徐龍威，雍婕，周海燕

一種新型糖苷水解酶的異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

徐龍威，雍婕，周海燕*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

為得到MtGH6最優(yōu)的表達(dá)宿主，構(gòu)建了質(zhì)粒pET21a–MtGH6、pBES–MtGH6、pPICZαA–MtGH6，以大腸埃希菌BL21、枯草芽孢桿菌RIK1285及畢赤酵母GS115為工程菌，對(duì)MtGH6進(jìn)行異源表達(dá)及分離純化，并對(duì)表達(dá)MtGH6的3個(gè)宿主菌的生長(zhǎng)狀況、產(chǎn)酶量、純化回收率、酶活力等參數(shù)進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明：大腸埃希菌BL21及枯草芽孢桿菌RIK1285在生長(zhǎng)穩(wěn)定后，OD值維持在1.5，而畢赤酵母GS115生長(zhǎng)穩(wěn)定后，OD值維持在2.0；畢赤酵母GS115生產(chǎn)的MtGH6為77 mg/L，純化回收率為15.40%，產(chǎn)酶量和純化回收率均高于大腸埃希菌BL21、枯草芽孢桿菌RIK1285生產(chǎn)的MtGH6；由畢赤酵母GS115表達(dá)的MtGH6的酶活力為15.60 U/mg，由大腸埃希菌BL21及枯草芽孢桿菌RIK1285表達(dá)的MtGH6分別為7.45、10.06 U/mg，說(shuō)明畢赤酵母GS115是MtGH6的最優(yōu)表達(dá)宿主；對(duì)其分泌的MtGH6的酶學(xué)性質(zhì)展開(kāi)研究，結(jié)果表明在降解微晶纖維素的反應(yīng)中，該酶最適pH為8.0，最適溫度為60 ℃，添加0.5 mmol/L Mn2+可使其活性提高，表明MtGH6在生物燃料生產(chǎn)中可能具有良好的應(yīng)用前景。

糖苷水解酶；異源表達(dá)；宿主菌；酶學(xué)性質(zhì)

農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展產(chǎn)生了大量的農(nóng)業(yè)廢棄物，如玉米纖維、玉米秸稈、甘蔗渣、稻殼等[1]。木質(zhì)纖維素作為植物細(xì)胞壁的主要成分(占生物量的50%左右)在農(nóng)業(yè)廢棄物中占有較大的比重[2]；因此，如何回收木質(zhì)纖維素，值得社會(huì)的廣泛關(guān)注。木質(zhì)纖維素通過(guò)預(yù)處理可以得到纖維素，而纖維素可進(jìn)一步通過(guò)酸法、堿法、酶法轉(zhuǎn)化為糖類(lèi)[3]；糖經(jīng)過(guò)發(fā)酵可最終轉(zhuǎn)化為生物乙醇，故木質(zhì)纖維素的回收利用可用于生物質(zhì)的能源開(kāi)發(fā)[4]；而生物酶法相較于酸法和堿法對(duì)于環(huán)境污染的破壞最小，是值得提倡的處理方法[5]。

在采用酶法預(yù)處理木質(zhì)纖維素的研究中，存在2種類(lèi)型的纖維素酶系統(tǒng)：一種是厭氧細(xì)菌(如熱梭狀芽孢桿菌)中被稱(chēng)為纖維素體的酶復(fù)合體，它由一種非酶支架蛋白組成，與各種酶亞基結(jié)合，協(xié)同降解纖維素和半纖維素，是一種復(fù)合纖維素酶系統(tǒng)[6]；另一種是由絲狀真菌和好氧細(xì)菌中的胞外纖維素酶組成的非復(fù)合纖維素酶系統(tǒng)，也可協(xié)同降解纖維素[7]，常用于工業(yè)。

通過(guò)理性及非理性蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)技術(shù)挖掘并開(kāi)發(fā)具有工業(yè)應(yīng)用潛力的新型纖維素酶一直是研究的熱點(diǎn)[8]。選取合適的宿主菌進(jìn)行蛋白異源表達(dá)非常重要。本研究中，以MtGH6為目標(biāo)蛋白，在大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、畢赤酵母3種不同宿主菌中對(duì)MtGH6進(jìn)行異源表達(dá)，比較分析不同宿主在表達(dá)MtGH6時(shí)的生長(zhǎng)狀況、產(chǎn)酶量、純化回收率、酶活力等參數(shù)，以確定此異源蛋白的最優(yōu)表達(dá)宿主，旨在為纖維素酶MtGH6的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料及方法

