王然，龔維，郭曉璐，鄭寒，胡蔣寧

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034）

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性將影響其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[1]。大豆分離蛋白（SPI）作為一種低變性和脫脂豆粕的植物蛋白，由于其可食用性、發(fā)泡性、凝膠化等特性已廣泛用于食品工業(yè)中[2]。SPI 主要含有大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，具有豐富且平衡的極性和非極性電荷[3]。然而，以往的研究表明，由于其結(jié)構(gòu)和不穩(wěn)定的界面性能，天然SPI 在食品中的應(yīng)用度仍然不理想[4]。SPI 的改性是改善其功能特性的常見且有效的方法。據(jù)報道，許多化學(xué)方法，包括羧甲基化[5]、脫乙?；痆6]和酸水解[7]都可以改性SPI。盡管一些化學(xué)修飾方法可以極大地改善SPI 的功能，但改性過程較為復(fù)雜、低效且設(shè)備較為昂貴[8]。此外，化學(xué)試劑殘留也是蛋白化學(xué)改性的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。因此，有必要探索一種無溶劑、高效的SPI 改性方法。

等離子體是在高壓放電環(huán)境中產(chǎn)生的電離的氣體，通常被認為是除了固體、液體和氣體之外的第四種狀態(tài)。由于離子、電子、紫外光子和反應(yīng)性中性物質(zhì)（自由基和受激原子分子）的存在，可以破壞物質(zhì)表面的共價鍵，引發(fā)各種化學(xué)反應(yīng)。根據(jù)能量供應(yīng)的類型和傳遞到等離子體的能量大小，等離子體可分為高溫等離子體（TP）和低溫等離子體（LTP）。LTP 進一步細分為熱等離子體和冷等離子體。在熱等離子體中，電子和氣體分子等物質(zhì)之間存在局部熱力學(xué)平衡。相比之下，冷等離子體中不存在熱力學(xué)平衡，電子的溫度約為104 K，而離子和中性粒子的溫度通常接近室溫[9]。研究表明，冷等離子體可用于修飾食品表面結(jié)構(gòu)并改變其物理化學(xué)性質(zhì)，且處理過程無溶劑、高效環(huán)保[10]。冷等離子體在電離、溫度和密度方面具有較大的操作范圍，因此在提供干燥、可擴展、無污染、快速、一步的表面改性方法方面具有巨大潛力[11]。據(jù)報道，冷等離子體處理蛋白質(zhì)，可以改變蛋白質(zhì)的初始結(jié)構(gòu)和殘基組成，從而暴露埋藏的疏水基團，使其更加活躍，并在表面上充分展開[12]。蛋白質(zhì)的界面性能發(fā)生顯著變化，原因在于冷等離子體中的電子可以與氨基酸中的富電子基團發(fā)生反應(yīng)，從而改變它們的親水性[13]。冷等離子體處理也是提高蛋白質(zhì)功能和活性的有效策略[14,15]。基于上述分析，我們推測冷等離子體處理可以用于SPI 改性，有利于SPI 的界面性能改善[16]。

本研究選用冷等離子體技術(shù)對SPI 進行改性研究，示意圖如圖1 所示。對冷等離子體處理后SPI 的熒光光譜、二級結(jié)構(gòu)、溶解度、表面疏水性、游離巰基（-SH）基團、持水能力（WHC）、持油能力（FHC）、粒度、表面變化、表面張力、界面張力和微觀結(jié)構(gòu)（SEM，AFM）進行了表征。

圖1 冷等離子體改變SPI 特性的主要現(xiàn)象示意圖Fig.1 Schematic representation of the main phenomena that the cold plasma changing the character of SPI

