孫小晶，李丹丹 *，李瑩，修建華，王金華

1.河北科技大學食品與生物學院（石家莊 050000）；2.河北省山楂加工技術創(chuàng)新中心（承德 060000）

山楂是一種藥食同源食品，可以預防結腸炎[1]，也有保護心臟、作為抗氧化劑、抗炎和抗低血壓作用[2]，被認為有助于心血管系統(tǒng)的恢復[3]。因含有大量天然的具有治療特性的生物活性化合物，山楂在內的藥草是全球市場藥物的豐富來源[4]。山楂中黃酮類化合物包括黃酮及其黃酮醇類[5]，以及二氫黃酮和二氫黃酮醇類[6]，這些物質是以芹菜素和木犀草素為基本單位構成山楂的基本功能成分。山楂中的多糖可用于調節(jié)人體腸道治療疾病[7]。多糖研究表明，它是具有降脂、抗氧化、抗腫瘤和抗炎特性的活性成分[8]。維生素C又稱抗壞血酸，是一種水溶性有機化合物，雖然沒有游離羥基，但是其在堿性環(huán)境下很容易被氧化。人體中所需的維生素C大多數(shù)以水果和蔬菜提供，因此測定山楂中維生素C含量是營養(yǎng)分析的重要內容。關于山楂防治腫瘤、代用品，以及炮制、不良反應方面的研究已取得一定進展，尤其是山楂用于防老抗衰、防治腫瘤的研究方面。

試驗采用不同提取方法提取山楂功能性成分，分別用DPPH法、羥自由基清除法、ABTS自由基清除法測定不同提取物的抗氧化能力，并對它們的清除自由基能力進行比較，以此評價其抗氧化能力，對于尋找新型高效的抗氧化劑及進一步開發(fā)利用山楂資源有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂（產(chǎn)自河北省興隆縣，鐵金星品種，選擇大小均勻、成熟度一致、無機械損傷、無病蟲害的大果鮮果果實）。

偏磷酸[阿拉丁試劑（上海）有限公司]；高嶺土（天津市永大化學試劑開發(fā)中心）；硫酸銨（天津市化學試劑一廠）；交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex G-25）、交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex G-100）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），均來自上海寶曼生物科技有限公司；磷酸、濃硫酸、苯酚、硝酸鋁（天津市永大化學試劑有限公司）；乙二胺四乙酸（EDTA）、葡萄糖，均來自天津市百世化工有限公司；亞硝酸鈉、抗壞血酸（天津市大茂化學試劑廠）；氫氧化鈉（廊坊市金?；び邢薰荆?；無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司）。

1.2 儀器與設備

101-OAB型電熱鼓風干燥箱、DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；JYL-350料理機（山東九陽小家電有限公司）；Adventurer分析電子天平（美國奧豪斯儀器有限公司）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器）；TGL-16G高速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理方法

鮮山楂挑選→洗凈→去核→切片→烘干（50 ℃，16 h）→粉碎→過篩（0.125 mm孔徑，即120目）→山楂粉（裝密封袋備用）

1.3.2 山楂中主要功能性成分的提取

1.3.2.1 黃酮類化合物的提取

黃酮樣品的提取參考馮靖等[9]對黃酮的提取方法。

1.3.2.2 多糖的提取

多糖樣品的提取用NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的測定》[10]的方法。

1.3.2.3 維生素C的提取維生素C的提取采用GB 5009.86—2016《食品中抗壞血酸的測定》[11]中的方法。

1.3.3 山楂提取物含量測定

1.3.3.1 黃酮類化合物含量測定

黃酮含量測定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[12]。以吸光度為縱坐標，以蘆丁標品質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得標準曲線方程y=7.107 1x+0.044（R2=0.999 7）。

由山楂制備出的黃酮樣液取出2 mL，置于25 mL的容量瓶中，其余步驟同標準曲線制備，測定黃酮樣品吸光度。黃酮含量按式（1）計算。

式中：Y為樣品待測液中黃酮含量，mg/g；C為從標準曲線上查得被測液中黃酮的質量濃度，mg/mL；V0為測量時定容體積，mL；V1為檢測時所取提取液體積，mL；V2為超聲提取后樣品定容體積，mL；m為提取黃酮時稱量山楂樣品質量，g。

1.3.3.2 多糖含量測定

多糖含量測定采用苯酚-硫酸法[13]。以葡萄糖質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪出標準曲線，得標準曲線方程y=6.445 2x+0.150 6（R2=0.999 2）。

適當稀釋樣品，使吸光度在0.2～0.8之間。吸取1.00 mL稀釋后的樣品溶液于20 mL試管中，樣品加量同上述標準曲線制備，測定多糖樣品吸光度。多糖含量按式（2）計算。

式中：ω為多糖含量，g/100 g；m1為葡萄糖標準曲線上查得的樣品稀釋液中含糖質量，μg；V1為樣品定容體積，mL；m2為樣品質量，g；V2為測吸光度時樣品稀釋液體積，mL。