1.1　材料

pET21a–MtGH6、pBES–MtGH6的質(zhì)粒和枯草芽孢桿菌RIK1285由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所吳邊組惠贈(zèng)；質(zhì)粒pPICZαA–MtGH6、大腸埃希菌Top10、大腸埃希菌BL21、畢赤酵母GS115由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程研究所提供；LB培養(yǎng)基為大腸埃希菌培養(yǎng)基；含有3種氨基酸(色氨酸、蛋氨酸、賴(lài)氨酸)的TB培養(yǎng)基為枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基；YPD培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基為常用畢赤酵母培養(yǎng)基。基因克隆所用引物見(jiàn)表1。

表1　PCR所用引物

1.2　方法

1.2.1目標(biāo)酶基因在宿主菌中的轉(zhuǎn)化與鑒定

1) 攜帶質(zhì)粒pET21a–MtGH6的大腸埃希菌BL21的轉(zhuǎn)化與鑒定。將質(zhì)粒pET21a–MtGH6轉(zhuǎn)入Top10商業(yè)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆，涂布于含有氨芐青霉素的LB平板中過(guò)夜培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性克隆，用試劑盒提取質(zhì)粒后，導(dǎo)入大腸埃希菌BL21中。引物pET21a–MtGH6–F及pET21a–MtGH6–R用于菌落PCR驗(yàn)證。

2) 攜帶質(zhì)粒pBES–MtGH6的枯草芽孢桿菌RIK1285的轉(zhuǎn)化與鑒定。采用平板劃線法活化枯草芽孢桿菌RIK1285，挑取單克隆至2 mL1×MC培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)5 h，將400 μL的培養(yǎng)基放入新的EP管中，加入5 μL的質(zhì)粒pBES–MtGH6，在37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)2 h，5000離心，收集沉淀，留100 μL混勻菌體，涂布于含有卡那霉素的LB平板中，得到攜帶質(zhì)粒pBES–MtGH6的枯草芽孢桿菌RIK1285。引物pBES–MtGH6–F及pBES–MtGH6–R用于菌落PCR驗(yàn)證。

3)攜帶質(zhì)粒pPICZαA–MtGH6的畢赤酵母GS115的轉(zhuǎn)化與鑒定。通過(guò)引物pPICZαA–F和pPICZαA–R克隆載體pPICZαA，再經(jīng)引物pPICZαA–MtGH6–F和pPICZαA–MtGH6–R克隆MtGH6編碼基因，回收獲得的基因片段，使用RI及I酶切回收的基因片段，將酶切產(chǎn)物連接后得到重組質(zhì)粒pPICZαA–MtGH6，再轉(zhuǎn)入Top10感受態(tài)細(xì)胞中。使用含有博萊霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。檢測(cè)無(wú)誤后，將質(zhì)粒pPICZαA–MtGH6導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞中。引物pPICZαA–F和pPICZαA–R用于菌落PCR驗(yàn)證。

1.2.2MtGH6粗酶的表達(dá)及分析

1) MtGH6粗酶在大腸埃希菌中的表達(dá)及分析。將攜帶表達(dá)載體pET21a–MtGH6的大腸埃希菌BL21(DE3)接種于LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL氨芐青霉素)中，運(yùn)用生長(zhǎng)曲線儀測(cè)量其生長(zhǎng)曲線，37 ℃下培養(yǎng)至OD600約0.8。此時(shí)，加入0.5 mmol/L的異丙基硫代–β–D半乳糖苷(IPTG)，30 ℃下孵育48 h，誘導(dǎo)MtGH6的表達(dá)。離心(8000、10 min、4 ℃) 后收集細(xì)胞，在含有20 mmol/L Tris–HCl(pH 7.9)、500 mmol/L NaCl和20 mmol/L咪唑的緩沖液中冰凍超聲裂解細(xì)胞。通過(guò)離心(14 000，30 min，4 ℃)和過(guò)濾(0.22 μm Filter，Millex)，除去沉淀物，得到細(xì)胞提取液，收集上清液，得到粗酶。使用Bradford法測(cè)量其蛋白濃度，計(jì)算其產(chǎn)酶量。