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大豆分離蛋白（SPI，純度＞90.21%），中國大連博諾生化試劑有限公司。所有其他試劑和化學(xué)品均為分析級。所有溶液均用去離子水制備。SCIENTZ-10 ND-真空冷凍干燥機，寧波新芝生物有限公司；等離子體機，蘇州歐普斯等離子體技術(shù)；F-2700 熒光分光光度計，日本Hitachi 公司；J-1500 圓二光譜儀，日本Hitachi 公司；Lambda 35 紫外分光光度計，美國Perkin Elmer 公司；一體式動靜態(tài)同步激光光散射，瑞士LSI公司；DT-1202 超聲粒度及Zeta 電位分析儀，美國分散科技公司；Tecan Infinite M200 多功能酶標儀，瑞士Tecan 公司；DSA 25 接觸角測量儀，德國KRUSS 公司；SB800DT 超聲波清洗機，寧波新芝生物有限公司；SU 8010 掃描電子顯微鏡，日本Hitachi 公司；原子力顯微鏡AFM5500，日本Hitachi 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 懸浮液的制備

將制備好的SPI 分散在PBS（10 mmol/L，pH 值7.0）中，室溫下攪拌5 h，制備濃度為10 mg/mL 的SPI 懸浮液。將疊氮鈉（0.02%，m/V）作為抗菌劑加入到分散液中，隨后，在4 ℃下保存過夜，以確保完全水合。

1.2.2 冷等離子體處理

將約5 mL 的SPI 溶液均勻鋪于等離子體石英載體平臺上，用等離子體機進行處理。其中等離子體源由兩個直徑為15 cm 的鋁盤電極組成，覆蓋在兩個聚丙烯電介質(zhì)（2 mm 厚）上，將裝有樣品的石英載體平臺置于其間。處理參數(shù)為：功率50 W，時間分別為0 s（對照）、10 s、30 s、60 s 和120 s。處理后，樣品保存在4 ℃冰箱，直至進一步分析。

1.2.3 熒光光譜的測定

按冷等離子體處理時間（0 s、10 s、30 s、60 s 和120 s）將濃度為0.2 mg/mL 的SPI 溶液分為五組，記錄熒光光譜。激發(fā)波長：280 nm，發(fā)射波長：300～500 nm。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為5 nm[17]。

1.2.4 圓二（CD）光譜的測定

進行SPI 溶液的CD 光譜測定。光譜記錄的波長范圍為190～260 nm，掃描速度為20 nm/min，采用0.2 nm間隔，進行三次掃描。通過減去磷酸鹽緩沖溶液的光譜進行校正。

1.2.5 溶解度的測定

將2 mg/mL SPI 樣品分散在PBS 中，在8 354 r/min離心，20 ℃下離心20 min，以牛血清白蛋白（BSA）為標準，用BCA 法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量。蛋白溶解度（%）為離心前后蛋白濃度之比。

1.2.6 表面疏水性（H0）的測定

用1-苯胺基-8-萘磺酸鹽（ANS）作為熒光探針測定H0。將1 mg/mL SPI 樣品在4 ℃下8 354 r/min 離心15 min。測定上清液中的蛋白濃度后，用相同的緩沖液連續(xù)稀釋各上清液至所需濃度。然后分別從每個稀釋的分散液中取4 mL，并加入40 μL 的8.0 mmol/L ANS 溶液。測量熒光強度（FI），激發(fā)波長：390 nm，發(fā)射波長：470 nm。H0為FI 與蛋白濃度（mg/mL）的初始斜率。

1.2.7 游離巰基（-SH）的測定

游離-SH 含量按照Yan 等[18]先前描述的方法進行測定，并做了一些修改。用Tris-Gly 緩沖液（0.086 mol/L Tris-HCl，0.09 mol/L Gly 和4 mmol/L EDTA，pH 值8.0）將每個樣品等份稀釋到蛋白濃度為0.2%。然后加入0.08 mL 濃度為4 mg/mL 的DTNB 溶液，渦旋混合（除空白）。并將混合后的溶液立即在室溫黑暗環(huán)境下靜置30 min。用紫外-可見分光光度計在412 nm 處測量上清液的吸光度。