1.3.3.3 維生素C含量測定

維生素C含量測定采用徐朝陽[14]的2,6-二氯靛酚滴定法。

2,6-二氯靛酚溶液標定步驟：用移液管精確移取1 mL 1 mg/mL抗壞血酸標準溶液，置入50 mL錐形瓶中，再加入10 mL 20 mg/mL偏磷酸溶液，搖勻后用2,6-二氯靛酚溶液滴定，直至滴入最后一滴液體時，錐形瓶內液體剛好出現(xiàn)粉紅色并保持15 s不褪色。同時，另取10 mL偏磷酸溶液做空白試驗，按式（3）計算滴定度。

式中：T為2,6-二氯靛酚溶液的滴定度，mg/mL；C為抗壞血酸標準溶液的質量濃度，mg/mL；V為測滴定度所吸取抗壞血酸標準溶液體積，mL；V1為滴定抗壞血酸標準溶液所消耗的2,6-二氯靛酚溶液體積，mL；V0為滴定空白所消耗2,6-二氯靛酚溶液體積，mL。

精確移取10 mL樣品待測液于錐形瓶中，用標定過后的2,6-二氯靛酚溶液進行滴定，反應現(xiàn)象同滴定度測定試驗，同時做空白試驗。維生素C含量按式（4）計算。

式中：X為樣品待測液中抗壞血酸含量，mg/100 g；V為滴定待測液所需2,6-二氯靛酚溶液體積，mL；V0為滴定空白所需2,6-二氯靛酚溶液體積，mL；T為2,6-二氯靛酚溶液的滴定度，mg/mL；A為稀釋倍數(shù)；m為試樣質量，g。

2 山楂各成分的抗氧化能力比較

2.1 DPPH自由基清除能力

使用DPPH方法對提取物的抗氧化活性進行體外評估[15]。測定步驟[16]：制得1.5×10-4mol/L的DPPH溶液，取2 mL該溶液，加入2 mL用無水乙醇溶解的試樣，用渦旋振蕩器振搖混合均勻，在25 ℃下避光放置，30 min后照紫外分光光度計，于517 nm測定吸光度，每個樣品測定3次。DPPH自由基清除率按式（5）計算。

式中：A1為DPPH溶液和試樣的吸光度；A2為乙醇溶解的試樣溶液的吸光度；A0為DPPH無水乙醇溶液的吸光度。

2.2 羥自由基清除能力

樣品均用95%乙醇溶液配制成質量濃度為0.11 g/mL溶液，向4 mL樣品溶液中加入8.8 mmol/L H2O2溶液、9 mmol/L FeSO4溶液和9 mmol/L水楊酸溶液各0.5 mL，混勻，在37 ℃水浴加熱30 min，在510 nm波長處測定樣品吸光度（A1），將體系中的樣品溶液改為加入4 mL蒸餾水，測得空白對照吸光度（A0），將加入0.5 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液代替為0.5 mL蒸餾水，測得樣品本底吸光度（A2），其中A1和A2每個質量樣品濃度做3個平行，同按式（5）計算羥自由基清除率。

2.3 ABTS清除能力[17]

將過硫酸鉀儲備液（2.45 mmol/L）與ABTS儲備液（7 mmol/L）按體積比1∶1制備ABTS+自由基儲備溶液，并在黑暗中室溫保持16 h。ABTS+自由基儲備溶液用10 mmol/L磷酸鹽緩沖鹽水（pH 7.4）稀釋，在734 nm處的吸光度為0.700±0.020。將樣品與2.5 mL ABTS+自由基溶液混合并在室溫下反應30 min，在734 nm處測定吸光度。同按式（5）計算ABTS清除率。

2.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復3次。試驗結果表示為“平均值±標準偏差”，使用Origin 2018軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并繪制圖表，采用IBM SPSS Statistics 25數(shù)據(jù)分析軟件對變化進行顯著性分析，并進行Duncan’s差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

3 結果與分析

3.1 山楂中主要功能性成分含量

山楂中黃酮、多糖、維生素C含量見表1，黃酮、多糖、維生素C的含量有明顯差異。

表1 山楂中主要功能性成分含量

3.2 山楂各提取物抗氧化能力的研究

3.2.1 DPPH自由基清除能力

山楂不同提取物清除DPPH的能力如圖1所示。隨著加樣體積不斷增加，3種提取物清除DPPH自由基能力均呈現(xiàn)上升趨勢，不同樣品對DPPH自由基清除率隨體積升高而逐漸增強，在相同體積下，維生素C清除DPPH的能力最強。這是由于抗氧化劑的加入，配對了DPPH含有的孤對電子，DPPH溶液就由深紫紅色自由基形式還原成黃色的非自由基形式，褪色程度可反映待測物質的抗氧化能力大小。在1.0 mL時，對DPPH自由基清除率為90.3%，高于其他2個樣品。通過方差分析，P＜0.05，有顯著差異。