2) MtGH6粗酶在枯草芽孢RIK1285中的表達(dá)及分析。將攜帶表達(dá)載體pBES–MtGH6 的枯草芽孢桿菌RIK1285接種于含有色氨酸、蛋氨酸、賴(lài)氨酸及卡那霉素的TB培養(yǎng)基中，運(yùn)用生長(zhǎng)曲線儀測(cè)量其生長(zhǎng)曲線；30 ℃下孵育48 h，180 r/min離心，收集上清液，往上清液中添加無(wú)水CaCl2至10 g/L，沉淀磷酸鹽，調(diào)pH至7.5，離心(6500、20 min、4 ℃)后收集上清液，緩慢加入硫酸銨至飽和度達(dá)100%，離心回收沉淀，80%丙酮3次洗滌沉淀， Tris–HCl 緩沖液(pH 7.9)重懸沉淀，0.22 μm濾膜過(guò)濾，得到粗酶。采用Bradford法測(cè)量其蛋白濃度，計(jì)算其產(chǎn)酶量。

3) MtGH6粗酶在畢赤酵母GS115中的表達(dá)及分析。將攜帶pPICZαA–MtGH6質(zhì)粒的畢赤酵母GS115接種于5 mL YPD培養(yǎng)基，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)12 h，取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至50 mL BMGY培養(yǎng)基；30 ℃、250 r/min培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，轉(zhuǎn)接于含1.5%甲醇的50 mL BMMY培養(yǎng)基，運(yùn)用生長(zhǎng)曲線儀測(cè)量其生長(zhǎng)曲線，30 ℃、250 r/min再培養(yǎng)84 h后離心分離菌泥與上清液；在上清液中緩慢加入硫酸銨至飽和度達(dá)100%，離心收集沉淀后對(duì)沉淀物進(jìn)行透析。收集透析袋內(nèi)的液體，0.22 μm濾膜過(guò)濾，得到粗酶。采用Bradford法測(cè)量其蛋白濃度，計(jì)算其產(chǎn)酶量。

1.2.3重組蛋白MtGH6的純化

將MtGH6粗酶添加至含有鎳離子填料的層析柱中(His Tagged Protein Purification Kit，康為世紀(jì))，用50 mL 結(jié)合緩沖液 A(含有20 mmol/L Tris–HCl (pH 7.9)、500 mmol/L NaCl、40 mmol/L咪唑)洗滌，以20 mmol/L Tris–HCl (pH 7.9)、500 mmol/L NaCl和200 mmol/L咪唑作為洗脫緩沖液。選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的蛋白膠，采用SDS–PAGE法鑒定純化效果，Bradford法測(cè)量其蛋白濃度，計(jì)算MtGH6的回收率。

1.2.4不同宿主菌生產(chǎn)的MtGH6的酶活性比較

在含有10 mg/mL微晶纖維素的20 mmol/L Tris–HCl緩沖液(pH 7.9)中加入0.1 mL的MtGH6，60 ℃下孵育10 min后，加入1.5倍體積的DNS試劑終止反應(yīng)，混合物煮沸5 min后測(cè)量OD540。纖維素外切酶活性的單位(U)定義為以微晶纖維素為底物，每分鐘釋放1 μmol還原糖的酶的量。

1.2.5MtGH6的酶學(xué)性質(zhì)研究

1) pH和溫度對(duì)MtGH6的影響。為研究溫度對(duì)酶活力的影響，在20～90 ℃的溫度范圍內(nèi)以10 ℃為1個(gè)溫度梯度，測(cè)定MtGH6在不同溫度下的酶活力。為研究pH對(duì)MtGH6酶活性的影響，配置了4種不同pH值的反應(yīng)底物緩沖液：pH 4.0～6.0 的檸檬酸鹽緩沖液、pH 6.0～8.0 的磷酸鹽緩沖液、pH 7.0～9.0 的Tris–HCl緩沖液、pH 8.0～10.0 的甘氨酸–氫氧化鈉緩沖液。在不同pH值的反應(yīng)體系下，分別測(cè)定MtGH6的酶活性。

2) 金屬離子對(duì)MtGH6的影響。在反應(yīng)溶液中分別加入0.5 mmol/L 的MgCl2、CaCl2、MnCl2、FeCl3、CoCl2、ZnCl2、BaCl2，研究不同金屬離子對(duì)MtGH6活性的影響，以未添加金屬離子的樣品為對(duì)照，測(cè)定其相對(duì)酶活力。

3) MtGH6的動(dòng)力學(xué)分析。在最適反應(yīng)條件下，測(cè)定不同質(zhì)量濃度微晶纖維素(2～16 mg/mL)對(duì)酶催化效率的影響，以此來(lái)計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.3　數(shù)據(jù)分析