式中：

Q——游離巰基（-SH）含量，μmol/g；

A412——樣品在412 nm 處的吸光度；

D——稀釋因子；

C——蛋白濃度，g/L。

1.2.8 持水力（WHC）和持油力（FHC）的測定

取1.0 g 樣品于離心管，加入10 mL 蒸餾水，渦旋混合。室溫下放置30 min 后以3 000 r/min 離心20 min。計算持水力（Water-holdingcapacity，WHC）的公式為：

式中：

H——持水力，g/g；

W1——離心前的質(zhì)量，g；

W2——離心后的質(zhì)量，g。

持油力（Fat-holdingcapacity，F(xiàn)HC）的測定同WHC稍作修改。將樣品（1.0 g）放入離心管中，加入5 mL大豆油，充分混合。室溫下放置30 min 后以3 000 r/min離心20 min。FHC 的計算公式為：

式中：

F——持油力，g/g；

W1——離心前的重量，g；

W2——離心后的重量，g。

1.2.9 粒徑和ζ-電位的測定

動態(tài)光散射（Dynamiclightscattering，DLS）方法評估SPI 溶液的粒徑。將SPI 溶液稀釋后用0.45 μm 孔徑的過濾器過濾，比例約為1:1 000（V/V）。用超聲粒度儀在25 ℃下測量SPI 溶液的ζ-電位。

1.2.10 動態(tài)界面張力的測定

利用光學(xué)接觸角儀在25 ℃下記錄表面壓力和表面擴張參數(shù)的時間變化，監(jiān)測SPI 溶液在氣水界面和油水界面的動態(tài)表面特性。將一滴SPI 溶液（6 μL）送入光學(xué)玻璃中，靜置90 min，使其在空氣-水表面實現(xiàn)吸附。同樣，將一滴SPI 溶液（35 μL）滴入裝有純化油的光學(xué)玻璃比色皿中，靜置180 min，實現(xiàn)油水表面的吸附。根據(jù)拉普拉斯基本方程計算表面張力和界面張力（σ）。實驗所用油為大豆油，由于大豆油含有表面活性劑和其他雜質(zhì)，因此在使用前對大豆油進行了凈化。具體操作如下：將4 g Florisil 分子篩加入100 mL 大豆油中攪拌4 h，然后以10 000 r/min 離心20 min，去除沉淀雜質(zhì)，并重復(fù)離心操作三次，直到純水在油相上的界面張力在30 min 內(nèi)沒有顯著變化（通過滴狀分析法檢測）。

1.2.11 掃描電子顯微鏡（SEM）分析

利用冷場掃描電鏡分析了樣品的微觀結(jié)構(gòu)。簡單地說，將樣品放入鋁樣品盤中，并立即在液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)移到低溫制備室中，用低溫刀切割樣品。新制樣品表面在-90 ℃下升華并進行蝕刻，并將水移動到幾微米的深度以揭示表面下方的結(jié)構(gòu)。升華后，樣品噴金并轉(zhuǎn)移到SEM 室。在-175 ℃和10 kV 加速電壓下進行分析。

1.2.12 原子力顯微鏡（AFM）分析

通過原子力顯微鏡測量SPI 樣品的形態(tài)。將SPI 樣品（0.02 mg/mL）滴到云母片上，在真空下干燥，并進行成像。通過Selector App 軟件對樣品進行可視化處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Origin 8.5 軟件整理數(shù)據(jù)和作圖。采用SPSS 16.0 軟件對得到的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光測量

熒光光譜可用于預(yù)測蛋白質(zhì)在溶劑中的折疊及解折疊。含有發(fā)色團氨基酸如色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸殘基（Phe）的蛋白質(zhì)可以表現(xiàn)出較強的內(nèi)在熒光[19]。不同冷等離子體處理時間（0、10、30、60和120 s）的SPI 熒光光譜如圖2 所示。

