周慧娜，張 濤，徐自恒，薛曉焱，馮 建，劉 震，王艷梅，蔡齊飛，耿曉東，代 莉 ，李明婉 ，李 志

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) a. 林學(xué)院；b. 中原地區(qū)森林資源培育國家林業(yè)局重點實驗室，河南 鄭州 450002；2. 棕櫚生態(tài)城鎮(zhèn)發(fā)展股份有限公司，河南 鄭州 450000）

微生物是生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，對生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用，它們的生存繁衍影響著植株的健康生長。與土壤、根際相比，葉際微生物種類較少[1]，但仍發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。葉際微生物（Phyllospheric microorganism）一般是指生活在植物地上部分，主要棲息于葉片的微生物群落[2]。對葉際微生物而言，葉際環(huán)境是一個非?？量糖也环€(wěn)定的生境，生活在葉表的微生物經(jīng)常要面臨水分和營養(yǎng)物質(zhì)的不足，以及劇烈變化的強(qiáng)光、高溫和高紫外線等的影響[1]，受當(dāng)?shù)丨h(huán)境影響明顯[3-4]，即便如此，植物葉片仍存在大量不同性質(zhì)的微生物，比如真菌、細(xì)菌和病毒等[5]。葉際微生物與植物體共同生長、相互依存、相互影響、相互制約，彼此形成一個緊密的整體，它們是微生物生態(tài)系統(tǒng)的主要成員，其代謝活動與代謝產(chǎn)物可以促進(jìn)宿主適應(yīng)環(huán)境，維持生態(tài)系統(tǒng)平衡[6]。其中，有可以固氮、促進(jìn)宿主生長、抑制病原菌、降解農(nóng)殘農(nóng)藥等正面功能的有益菌，如蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis是一種常見的葉際細(xì)菌，作為生物殺蟲劑，它在保護(hù)作物和防治病蟲害方面起到了很大作用。由于長期使用同一類型的殺蟲劑，昆蟲易產(chǎn)生抗性[7]，而蘇云金芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因作物的廣泛應(yīng)用，極大地減少了農(nóng)藥的使用，降低了環(huán)境污染，有助于生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[8]。另一方面，也存在著引發(fā)病害、抑制植物生長等負(fù)面效應(yīng)的病原菌[9]，如青枯假單胞菌Ralstonia solanacearum，俗稱青枯菌，是危害嚴(yán)重的世界性植物病原細(xì)菌[10]，廣泛分布于熱帶、亞熱帶、溫帶地區(qū)[11]，青枯菌可引起煙草、花生和番茄等萎蔫病，可侵染40多個科200多種植物，寄主范圍極廣[12]。目前，對于植物微生物的研究更多集中于土壤微生物、根際微生物以及微生物肥料等的研究[13-16]，相比之下，有關(guān)葉際微生物的研究相對較少。

山桐子Idesia polycarpaMaxim.，又名水冬瓜，為大風(fēng)子科Flacourtiaceae山桐子屬Idesia落葉喬木，分布廣泛，樹干通直美觀，極具觀賞價值[17]。山桐子果和種子均可榨油，干果含油率達(dá)35%左右[18]，木材質(zhì)地松軟，適宜做工藝品家具等[19]。油脂中亞油酸含量很高，山桐子果實中提取的油脂可以加工出優(yōu)良的食油、柴油以及潤滑油等，其油脂還可以通過加工用于制藥，具有降低血脂、血壓等功效[20]。由此可見，山桐子是一種有著觀賞性、果材兩用的多功能速生經(jīng)濟(jì)型樹種[21]。目前，對于山桐子的研究，多集中于山桐子油、種子、果實以及栽培扦插等方面，對于山桐子微生物方面的研究尚不多見。微生物在自然環(huán)境中的相互作用非常復(fù)雜，它們的數(shù)量和多樣性以及組成的異質(zhì)性使其更加復(fù)雜化[22]。本研究通過分析健康與感病山桐子葉際微生物之間的群落多樣性特征，探明微生物群落的主要差異，并對不同菌群進(jìn)行功能預(yù)測分析，為山桐子科研及生產(chǎn)經(jīng)營提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗地選在河南省鄭州市金水區(qū)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)試驗站，地理位置 113°38′E，34°47′N；海拔為108 m，該地區(qū)最高氣溫為43℃，最低氣溫為-17.9℃，年平均氣溫為14.2℃，年降水量為650.1 mm，無霜期為215 d，全年光照時間約為2 400 h，屬于典型的半干旱半濕潤大陸性季風(fēng)氣候。土壤為潮土，pH值為中性[23-24]。