采用英國(guó)UVItec的凝膠成像系統(tǒng)拍攝核酸及蛋白電泳圖；采用芬蘭百奧斯科林公司的生長(zhǎng)曲線儀FP–1100–C記錄大腸埃希菌BL21、枯草芽孢桿菌RIK1285、畢赤酵母GS115的生物量變化；采用賽默飛世爾科技公司的多功能酶標(biāo)儀Varioskan LUX計(jì)算酶濃度及還原糖的變化；采用Origin 2018 64Bit進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；采用Office 2019繪圖。

2　 結(jié)果與分析

2.1　MtGH6在BL21、RIK1285、GS115中的轉(zhuǎn)化與鑒定結(jié)果

質(zhì)粒pET21a–MtGH6、pBES–MtGH6、pPICZαA–MtGH6的各個(gè)轉(zhuǎn)錄元件見(jiàn)圖1。運(yùn)用NCBI網(wǎng)站中的Blast功能進(jìn)行多序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果符合理論設(shè)計(jì)，分別導(dǎo)入BL21、RIK1285、GS115中，菌落PCR結(jié)果(圖2)顯示成功導(dǎo)入。

圖1　pET21a–MtGH6、pBES–MtGH6及pPICZαA– MtGH6的質(zhì)粒圖譜

1　攜帶重組質(zhì)粒pET21a–MtGH6的大腸埃希菌BL21菌落PCR結(jié)果；2　攜帶重組質(zhì)粒pBES–MtGH6的枯草芽孢桿菌RIK1285菌落PCR結(jié)果；3　重組質(zhì)粒pPICZαA–MtGH6的畢赤酵母GS115的菌落PCR結(jié)果。

2.2 重組蛋白MtGH6在大腸埃希菌BL21、枯草芽孢桿菌RIK1285、畢赤酵母GS115的表達(dá)

2.2.1大腸埃希菌BL21、枯草芽孢桿菌RIK1285、畢赤酵母GS115的生物量變化

使用生長(zhǎng)曲線測(cè)序儀測(cè)得大腸埃希菌BL21、枯草芽孢桿菌RIK1285、畢赤酵母GS115的生長(zhǎng)曲線。從生長(zhǎng)曲線(圖3)可以看出，大腸埃希菌BL21、枯草芽孢桿菌RIK1285在4 h后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而后生物量維持穩(wěn)定，OD600均為1.5；畢赤酵母在接種40 h后生物量又開(kāi)始增加，再經(jīng)過(guò)10 h后保持不變，OD600為2.0。

A　大腸埃希菌BL21的生長(zhǎng)曲線；B　枯草芽孢桿菌RIK1285的生長(zhǎng)曲線；C　畢赤酵母GS115的生長(zhǎng)曲線。

2.2.2大腸埃希菌BL21、枯草芽孢桿菌RIK1285、畢赤酵母GS115生產(chǎn)的MtGH6粗酶的鑒定

使用大腸埃希菌BL21表達(dá)MtGH6，其啟動(dòng)子為T(mén)7強(qiáng)啟動(dòng)子，Lac乳糖操縱子元件添加誘導(dǎo)劑IPTG后可誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)；超聲法破碎后，離心得到粗酶，采用Bradford法測(cè)其濃度為2.70 mg/mL，體積為20 mL，總產(chǎn)酶量為54 mg。SDS–PAGE驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基上清液中無(wú)蛋白表達(dá)，而菌泥破碎后的上清液及沉淀中均有蛋白表達(dá)(圖4–A)。究其原因，可能是破碎不夠徹底，仍有部分蛋白存在于菌泥中；也有可能是蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致包涵體的形成。

以枯草芽孢桿菌RIK1285為表達(dá)宿主，收集上清液，鹽析、洗滌后測(cè)得粗酶的質(zhì)量濃度為1.53 mg/mL，體積為20 mL，總產(chǎn)酶量為30.6 mg?？莶菅挎邨U菌RIK1285菌泥及上清鹽析液的SDS–PAGE結(jié)果(圖4–B)表明MtGH6只存在于上清中。究其原因可能是添加了信號(hào)肽aprE，使枯草芽孢桿菌RIK1285生產(chǎn)的蛋白向培養(yǎng)基中分泌。

畢赤酵母GS115表達(dá)MtGH6時(shí)，其啟動(dòng)子為AOX1，在甲醇的誘導(dǎo)下，生成了大量的MtGH6，將收集的上清液鹽析并透析后，測(cè)得MtGH6的粗酶質(zhì)量濃度為2.76 mg/mL，體積為20 mL，總產(chǎn)酶量為55.2 mg。從畢赤酵母GS115菌泥及培養(yǎng)基上清鹽析液的SDS–PAGE結(jié)果(圖4–C)可以看出，MtGH6以可溶的形式大量存在于上清中。究其原因可能是α因子信號(hào)肽使目標(biāo)酶分泌于培養(yǎng)基中。