圖2 不同冷等離子體處理時間對SPI 熒光光譜的影響Fig.2 Effect of different cold plasma treatment duration on fluorescence spectra of SPI

由于SPI 的所有λmax＞330 nm，因此SPI 中的Trp組分暴露于極性環(huán)境中。在沒有進行冷等離子體處理的情況下，SPI（0.25 mg/mL）在磷酸鹽緩沖液中在347.5 nm左右出現(xiàn)的熒光峰，隨著冷等離子體處理時間的增加，SPI 熒光強度下降，這表明冷等離子體處理對蛋白質(zhì)的天然熒光有淬滅作用[20]。同時，觀察到輕微的藍移（從347.5 nm 到345.5 nm），這表明SPI 的環(huán)境從親水性到相對疏水性更強[21]。這可能是冷等離子體可以破壞蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水相互作用，并將疏水的氨基殘基帶到表面。對于經(jīng)過冷等離子體處理的SPI，其原本埋藏于內(nèi)部的疏水殘基和巰基基團的暴露量可能會增加，有利于SPI 在油水界面的展開，從而提高其表面活性[22]。

2.2 二級結(jié)構(gòu)

表1為冷等離子體處理后圓二光譜表征的二級結(jié)構(gòu)結(jié)果。隨著冷等離子體處理時間的增加，SPI 樣品的幾種二級結(jié)構(gòu)成分發(fā)生了顯著變化（p＜0.05）。與未處理SPI 相比，經(jīng)冷等離子體處理60 s 后，SPI 的α-螺旋含量從31.93%下降到23.56%，而β-折疊含量略有下降，從32.83%下降到27.13%，然后又有所上升。SPI 的無規(guī)卷曲含量隨著處理時間的增加而增加，在60 s 時達到最大值，然后減少。這些二級結(jié)構(gòu)的變化表明，冷等離子體處理能夠誘導(dǎo)蛋白去折疊，結(jié)構(gòu)更加伸展，展開為更靈活的結(jié)構(gòu)，有利于SPI 在界面上的吸附和重組[23]。當處理時間進一步延長時，蛋白質(zhì)分子可能發(fā)生交聯(lián)。

表1 冷等離子體處理時間對SPI 二級結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effect of cold plasma treatment duration on the secondary structures of SPI

2.3 蛋白質(zhì)的溶解度和表面疏水性

溶解度是評價蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的重要指標，可以用來評價蛋白質(zhì)的變性和聚集性。在食品工業(yè)中，蛋白質(zhì)的溶解度與蛋白質(zhì)的乳化、凝膠化、發(fā)泡和打發(fā)性能的形成有很大關(guān)系[24]。圖3a 為SPI 在冷等離子體不同處理時間（0、10、30、60 和120 s）下的溶解度?？梢钥闯觯琒PI 的溶解度隨著處理時間的增加呈先升高后降低的趨勢。當處理時間為30 s 時，SPI 的溶解度達到最大值（46.06%）。SPI 溶解度增加可能是由于等離子放電產(chǎn)生的高能粒子的刻蝕作用使蛋白比表面積增加，活性位點暴露，大量的親水基團被激發(fā)，在蛋白表面形成水膜，SPI 的溶解度增加[25]。隨著處理時間的延長，SPI 的溶解度下降，這可能是由于持續(xù)放電引起蛋白之間的交聯(lián)，表面活性位點減少，蛋白溶解度降低[26]。此外，蛋白質(zhì)膨脹后，疏水基團暴露的比例也增加，一些可溶性蛋白經(jīng)過長時間處理后可能會轉(zhuǎn)化為不溶性的蛋白質(zhì)聚集體[27]。