1.2 樣品采集

選擇生長在鄭州地區(qū)的山桐子為試驗材料，株行距為4 m×4 m，山桐子采用常規(guī)栽培方法。分別采集健康與感病山桐子葉片，山桐子選擇樹體大小一致，且每株選擇相同部位的葉片。將山桐子葉片清洗干凈，用75%的酒精消毒4～5 min，用蒸餾水清洗3～4次；將處理過的葉片放在研缽中加入液氮進(jìn)行搗碎處理，之后放入離心管中，應(yīng)用CTAB方法提取DNA[25]。

1.3 高通量測序

使用上海派森諾生物科技有限公司Illumina平臺對樣品的16S rRNA和ITS基因測序。對細(xì)菌的16S V3V4區(qū)（測序策略：Novaseq-PE250）和真菌的ITS V1區(qū)（測序策略：測序策略：Miseq-PE250）進(jìn)行測序。細(xì)菌的上游引物名稱：338F上游引物序列：ACTCCTACGGGAGGCAGCA；下游引物名稱：806R下游引物序列：GGA CTACHVGGGTWTCTAAT[26]。真菌的上游引物名稱：ITS5F上游引物序列：GGAAGTAAAAG TCGTAACAAGG；下游引物名稱：ITS1R下游引物序列：GCTGCGTTCTTCATCGATGC[27]。再將擴(kuò)增產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物純化效果，測定純化后PCR產(chǎn)物的濃度，將純化產(chǎn)物等摩爾數(shù)混合，以備上機(jī)前純化和測序儀分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用QIIME軟件（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0）進(jìn)行序列過濾，以保證分析結(jié)果準(zhǔn)確性。去除葉綠體來源和線粒體來源的序列。運用Mothur軟件去除嵌合體序列，得到后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列。使用QIIME軟件，對獲得的序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分，獲得每個OTU所對應(yīng)的分類學(xué)信息，并使用QIIME軟件計算多樣性指數(shù)[28]。運用SPSS 26.0軟件對健康山桐子與感病山桐子葉際微生物多樣性指數(shù)進(jìn)行顯著性分析。采用PICRUSt2方法分析預(yù)測山桐子葉際菌群的代謝功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 健康山桐子與感病山桐子葉際微生物的豐富度及多樣性

健康（Y）與感?。˙Y）山桐子葉際細(xì)菌獲得有效序列分別為211 375、202 030，真菌分別獲得有效序列314 050、273 779（表1）。采用97%的序列相似度作為OTUs（Operational Taxonomic Unit，OTUs））的劃分閾值。如圖1所示，健康山桐子與感病山桐子細(xì)菌OTUs數(shù)量分別為212和198個，兩者共有的OTUs數(shù)目為29個，特有OTUs數(shù)量分別為183和169個。健康山桐子與感病山桐子真菌OTUs數(shù)量分別為101和79個，兩者共有的OTUs數(shù)目為31個，特有OTUs數(shù)量分別為70和48個。

表1 樣品序列信息Table 1 Sample sequence information

分析正常山桐子葉片與感病山桐子葉片的Chao1、Observed_species、Pielou_e、Shannon 和Simpson多樣性指數(shù)（表2），發(fā)現(xiàn)山桐子健康葉片細(xì)菌及真菌的豐富度和多樣性均高于感病葉片，說明山桐子感病在一定程度上降低了其豐度和多樣性，且Chao1指數(shù)的顯著差異表明健康山桐子葉際細(xì)菌豐富度顯著高于病葉（P＜0.05）。

2.2 健康山桐子與感病山桐子葉際細(xì)菌群落組成

測序結(jié)果表明，山桐子葉際細(xì)菌隸屬于16個門、43個綱、90個目、143個科、199個屬。如圖2A，在門水平上，山桐子葉際細(xì)菌主要為變形菌門Proteobacteria。隸屬于該門的細(xì)菌豐度分別占健康和感病植株的77.66%和70.29%。變形菌門Proteobacteria、藍(lán)細(xì)菌門Cyanobacteria、酸桿菌門Acidobacteria相對豐度相比健康植株，感病植株中相對豐度均有所下降；相比健康植株，厚壁菌門Firmicutes、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、綠彎菌門Chloroflexi相對豐度在感病植株中均有所增加。

圖1 山桐子葉際細(xì)菌、真菌韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of bacteria and fungi in leaf area of I. polycarpa