泳道1為大腸埃希菌BL21的培養(yǎng)基上清；泳道2為大腸埃希菌的破碎后沉淀；泳道3為大腸埃希菌BL21破碎后的上清；泳道4為枯草芽孢桿菌RIK1285的菌泥；泳道5為枯草芽孢桿菌RIK1285上清的鹽析液；泳道6為畢赤酵母GS115的菌泥；泳道7為畢赤酵母GS115上清鹽析后的透析液。

2.3　由大腸埃希菌BL21、枯草芽孢桿菌RIK1285、畢赤酵母GS115生產(chǎn)的MtGH6純酶鑒定

從表2可以看出，畢赤酵母GS115生產(chǎn)的MtGH6為77 mg/L，大腸埃希菌BL21及枯草芽孢桿菌RIK1285生產(chǎn)的MtGH6分別為56、32 mg/L；畢赤酵母GS115生產(chǎn)的MtGH6回收率為15.40%，大腸埃希菌BL21及枯草芽孢桿菌RIK1285生產(chǎn)的MtGH6回收率分別為10.37%和10.45%。可見(jiàn)，畢赤酵母GS115生產(chǎn)的MtGH6的產(chǎn)量和純化效率都較高。將得到的純酶采用SDS–PAGE法鑒定，測(cè)得MtGH6的表觀相對(duì)分子質(zhì)量為68 000 (圖5)，與理論值相符。

表2　MtGH6的純化參數(shù)

泳道1為大腸埃希菌BL21表達(dá)的MtGH6親和層析分離結(jié)果；泳道2為枯草芽孢桿菌RIK1285表達(dá)的MtGH6親和層析分離結(jié)果；泳道3為畢赤酵母GS115表達(dá)的MtGH6親和層析分離結(jié)果。

2.4 由大腸埃希菌BL21、枯草芽孢桿菌RIK1285、畢赤酵母GS115生產(chǎn)的MtGH6酶活性比較

由于不同表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于MtGH6的修飾及翻譯過(guò)程不同，MtGH6在不同宿主中表達(dá)的酶活性也不一樣。比較(圖6)發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母GS115生產(chǎn)的MtGH6降解微晶纖維素的酶活力最大，為15.60 U/mg，高于枯草芽胞桿菌RIK1285生產(chǎn)的MtGH6的酶活力(10.06 U/mg)及大腸埃希菌BL21生產(chǎn)的MtGH6的酶活力(7.45 U/mg)。不同宿主表達(dá)的MtGH6酶活力方差分析結(jié)果(表3)顯示，值為5.80×10–6，檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量大于檢驗(yàn)臨界值Fcrit。說(shuō)明3種單因素存在顯著性差異，畢赤酵母GS115為MtGH6最優(yōu)的表達(dá)宿主。

圖6　不同宿主菌表達(dá)的MtGH6的酶活力

表3　來(lái)源于不同宿主的MtGH6酶活力的方差分析結(jié)果

2.5　MtGH6的酶學(xué)性質(zhì)分析

MtGH6在不同溫度下的催化速率如圖7所示。從圖7可以看出，其表觀最適溫度為60 ℃，在較寬的溫度范圍(50～70 ℃)下，相對(duì)酶活性仍高于60%。

圖7　不同溫度下MtGH6的酶活性

從圖8可以看出，在酸性環(huán)境下，MtGH6的酶活性較弱，隨著pH值的下降，其酶活性也逐漸減小；其在pH 6～10范圍內(nèi)有著較好的穩(wěn)定性和較高的酶活性，在pH為8的Tris–HCl緩沖液中MtGH6的酶活性最高。

圖8 　不同pH條件下MtGH6的酶活性

酶殘基與二價(jià)金屬離子之間的配合可能會(huì)引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，對(duì)催化速率或其他性質(zhì)產(chǎn)生影響。從圖9可以看出，Mg2+和Ca2+對(duì)酶活性的影響并不顯著。0.5 mmol/L的Fe3+、Zn2+、Ba2+對(duì)反應(yīng)有明顯的抑制作用；0.5 mmol/L的Co2+對(duì)反應(yīng)速率有輕微的促進(jìn)作用；添加Mn2+后，酶活性顯著提高。表明金屬離子在酶促反應(yīng)時(shí)，可作為激活劑，促進(jìn)酶更好地作用于底物。

