK信號，泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用和細(xì)胞內(nèi)吞信號通路等(P<0.05)。

表3 雞miR-499-5p靶基因顯著富集的GO條目和信號通路Table 3 GO and pathway enrichment of target genes for chicken miR-499-5p

表4 雞miR-499-3p靶基因顯著富集的GO條目和信號通路Table 4 GO and pathway enrichment of target genes for chicken miR-499-3p

2.5 miR-499和SOX6表達(dá)分析

為驗(yàn)證雞miR-499-5p與預(yù)測靶基因SOX6的表達(dá)關(guān)系，本研究選擇快肌為主的胸大肌和慢肌為主的腿縫匠肌，檢測了miR-499-5p和SOX6在兩種肌肉中的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-499-5p的表達(dá)量在縫匠肌中極顯著高于胸大肌(P<0.01)，SOX6在縫匠肌中表達(dá)水平極顯著低于胸大肌(P<0.01)，且兩者的表達(dá)呈強(qiáng)的負(fù)相關(guān)(r=-0.92)。

圖3 不同雞骨骼肌組織中miR-499-5p和SOX6的表達(dá)量**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同F(xiàn)ig.3 miR-499-5p and SOX6 expression level from different skeletal muscle tissues** shows highly significant difference (P<0.01). The same below

2.6 miR-499和SOX6靶向結(jié)合關(guān)系分析

為進(jìn)一步鑒定miR-499的靶基因，將SOX6野生型、突變型3'UTR與miR-499-5p mimic和mimic NC共轉(zhuǎn)染后，檢測雙熒光素酶活性。如圖4所示，當(dāng)共轉(zhuǎn)染野生型SOX6時(shí)，與mimic NC組相比，miR-499-5p mimic組熒光素酶活性受到極顯著抑制(P<0.01)；而共轉(zhuǎn)染突變型SOX6時(shí)，mimic NC組和miR-499-5p mimic組差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，SOX6是miR-499-5p的靶基因。

圖4 雙熒光素酶活性檢測結(jié)果Fig.4 Dual luciferase activity detection

3 討 論

miRNA作為調(diào)控基因表達(dá)的重要內(nèi)源性非編碼小分子RNA，幾乎參與調(diào)節(jié)所有的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞生長和分化、肌肉發(fā)育和脂肪代謝等。miRNA主要通過與靶基因mRNA 3'UTR不完全互補(bǔ)配對，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的作用。早期報(bào)道的一些miRNA基因家族，如miR-23[11]、miR-223[12]，在物種間具有高度的保守性，與非保守的miRNA相比具有更為明確的生物學(xué)功能，因此更值得進(jìn)行深入研究。

miR-499屬于肌肉特異性表達(dá)miRNA，在小鼠等物種研究中表明其在肌肉發(fā)育和分化中發(fā)揮著廣泛的功能，但在雞上缺少相關(guān)研究。本研究發(fā)現(xiàn)miR-499廣泛存在于大多數(shù)脊椎動(dòng)物之中，且在各個(gè)物種中序列高度保守。這種保守性尤其是種子區(qū)的保守性，預(yù)示其在不同物種間將具有類似的功能，這為借鑒相關(guān)研究理解雞miR-499的生物學(xué)功能提供了便利。目前發(fā)現(xiàn)人miR-499由肌球蛋白重鏈7B(MYH7B)的內(nèi)含子編碼，主要在心肌和骨骼肌組織表達(dá)，并且與MYH7B基因呈現(xiàn)協(xié)同表達(dá)的趨勢[6]。本研究也發(fā)現(xiàn)在10種脊椎動(dòng)物中miR-499均由MYH7B內(nèi)含子編碼。同時(shí)，進(jìn)化樹結(jié)果顯示miR-499序列進(jìn)化特征符合物種進(jìn)化演變規(guī)律，提示miR-499在生物遷移和進(jìn)化過程中具有重要作用。

靶基因預(yù)測是探索miRNA功能的有效手段。本研究通過對雞miR-499的兩種成熟體進(jìn)行靶基因預(yù)測，并進(jìn)行GO和KEGG分析。結(jié)果顯示miR-499-5p和miR-499-3p的靶基因顯著富集于肌纖維類型相關(guān)的GO條目和信號通路，包括絲氨酸/蘇氨酸激酶活性調(diào)控[13]、cAMP信號[14]和MAPK通路[15]。Van Rooij等[7]報(bào)道敲除miR-499-5p后，小鼠肌纖維出現(xiàn)明顯的慢肌向快肌的轉(zhuǎn)變。李志雄等[16]報(bào)道了在肉雞腓腸肌注射miR-499-5p后，肌肉差異基因主要參與絲氨酸/蘇氨酸激酶活性調(diào)控和MAPK通路。本研究的表達(dá)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-499在慢肌中的表達(dá)量顯著高于快肌。綜合以上結(jié)果，推測miR-499可能促進(jìn)雞骨骼肌慢肌纖維的形成，抑制快肌纖維的形成。

SOX6是miR-499最重要的靶基因之一。在心肌中，miR-499能夠靶向SOX6抑制其表達(dá)，從而參與細(xì)胞損傷修復(fù)和凋亡調(diào)節(jié)[17-18]。骨骼肌方面，研究人員已經(jīng)在豬和斑馬魚上證實(shí)了miR-499能夠通過調(diào)控SOX6表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控肌纖維類型的轉(zhuǎn)化[8,19]。張梓豪等[20]通過表達(dá)試驗(yàn)初步證實(shí)了SOX6基因具有促進(jìn)雞骨骼肌快肌纖維形成的作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-499-5p和SOX6在雞肌肉組織中呈現(xiàn)相反的表達(dá)模式。進(jìn)一步通過雙熒光素酶試驗(yàn)驗(yàn)證了miR-499-5p和SOX6的靶向關(guān)系，提示SOX6在雞上也能夠被miR-499抑制。

4 結(jié) 論

通過對miR-499基因家族分子進(jìn)化特征進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)miR-499序列保守性高，來源基本一致，提示雞miR-499與其他動(dòng)物具有類似的功能。通過靶基因預(yù)測驗(yàn)證和表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，miR-499可能在雞骨骼肌肌纖維類型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，SOX6是其重要靶基因之一。