表2 樣品微生物多樣性指數(shù)Table 2 Microbial diversity index of samples

在葉際細(xì)菌屬水平上（圖2B），不動桿菌屬Acinetobacter和別生根瘤菌-新生根瘤菌-寄生根瘤菌-根瘤菌屬Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium的相對豐度較高，不動桿菌屬在健康和感病植株中相對豐度分別為32.67%和24.90%，別生根瘤菌-新生根瘤菌-寄生根瘤菌-根瘤菌屬在兩者中相對豐度分別為11.64%和8.47%，這兩個屬以及伯克霍爾德氏菌屬Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、短波單胞菌屬Brevundimonas在感病植株的相對豐度相對于健康植株均有所下降，Escherichia-Shigella屬感病植株的相對豐度相較于健康植株上升較多（1.14%、5.46%）。

檢測出健康山桐子葉際細(xì)菌特有菌屬92類，除去未分類及未培養(yǎng)菌屬，特有菌屬相對豐度排名前三的是：Candidatus_Competibacter、水桿菌屬Aquabacterium以及海洋芽胞桿菌屬Oceanobacillus；感病山桐子葉際特有細(xì)菌菌屬56類，除去未分類及未培養(yǎng)菌屬，相對豐度排名前三的是動球菌屬Kineococcus、脆弱球菌屬Craurococcus及薄層菌屬Hymenobacter。

2.3 健康山桐子與感病山桐子的葉際真菌組成分析

測序結(jié)果表明，山桐子葉際真菌隸屬于8個門、18個綱、37個目、71個科、101個屬。如圖3A，在門水平上，山桐子葉際真菌優(yōu)勢菌落為子囊菌門Ascomycota、擔(dān)子菌門Basidiomycota，分別占健康和感病植株的85.15%和93.54%。其中子囊菌門Ascomycota的分別占健康和感病植株77.59%和89.50%，是相對豐度最高的門。經(jīng)分析，擔(dān)子菌門Basidiomycota在正常植株（7.56%）是感病植株（4.04%）的1.9倍，斜紋菌門Olpidiomycota在正常植株（5.34%）是感病植株（1.83%）的2.9倍，毛霉菌門Mucoromycota在健康植株（1.50%）是感病植株（0.65%）的2.3倍，三者相比，健康植株，感病植株的相對豐度都大幅降低。

在屬水平上（圖3B），健康植株中鏈格孢屬Alternaria、亞隔孢殼屬Didymella相對豐度均在15%以上，鏈格孢屬Alternaria在感病植株中相對豐度占一半以上，是感病植株的主要菌屬。相對豐度前十的菌屬里，亞隔孢殼屬Didymella（15.43%，8.95%）、油壺菌屬Olpidium（5.34%，1.83%）、球腔菌屬Mycosphaerella（4.57%，1.05%）健康植株高于感病植株，鏈格孢屬Alternaria在感病葉片里明顯增多，其余菌屬差異不大。

圖2 健康山桐子與感病山桐子主要細(xì)菌群在門（A）、屬（B）水平上相對豐度Fig. 2 Relative abundance of the main bacterial groups at phylum (A) and genus (B) levels of healthy and susceptible I. polycarpa

圖3 健康山桐子與感病山桐子主要真菌群在門（A）、屬（B）水平上相對豐度Fig. 3 The relative abundance of the main fungi in healthy and susceptible I. polycarpa at phylum (A) and genus (B) levels

2.3.1 鏈格孢屬Alternaria

鏈格孢屬Alternaria是一類世界范圍廣泛分布的真菌，存在于自然界的不同基質(zhì)上，可作為腐生菌、寄生菌和內(nèi)生菌。作為腐生菌，鏈格孢以極強(qiáng)的適應(yīng)能力存活于水、土壤、空氣和紙等不同基質(zhì)上，部分可在已發(fā)病的寄主組織上再次定植，占領(lǐng)其他病原物造成的病斑位點、受損部位或其他衰弱組織等，加重其他病害的發(fā)生。鏈格孢屬病葉相比健康葉片增加了215%，推測該屬為葉片致病的主要菌屬。

2.3.2 亞隔孢殼屬Didymella

亞隔孢屬真菌是一類重要的植物病害病原菌。徐兵劃等[29]研究報道亞隔孢殼屬真菌Didymella.bryoniae（Auersw.）可引起蔓枯病，危害甜瓜、黃瓜、哈密瓜、西瓜、西葫蘆等至少12個屬，23種葫蘆科作物。亞隔孢殼屬Didymella是唯一與莖點霉屬和殼二孢屬真菌正確關(guān)聯(lián)的有性型屬[30]，莖點霉屬由Fries（1821）建立，該屬真菌是一類重要的植物病原菌，分布廣泛且具有豐富的多樣性,主要引起植物葉片及莖桿上的病斑，可導(dǎo)致作物產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失，其中一些物種還被列為檢疫性真菌[31]。山桐子病葉中亞隔孢殼屬數(shù)量相較于健康葉片降低了42%。