圖9　不同金屬離子條件下MtGH6的酶活性

依據(jù)不同底物濃度下MtGH6的酶活力，測(cè)定其動(dòng)力學(xué)常數(shù)，結(jié)果如圖10所示。在0.5 mmol/L Mn2+存在下，MtGH6的米氏常數(shù)m和轉(zhuǎn)化數(shù)cat分別為(7.83±3.70) mg/mL、(72.01±29.01)/s?；谶@些參數(shù)，測(cè)定catm值為(14.10±10.37) mL/(mg·s)。同時(shí)，在沒(méi)有 Mn2+的情況下，m、cat和catm值為(7.78±3.08) mg/mL、(37.49±11.77)/s 和(6.43±4.06) mL/(mg·s)，推測(cè) Mn2+能通過(guò)提高催化效率而不是底物親和力來(lái)增加 MtGH6的酶活力。

圖10　MtGH6在不同底物濃度下的比活力

3　結(jié)論與討論

在現(xiàn)代生物技術(shù)高速發(fā)展的背景下，纖維素酶由于能水解β–1，4糖苷鍵，能將纖維素高分子材料變?yōu)樾》肿犹穷?lèi)，在實(shí)際生產(chǎn)及生活中具有重要作用。分子生物學(xué)的出現(xiàn)使得利用異源宿主進(jìn)行蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合體的過(guò)度表達(dá)成為可能。大腸埃希菌具有極快的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，可以獲得高細(xì)胞密度，且培養(yǎng)基和試劑價(jià)格低廉，表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化簡(jiǎn)單[9]。枯草芽孢桿菌能夠利用各種信號(hào)肽非特異性地分泌重組蛋白，與革蘭陰性菌宿主相比優(yōu)勢(shì)明顯[10]。畢赤酵母可以生長(zhǎng)到非常高的細(xì)胞密度，具有可用且受?chē)?yán)格調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子，因而被廣泛用于生物制藥和工業(yè)酶的生產(chǎn)[11]。

本研究中，以糖苷水解酶MtGH6為研究對(duì)象，構(gòu)建了質(zhì)粒pET21a–MtGH6、pBES–MtGH6、pPICZαA–MtGH6，選取大腸埃希菌BL21、枯草芽孢桿菌RIK1285及畢赤酵母GS115作為工程菌對(duì)MtGH6進(jìn)行了異源表達(dá)及分離純化，并對(duì)表達(dá)MtGH6的3個(gè)宿主菌的生長(zhǎng)狀況、產(chǎn)酶量、純化回收率、酶活力等參數(shù)進(jìn)行了比較分析。

生物量方面，大腸埃希菌BL21及枯草芽孢桿菌RIK1285在生長(zhǎng)穩(wěn)定后，OD值維持在1.5，而畢赤酵母GS115生長(zhǎng)穩(wěn)定后，OD值維持在2.0，表明畢赤酵母GS115的生長(zhǎng)狀況更好，更有利于產(chǎn)酶。造成此現(xiàn)象的原因可能是BMMY培養(yǎng)基較LB培養(yǎng)基及TB培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分更豐富。

產(chǎn)酶量方面，畢赤酵母GS115生產(chǎn)的MtGH6為77 mg/L，大腸埃希菌BL21及枯草芽孢桿菌RIK1285生產(chǎn)的MtGH6分別為56、32 mg/L，產(chǎn)酶量因選用啟動(dòng)子不同而有所差異。研究[12]表明，枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖可成功表達(dá)一些異源基因，但存在蛋白質(zhì)產(chǎn)量低的缺點(diǎn)，限制了其應(yīng)用潛力，本研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一現(xiàn)象。大腸埃希菌BL21和畢赤酵母GS115采用的是強(qiáng)啟動(dòng)子T7啟動(dòng)子和AOX1啟動(dòng)子，所以產(chǎn)酶量高于枯草芽孢桿菌RIK1285；而大腸埃希菌BL21是一種致病細(xì)菌，含有內(nèi)毒素(脂多糖)，易形成包涵體[13]，作為表達(dá)宿主有其局限性，從SDS–PAGE結(jié)果可看出其在沉淀?yè)p失了許多：因此，從產(chǎn)量及蛋白損失情況看，畢赤酵母GS115表達(dá)MtGH6具有顯著優(yōu)勢(shì)。

純化回收率方面，畢赤酵母GS115生產(chǎn)的MtGH6回收率為15.40%，大腸埃希菌BL21及枯草芽孢桿菌RIK1285生產(chǎn)的MtGH6回收率分別為10.37%和10.45%，說(shuō)明畢赤酵母生產(chǎn)的蛋白中MtGH6所占比重更高，誘導(dǎo)效果更好。