蛋白質(zhì)表面的疏水性是衡量蛋白質(zhì)分子表面與極性水環(huán)境接觸的疏水基團數(shù)目的一個指標，它與蛋白質(zhì)功能性質(zhì)密切相關(guān)[28]。冷等離子體處理對SPI 的H0的影響如圖3b 所示。觀察到隨著冷等離子體處理時間的增加，SPI 的H0從2 330.9 增加到3 680.7。其原因可能是由于摩擦力、碰撞力和剪切力的共同作用，改變了SPI的三級結(jié)構(gòu)，使分子內(nèi)部的疏水基團暴露出來。蛋白質(zhì)疏水性的提高，有利于蛋白質(zhì)快速吸附于油水界面，從而改善蛋白質(zhì)的界面性能。隨著時間的進一步增加，SPI可能發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，暴露了的疏水基團的數(shù)量減少導(dǎo)致SPI 的H0降低。Hua 等[29]發(fā)現(xiàn)ANS-H0與大豆蛋白的溶解度成反比。相反，Wagner 等[30]研究了溶解度與H0的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)H0越大，溶解度越大。這些相互矛盾的觀察結(jié)果可能是由于蛋白質(zhì)分子表面疏水基團之間分子間相互作用的程度不同造成的[31]。而在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)大豆蛋白的溶解度和表面疏水性在處理早期呈正相關(guān)，當處理時間大于60 s 時呈負相關(guān)。

圖3 不同冷等離子體處理時間對SPI 蛋白溶解度（a）和表面疏水性（b）的影響Fig.3 Effect of different cold plasma treatment duration on protein solubility (a) and surface hydrophobicity (b) of SPI

2.4 游離巰基含量

巰基的含量的變化可以揭示蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，對蛋白質(zhì)的功能特性起著重要作用。從圖4 可以看出，處理后的SPI 游離巰基含量明顯增加。此外，隨著冷等離子體處理時間的增加，巰基基團含量也有所增加，從9.77 μmol/g 蛋白（未處理SPI）增加到17.76 μmol/g蛋白（50 W，60 s）。巰基含量的增加可能是由于冷等離子體處理可以破壞二硫鍵，二硫鍵的減少會導(dǎo)致巰基的形成，并且?guī)€基暴露在SPI 分子的表面[32]。

圖4 不同冷等離子體處理時間對SPI 巰基含量的影響Fig.4 Changes in free sulfhydryl content of SPI with different cold plasma treatment duration

2.5 持水能力（WHC）和持油能力（FHC）

蛋白質(zhì)的WHC 和FHC 在食品的質(zhì)地中起著重要的作用，尤其是肉糜、乳制品和烘焙面團。如圖5 所示，SPI 經(jīng)冷等離子體處理后的WHC 和FHC 值均高于未處理的SPI，且隨著處理時間的增加而增加。這可能是由于冷等離子體處理導(dǎo)致蛋白表面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使其結(jié)合水的能力增強。與此同時，等離子處理也會使疏水基團（圖3b）暴露，增強油和蛋白之間的作用力，從而提高FHC。在處理60 s 時，SPI 的WHC達到最大值（7.05 g/g 蛋白），而在120 s 時，F(xiàn)HC 達到最大值（2.65 g/g 蛋白）。已有研究報道，蛋白質(zhì)的FHC與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，特別是非極性側(cè)鏈基團、分子大小、柔韌性和變性程度[33]。隨著蛋白質(zhì)表面積的增加，可以吸收更多的油脂，有利于SPI 在乳液方面的應(yīng)用。

圖5 不同冷等離子體處理時間對SPI 持水力和持油力的影響Fig.5 Changes in WHC and FHC of SPI with different cold plasma treatment duration