2.3.3 油壺菌屬Olpidium

油壺菌屬Olpidium是壺菌目Chytridiales中的一種生物內(nèi)生的、整體產(chǎn)果式真菌。其中Olpidium uicia可引起蠶豆癭病，是蠶豆主要和最具破壞性的疾病[32]。該屬相對于健康葉片，病葉中相對豐度下降了66%。

2.3.4 健康山桐子和感病山桐子葉際真菌特有屬

檢測出健康山桐子葉際真菌特有菌屬34類，除去未分類及未培養(yǎng)菌屬，特有菌屬相對豐度排名前三的是：赤霉菌屬Gibberella、毛殼菌屬Chaetomium及擬棘殼孢屬Pyrenochaetopsis；感病山桐子葉際特有菌屬29類，除去未分類及未培養(yǎng)菌屬，特有菌屬相對豐度排名前三的是：熱子囊菌屬Thermoascus、黃絲曲霉屬Talaromyces及裸腳菇屬Gymnopus。

2.4 山桐子葉際微生物群落功能預(yù)測分析

2.4.1 細(xì)菌群落

基于KEGG數(shù)據(jù)庫對細(xì)菌群落進(jìn)行分析（圖4），結(jié)果表明在第一層級水平，有生物進(jìn)程（Cellular Processes）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、 人 類 疾 ?。℉uman Diseases）、代謝（Metabolism）和有機(jī)體系統(tǒng)（Organismal Systems）6種代謝通路。其中和代謝有關(guān)的基因相對豐度最高，為81.34%。

圖4 PICRUSt2預(yù)測細(xì)菌群落的功能（level2）Fig. 4 Bacterial communities functions predicted by PICRUSt2 (level2)

在KEGG第二層級上研究代謝功能，豐度排名位于前三的代謝功能有輔助因子和維生素的代 謝（Metabolism of cofactors and vitamins）、氨基酸代謝（aminoacid metabolism）和碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism），其豐度分別為16.57%、12.02%和11.63%。同時，還存在能量代謝（energy metabolism）、其他氨基酸 代 謝（Metabolism of other amino acids）、 萜類化合物和聚酮類化合物的代謝（Metabolism of terpenoids and polyketides）、異源生物降解和代謝（xenobiotics biodegradation and metabolism） 、脂代謝（lipid metabolism）、其他次生代謝產(chǎn)物的合成（biosynthesis of other secondary metabolites）、聚糖生物合成與代謝（glycan biosynthesis and metabolism）、 核 苷 酸 代 謝（nucleotide metabolism）、折疊，分類和降解（Folding,sorting and degradation）、復(fù)制和修復(fù)（replication and repair）、翻譯（translation）等。

2.4.2 真菌群落

基于MetaCyc數(shù)據(jù)庫對真菌群落進(jìn)行分析（圖5），在山桐子葉際真菌群落有5個代謝通路，分別為：生物合成（Biosynthesis）、退化/利用/同化（Degradation/Utilization/Assimilation）、前體代謝物和能量的產(chǎn)生（Generation of Precursor Metabolite and Energy）、 聚 糖 通 路（Glycan Pathways）和代謝集群（Metabolic Clusters）。主要功能類群為生物合成（44.74%）、前體代謝物和能量的產(chǎn)生（35.57%）。

圖5 PICRUSt2預(yù)測真菌群落的功能（level2）Fig. 5 Fungal communities functions predicted by PICRUSt2 (level2)

在第二層級上，主要功能有核苷和核苷酸的生物合成（Nucleoside and Nucleotide Biosynthesis）、輔因子，輔基，電子載體和維生素生物合成（Cofactor, Prosthetic Group, Electron Carrier, and Vitamin Biosynthesis）、氨基酸生物合成（Amino Acid Biosynthesis）、電子轉(zhuǎn)移（Electron Transfer）和呼吸（Respiration）。