酶活力方面，由畢赤酵母GS115表達(dá)的MtGH6的酶活力為15.60 U/mg，由大腸埃希菌BL21及枯草芽孢桿菌RIK1285表達(dá)的MtGH6分別為7.45、10.06 U/mg，說(shuō)明畢赤酵母GS115是MtGH6的最優(yōu)表達(dá)宿主。究其原因可能是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有獨(dú)特的翻譯后修飾功能，由其分泌的重組蛋白MtGH6相較于其他2種表達(dá)系統(tǒng)的酶活力更高。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外不斷有新型的纖維素酶被挖掘與研究。ISLAM等[14]篩選到芽孢桿菌、芽孢桿菌、氣單胞菌，測(cè)得所產(chǎn)的纖維素酶的最適溫度皆為40 ℃，最適pH值為7。楊麗娜等[15]從腐爛秸稈與腐殖質(zhì)土壤樣品中分離出的纖維素降解菌芽孢桿菌屬()微生物NP29所產(chǎn)纖維素酶的反應(yīng)最適pH為4.5，最佳反應(yīng)溫度為65 ℃；楊力權(quán)等[16]從稻草堆肥中篩選得到一株產(chǎn)高溫纖維素酶的木霉屬菌株M1，其所產(chǎn)纖維素酶的最適反應(yīng)pH為4.4，最適反應(yīng)溫度為75 ℃。本研究中，由畢赤酵母GS115表達(dá)的MtGH6，其降解微晶纖維素的最適pH為8.0，相較于上述纖維素酶，其在較寬的pH范圍(pH 6～10)內(nèi)維持著較高的酶活性。

堿法是木質(zhì)纖維素的預(yù)處理方法之一[17]。楊俊換等[18]在油茶籽殼發(fā)酵產(chǎn)羧甲基纖維素酶的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，使用了堿法來(lái)對(duì)油茶籽殼進(jìn)行預(yù)處理。MtGH6在堿性環(huán)境中的高活性，使其能夠減少原材料經(jīng)堿法預(yù)處理后的中和成本。本研究中，MtGH6作用于微晶纖維素的最適溫度為60 ℃，且在50～70 ℃ 溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定性較高。在大規(guī)模微生物發(fā)酵產(chǎn)酶過(guò)程中，通常使用蒸汽法對(duì)原材料進(jìn)行滅菌，而MtGH6適應(yīng)于高溫環(huán)境，能大大減少原材料的冷卻成本。此外，在工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)酶過(guò)程中，常需要添加微量元素，以調(diào)節(jié)微生物代謝活動(dòng)。本研究結(jié)果表明，添加Co2+和Mn2+能增強(qiáng)MtGH6的酶活力，而Mg2+和Ca2+對(duì)MtGH6的酶活力無(wú)干擾，F(xiàn)e3+和Zn2+及Ba2+對(duì)MtGH6的酶活力有明顯的抑制作用：因此，如需大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)MtGH6，應(yīng)避免Fe3+和Zn2+及Ba2+的添加。

綜上所述，由畢赤酵母GS115表達(dá)的MtGH6具備優(yōu)良的耐熱性，在較寬的pH范圍內(nèi)維持著較高的酶活性，添加Mn2+能顯著提高M(jìn)tGH6的酶活力，推測(cè)MtGH6在生物燃料生產(chǎn)中可能具有較好的應(yīng)用前景。

[1] CHANG C C，LI R D．Agricultural waste[J]．Water Environment Research，2019，91：1150–1167．

[2] FATMA S，HAMEED A，NOMAN M，et al. Lignocellulosic biomass：a sustainable bioenergy source for the future[J]．Protein and Peptide Letters，2018，25(2)：148–163．

[3] KUCHARSKA K，RYBARCZYK P，HO?OWACZ I，et al．Pretreatment of lignocellulosic materials as substrates for fermentation processes[J]．Molecules，2018，23(11)：2937．

[4] SRIVASTAVA N，RATHOUR R，JHA S，et al. Microbial beta glucosidase enzymes：recent advances in biomass conversation for biofuels application[J]. Biomolecules，2019，9(6)：220．

[5] CAPOLUPO L，F(xiàn)ARACO V．Green methods of lignocellulose pretreatment for biorefinery development[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2016，100 (22)：9451–9467．

[6] BOMBLE Y J，BECKHAM G T，MATTHEWS J F，et al. Modeling the self-assembly of the cellulosome enzyme complex[J]．The Journal of Biological Chemistry，2011，286(7)：5614–5623．