2.6 ζ-電位和粒徑大小

蛋白質(zhì)顆粒表面的有效電荷主要取決于蛋白質(zhì)表面的負電荷，溶液體系的穩(wěn)定性可以通過絕對ζ-電位的值來衡量[34]。本研究中檢測的所有樣品的ζ-電位均為負值（圖6a），這表明冷等離子體處理的SPI 含有更多帶負電荷的氨基酸。結(jié)果表明，前60 s 的處理可以增加蛋白質(zhì)表面的負電荷和粒子間的靜電斥力，打破蛋白粒子的聚集，從而使蛋白分散體系的穩(wěn)定性更好。此外，冷等離子體處理通過蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化（表1）導(dǎo)致一些先前被掩埋的氨基酸暴露，冷等離子體化學(xué)反應(yīng)物氧化氨基酸殘基會將它們轉(zhuǎn)化為帶負電荷的副產(chǎn)物，導(dǎo)致ζ-電位有所降低。冷等離子體處理樣本的ζ-電位值之間的差異也可能歸因于結(jié)構(gòu)變化對蛋白質(zhì)表面可用的帶正電/負電氨基酸殘基比率的影響。隨著處理時間的進一步增加，ζ-電位絕對值有所降低，可能是由于蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)聚集所致。蛋白質(zhì)表面有效電荷對界面性能非常重要，也會影響蛋白質(zhì)在水相中的溶解度[35]。因此，冷等離子體處理可用作增加蛋白質(zhì)表面電荷的有效方法，從而通過增加液滴之間的靜電排斥力來改善乳液的穩(wěn)定性[36]。冷等離子體處理對粒徑分布的影響見圖6b。所有樣品均表現(xiàn)出單峰分布曲線，但峰的大小和位置隨處理時間而變化。當?shù)鞍诐舛葹?0 mg/mL 時，天然SPI 樣品的粒徑范圍為10 nm～100 nm。隨著冷等離子體處理時間的增加，粒徑的分布范圍減小，粒徑大小更為均勻。同時，經(jīng)處理后，較大尺寸的蛋白樣品顆粒消失，說明冷等離子體處理改變了SPI 的結(jié)構(gòu)，形成了較為均勻的分散體。但仍有較寬的粒徑分布范圍，部分粒徑增大可能是因為處理過程中蛋白質(zhì)發(fā)生了聚集，而部分粒徑減小，這可能是由于冷等離子體處理過程中蛋白質(zhì)肽鏈斷裂。

圖6 不同冷等離子體處理時間對SPI ζ-電位（a）和粒徑（b）的影響Fig.6 Effect of different cold plasma treatment duration on the ζpotential (a) and size (b) of SPI

2.7 表面張力和界面張力分析

為闡明蛋白質(zhì)在氣-水表面和油-水界面的吸附行為，監(jiān)測了SPI 的表面張力和界面張力的時間演變。一般來說，蛋白質(zhì)分子靠近液滴表面，會降低液滴的表面張力和界面張力[37]。如圖7a 所示，未經(jīng)處理的SPI和經(jīng)過冷等離子體處理的SPI 都能在氣水界面被吸附，并顯著降低表面張力。其中，經(jīng)冷等離子體處理后的SPI 降低表面張力的能力遠高于未經(jīng)處理的SPI，并且在一定范圍內(nèi)，處理時間的增加導(dǎo)致表面張力下降更為明顯，這可能是由于蛋白質(zhì)的疏水面積增加（圖3a）所致。從圖7b 可以看出，與對照組相比，冷等離子體處理后蛋白的油水界面張力初始值降低，說明冷等離子體處理可以改善SPI 的界面性能。一般來說，蛋白質(zhì)分子降低相鄰液體界面張力的能力受到蛋白質(zhì)的物理化學(xué)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響。因此，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的任何變化都會改變蛋白質(zhì)在界面上的吸附速率及其界面性能。柔性結(jié)構(gòu)的存在和二硫鍵數(shù)量的減少會增加蛋白質(zhì)在界面上的吸附[38]。之前的研究結(jié)果證明經(jīng)過冷等離子體處理的SPI，其溶解度（圖3a）、疏水性（圖3b）和游離巰基（圖4）都會相對提高，這些因素有利于提高SPI 在界面上的吸附速率，從而界面張力降低。并且可以發(fā)現(xiàn)，在所有樣品中當處理時間為60 s 時兩相間張力最小，說明此條件下SPI 界面性能最好。