3 討 論

在本研究中，發(fā)現(xiàn)山桐子健康葉片細(xì)菌及真菌豐富度和多樣性均高于感病葉片，說明山桐子感病在一定程度上降低了其豐度和多樣性，與前人研究[33-35]得出健康植株比感病植株擁有更高的豐富度和多樣性的結(jié)論一致。葉際細(xì)菌中變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bacteriodetes等為最具代表性的優(yōu)勢類群，不動桿菌屬Acinetobacter、假單胞菌屬Pseudomonas等在不同植物葉際中也被反復(fù)檢測到；門水平上的子囊菌門Ascomycota、擔(dān)子菌門Basidiomycota是葉際真菌的優(yōu)勢類群，屬水平上枝孢屬Cladosporium、鏈格孢屬Alternaria等較為常見[36]。對比兩者之間的差異性發(fā)現(xiàn)鏈格孢屬Alternaria真菌在健康山桐子的相對豐度遠(yuǎn)低于感病山桐子的相對豐度。鏈格孢屬Alternaria屬于子囊菌門、座囊菌綱、格孢腔目和孢腔菌科[37]，對應(yīng)健康山桐子與感病山桐子的葉際真菌優(yōu)勢門、綱、目、科，因此可能是由于鏈格孢屬Alternaria在健康山桐子與感病山桐子中的顯著性差異導(dǎo)致了山桐子感病。鏈格孢屬Alternaria真菌同時具有寄生和腐生性，可以適應(yīng)多種不同的環(huán)境條件，故繁殖能力較強(qiáng)[38]。它們分泌的酶可以降解寄主植物的保護(hù)組織，降低植株抵御病原體的能力，幫助病原體入侵、定植植物[39]，造成多種植物感病[40]。

亞隔孢殼屬Didymella、油壺菌屬Olpidium、球腔菌屬Mycosphaerella真菌感病植株相較于健康植株相對豐度都出現(xiàn)不同程度下降，由此推測，鏈格孢屬真菌的增長抑制了上述菌群的生存和繁殖。在馮麗等[41]的研究中，深海沉積物中分離出的包括鏈格孢屬在內(nèi)的幾個屬對多種指示細(xì)菌均產(chǎn)生了不同程度的抑制。因此，感病山桐子葉際細(xì)菌中除葉綠體線粒體以外的幾個菌落相對豐度降低可能也與鏈格孢屬菌落的抑制作用有關(guān)。

通過PICRUSt2功能預(yù)測，與代謝、生物合成及能量產(chǎn)生有關(guān)的微生物群落活躍度較高。其中，輔助因子和維生素的代謝在細(xì)菌群落中活躍度最高，其在維持細(xì)胞正常生長和正常代謝，維持機(jī)體正常生命活動中不可或缺。真菌群落內(nèi)核苷和核苷酸的生物合成功能群豐度最高，它們是生物體內(nèi)核酸的重要組成部分，參與多種代謝和調(diào)節(jié)活動。

本研究基于高通量測序?qū)】瞪酵┳优c感病山桐子的葉際細(xì)菌和葉際真菌群落多樣性、組成及功能預(yù)測進(jìn)行了研究，其中健康山桐子與感病山桐子的葉際細(xì)菌群落多樣性指數(shù)總體來說差異不顯著，但一些豐度較低的菌屬在健康山桐子與感病山桐子之間有明顯差異，如短波單胞菌屬Brevundimonas在健康植株（2.08%）是感病植株（0.74%）的2.8倍，這說明了雖然葉際細(xì)菌群落多樣性指數(shù)無顯著差異，但是兩者之間的群落組成仍存在差異[42]。還有一些相對豐度不高的微生物菌落，不代表其在植物中沒有作用或作用微弱，在某些情況下它們是影響植物多種生理功能的主要因素[43]，其對植物的影響還有待進(jìn)一步探究。

微生物群落相互之間以及與環(huán)境之間息息相關(guān)、互相作用[44-46]，本文重點關(guān)注優(yōu)勢菌落對山桐子產(chǎn)生的影響，后續(xù)將對可能產(chǎn)生關(guān)鍵作用的非優(yōu)勢菌落，以及菌落之間聯(lián)合效應(yīng)對山桐子的作用進(jìn)行深入分析，以期為山桐子更好地生長發(fā)育提供參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

健康山桐子健康植株葉際細(xì)菌及真菌豐富度和多樣性均高于感病植株；檢測出山桐子葉際細(xì)菌主要菌門為變形菌門，真菌優(yōu)勢菌落為子囊菌門和擔(dān)子菌門，優(yōu)勢菌屬為鏈格孢屬和亞隔孢殼屬，鏈格孢屬真菌可能是山桐子感病的關(guān)鍵因子；功能預(yù)測結(jié)果表明，與代謝、生物合成及能量產(chǎn)生有關(guān)的微生物群落是活躍度最高的。