[7] ENGER M D，SLEEPER B P．Multiple cellulase system from[J]．Journal of Bacteriology，1965，89(1)：23–27．

[8] TUAN L Q A．Rational protein design for enhancing thermal stability of industrial enzymes[J]．Engineering and Technology，2020，8(1)：3–17．

[9] FERNáNDEZ F J，VEGA M C．Choose a suitable expression host：a survey of available protein production platforms[J]．Advances in Experimental Medicine and Biology，2016，896：15–24．

[10] GU Y，XU X H，WU Y K，et al．Advances and prospects ofcellular factories：from rational design to industrial applications[J]．Metabolic Engineering，2018，50：109–121．

[11] TüRKANO?LU ?Z?ELIK A，Y?LMAZ S，INAN M.promoters[J]．Methods in Molecular Biology (Clifton，N．J.)，2019，1923：97–112．

[12] LI W F，ZHOU X X，LU P．Bottlenecks in the expression and secretion of heterologous proteins in[J]．Research in Microbiology，2004，155(8)：605–610．

[13] BHATWA A，WANG W，HASSAN Y I，et al. Challenges associated with the formation of recombinant protein inclusion bodies inand strategies to address them for industrial applications[J]．Frontiers in Bioengineering and Biotechnology，2021，9：630551．

[14] ISLAM F，ROY N．Screening，purification and characterization of cellulase from cellulase producing bacteria in molasses[J]．BMC Research Notes，2018，11(1)：445．

[15] 楊麗娜，楊明明，龔月生．產(chǎn)耐熱性纖維素酶菌株的分離·鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(14)：8103–8105．

[16] 楊力權(quán)，周連廣，陳貴元，等．一株產(chǎn)高溫纖維素酶菌株的篩選、鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J]．中國(guó)飼料，2019(11)：40–44．

[17] 何士成，彭太兵，孫曼鈺，等．堿處理中溫度對(duì)不同底物特性木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)及酶解的影響[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(21)：292–296．

[18] 楊俊換，郭華，歐陽(yáng)晶．用響應(yīng)面法優(yōu)化油茶籽殼發(fā)酵產(chǎn)羧甲基纖維素酶的條件[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014，40(4)：416–420．

Heterologous expression and enzymatic properties of a novel glycoside hydrolase

XU Longwei，YONG Jie，ZHOU Haiyan*

(College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China)

In order to obtain the optimal expression host of MtGH6, we used plasmid pET21a-MtGH6,pBES-MTGH6 and pPICZαA-MtGH6 to express the MtGH6 by use ofBL21、RIK1285 andGS115. The growth status, enzyme production, purification efficiency and enzyme activity of the three host bacteria expressing MtGH6 were compared and analyzed. The results showed that the OD valueBL21 andRIK1285 remained at 1.5 after stable growth, while that ofGS115 remained at 2.0 after stable growth. MtGH6 produced byGS115 was 77 mg/L, and the purification recovery was 15.40%. The enzyme production and purification recovery were higher than those produced byBL21 andRIK1285. The enzyme activity of MtGH6 expressed byGS115 was 15.60 U/mg, and the activity of MtGH6 expressed byBL21 andRIK1285 was 7.45 U/mg and 10.06 U/mg, respectively, indicating thatGS115 was the optimal host for MtGH6 expression. The enzyme properties of MtGH6 secreted byGS115 were studied. The results showed that the optimum pH and temperature of this enzyme were 8.0 and 60 ℃, and the addition of 0.5 mmol/L Mn2+could increase its activity, indicating that MTGH6 had a good application prospect in the production of biofuels.

glucoside hydrolase; heterologous expression; host bacteria; enzymatic property

Q556+.2

A

1007-1032(2022)06-0650-09

徐龍威，雍婕，周海燕．一種新型糖苷水解酶的異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2022，48(6)：650–658．

XU L W，YONG J，ZHOU H Y．Heterologous expression and enzymatic properties of a novel glycoside hydrolase[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2022，48(6)：650–658．

http://xb.hunau.edu.cn

2022–03–08

2022–11–24

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)“雙一流”建設(shè)工程(SYL201802002)

徐龍威(1997—)，男，湖南長(zhǎng)沙人，碩士研究生，主要從事微生物學(xué)研究，xlwhnau1101@163.com ；*通信作者，周海燕，博士，教授，主要從事蛋白質(zhì)工程、微生態(tài)研究，sws001@163.com

10.13331/j.cnki.jhau.2022.06.004

責(zé)任編輯：毛友純

英文編輯：柳正