2.8 微觀結(jié)構(gòu)分析（SEM 和AFM）

用SEM 觀察冷等離子體處理對SPI 微觀結(jié)構(gòu)的影響。圖8a～8c 為不同SPI 在放大系數(shù)為1 000 倍時的一組SEM 圖像。可以觀察到，處理后的樣品比未處理的樣品A 有更大、更多樣的結(jié)構(gòu)。冷等離子體處理后的變化是由于SPI 分子展開以及表面疏水基團（圖3b）和游離巰基基團暴露量（圖4）的增加所致。以上結(jié)果表明，高碰撞、高摩擦和高剪切力的處理可能會改變SPI 聚集體的表面形貌，導(dǎo)致微觀結(jié)構(gòu)的變化，從而影響蛋白質(zhì)的粒徑大小和粒徑分布（圖6b）。通常情況下，分散體中較小的團聚物可能會導(dǎo)致較高的溶解度，盡管樣品在干燥狀態(tài)下經(jīng)過處理后聚集體較大，但分散狀態(tài)下較小[27]。與未處理樣品相比，經(jīng)冷等離子體處理后的SPI 分散體更小，粒徑分布范圍更窄（圖6b）。這些研究結(jié)果與SPI 蛋白在冷等離子體處理后溶解度的提高（圖3a）是一致的。

采用AFM 觀察冷等離子體處理對SPI 形態(tài)的影響。從圖8d～8g 的高度圖和相位圖可以看出，未處理的SPI 的表面呈現(xiàn)出帶有谷狀的粗糙表面，凹凸起伏較大。而在圖8g 中，經(jīng)冷等離子體處理的SPI 表面被蝕刻到一定程度，改變了表面的物理結(jié)構(gòu)，這可能是由于冷等離子體處理產(chǎn)生的高碰撞、摩擦和剪切力造成了SPI 聚集[39]。此外，隨著冷等離子體處理程度的增加，表面刻蝕程度增加[40]。

圖8 大豆分離蛋白經(jīng)冷等離子體處理不同時間的SEM 圖像（a～c，×1 000）及不同冷等離子體處理時間對SPI 的AFM 光譜的影響（d～g）Fig.8 SEM graphs (×1 000) of SPI powders exposed to cold plasma treatment duration (a～c) and effect of different cold plasma treatment duration on AFM spectra of SPI (d～g)

3 結(jié)論

本文提供了一種使用冷等離子體修飾大豆分離蛋白（SPI）結(jié)構(gòu)的策略，以拓展其功能，尤其是界面性能。冷等離子體處理可以有效地改變SPI 的二級結(jié)構(gòu)，降低α-螺旋比例（31.93%下降至23.56%），改變蛋白質(zhì)的三級構(gòu)象。溶解度曲線的差異表明，處理后SPI在分散體中的非共價相互作用發(fā)生了變化，在處理時間為30 s 時達到最大值為46.06%。冷等離子體處理后蛋白溶液的粒徑分布范圍逐漸減小，ζ-電位絕對值也發(fā)生了變化。SPI 的持水力（WHC）和持油力（FHC）都有顯著提高。這可能是由于其ζ-電位值、巰基（-SH）含量以及表面疏水性（H0）的變化所致，并且SPI 的界面性能在處理時間為60 s 時最優(yōu)異。通過形態(tài)學(xué)研究，我們證實冷等離子體處理的SPI 顯示出均勻的聚集狀態(tài)。綜上所述，冷等離子體具有無溶劑工藝、處理時間短、效率高的優(yōu)點，是未來蛋白質(zhì)修飾的潛在候選技術(shù)，以增強其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。