圖1 山楂不同提取物對DPPH自由基的清除能力

山楂不同提取物對DPPH的IC50如表2所示。在清除率均為50%的情況下，維生素C濃度最小，多糖濃度最大。由此可得出，相比較山楂的其他提取物，維生素C清除DPPH自由基的能力最強，多糖最弱。趙二勞等[18]研究山楂提取物抗氧化能力，其研究結果：山楂提取物的抗氧化能力弱于維生素C，報道中山楂黃酮提取物清除 DPPH自由基的能力與試驗結果相同，這可能與樣品及研究方法不同有關。張全才等[19]研究山楂多糖的抗氧化活性研究，研究結果是：從整體來看維生素C的DPPH清除能力要強于山楂多糖，報道中山楂多糖清除DPPH自由基的能力與試驗結果相同。

表2 不同提取成分對DPPH自由基的IC50

3.2.2 羥自由基清除能力

山楂不同提取物清除羥自由基的能力如圖2所示。隨著體積不斷增加，3種提取物清除羥自由基的能力都呈現(xiàn)上升趨勢，不同樣品對羥基自由基的清除率均隨體積升高而逐漸增強。且在相同體積下，維生素C清除羥自由基的能力最強。這是由于過氧化氫和亞鐵離子反應生成·OH，水楊酸再與其反應生成能在510 nm處有最大吸收的二羥基苯甲酸，而抗氧化劑能夠阻礙其生成，則反應體系在相同波長下的吸光度就會相應降低。在1.0 mL時，對羥基自由基的清除率為82.2%，高于其他2個樣品，與維生素C對羥基自由基的清除率最接近。通過方差分析，P＜0.05，有顯著差異。趙巖巖等[19]研究結果是：多糖清除羥自由基的能力呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，清除率最高可達81.6%，表明山楂多糖具有較好的清除羥基自由基的能力[20]。與試驗結果不同，可能是試驗方法與材料的不同。

圖2 山楂不同提取物對羥自由基的清除能力

山楂不同提取物對羥自由基的IC50如表3所示。在清除率均為50%的情況下，維生素C濃度最小，多糖濃度最大。由此可得出，相比較山楂的其他提取物，維生素C清除羥自由基的能力最強，多糖最弱。

表3 不同提取成分對羥自由基的IC50

3.2.3 ABTS自由基清除能力

山楂不同提取物清除ABTS自由基的能力如圖3所示。不同樣品對DPPH自由基的清除率均隨體積升高而逐漸增強?？梢钥闯?，隨著加樣體積不斷增加，3種提取物清除自由基的能力都呈現(xiàn)上升趨勢，且在相同體積下，維生素C的清除能力最強。這種評價抗氧化能力大小的原理是：ABTS易溶于水，是一種顯色劑，經(jīng)氧化反應生成陽離子自由基，該自由基在734 nm處有最大吸收峰，若加入抗氧化物質兩者就會發(fā)生反應，則反應體系在相同波長下的吸光度就會相應降低。在1.0 mL時，維生素C對ABTS自由基的清除率為82.2%。通過方差分析，P＜0.05，有顯著差異。

圖3 山楂不同提取物對ABTS自由基的清除能力

山楂不同提取物對ABTS自由基的IC50如表4所示。在清除率均為50%的情況下，維生素C的濃度最小，多糖濃度最大。由此可得出，相比較山楂的其他提取物，維生素C清除ABTS自由基的能力最強，多糖最弱。鄭朋朋等[21]研究山楂多糖的提取及其抗氧化性作用，整體來看，維生素C對ABTS自由基清除能力要強于山楂多糖，與試驗結果相同。

表4 不同提取成分對ABTS自由基的IC50

4 結論

試驗采用最優(yōu)條件分別提取出山楂中的黃酮、多糖、維生素C，并通過試驗測定各提取物含量，計算得出：鐵金星山楂中含33.69 mg/g黃酮、3.84 g/100 g多糖、36.64 mg/100 g維生素C，其含量大小依次為多糖＞黃酮＞維生素C。

通過4種抗氧化能力測定方法，評價山楂4種成分的抗氧化活性得出：黃酮對自由基的清除率最高值分別為64%（DPPH自由基清除率），63.5%（羥自由基清除率）和66.2%（ABTS自由基清除率）；多糖對自由基的清除率最高值分別為60.1%（DPPH自由基清除率），51.3%（羥自由基清除率）和51.1%（ABTS自由基清除率）；維生素C對自由基的清除率最高值分別為90.3%（DPPH自由基清除率），82.2%（羥自由基清除率）和82.2%（ABTS自由基清除率）。DPPH自由基清除能力：維生素C＞黃酮＞多糖。羥自由基清除能力：維生素C＞黃酮＞多糖。ABTS自由基清除能力：維生素C＞黃酮＞多糖。從抗氧化試驗的測定結果可以發(fā)現(xiàn)，樣品黃酮含量高則抗氧化性也高，抗氧化性和黃酮含量具有正相關性。山楂中含量最多的多糖，在抗氧化能力方面卻最弱，而含量較少的維生素C和黃酮抗氧化能力相對較強。以上說明維生素C含量少卻抗氧化能力強，說明其自身抗氧化能力就很強，而多糖含量多抗氧化能力還弱，說明其自身抗氧化能力就很弱。

綜上所述，山楂中黃酮和維生素C抗氧化能力較強，今后可作為一個很好的抗氧化來源進行應用。