張前進(jìn),曹麗茹,馬晨晨,龐蕓蕓,葉飛宇,魯曉民

玉米基因的分子特性、克隆和響應(yīng)干旱脅迫的表達(dá)分析

張前進(jìn),曹麗茹,馬晨晨,龐蕓蕓,葉飛宇,魯曉民*

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所, 河南 鄭州 450002

胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白是一類富集在種子胚發(fā)育后期的脫水保護(hù)蛋白，在抵御干旱、高鹽等逆境脅迫中發(fā)揮著重要的作用。本文克隆了一個(gè)胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白基因，該基因含有876 bp的開放閱讀框，編碼了291個(gè)氨基酸，屬于親水性蛋白。蛋白進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)ZmLEA34蛋白與高粱的同源關(guān)系最近，且同一位置具有相同的保守基序；順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)該基因含有多個(gè)響應(yīng)逆境脅迫、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光信號(hào)等結(jié)合位點(diǎn)；qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基因?qū)儆诮M成型表達(dá)基因，在胚、根、葉中表達(dá)量較高，基因在根和葉中受干旱脅迫的誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，且抗旱玉米自交系鄭36中的表達(dá)量始終高于B73，推測(cè)該基因其表達(dá)量與材料的耐旱性呈顯著正相關(guān)。研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示基因的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

玉米; 組成型表達(dá); 抗旱性

玉米（.L）是世界上主要的糧食作物之一，種植面積比較廣泛，其產(chǎn)量居各糧食作物之首[1]。但隨著自然災(zāi)害的頻繁發(fā)生，對(duì)玉米產(chǎn)量造成了不小的損失，尤其是干旱脅迫[2]。我國是農(nóng)業(yè)大國，玉米是我國十分重要的糧食作物、飼料作物和工業(yè)原料，但大部分玉米主產(chǎn)區(qū)存在水資源短缺嚴(yán)重、蒸發(fā)量較大等的問題，再加上極端干旱天氣頻發(fā)，導(dǎo)致玉米減問題日益突出。因此，對(duì)玉米抗旱機(jī)理的分子研究，來提高玉米的產(chǎn)量和保障糧食安全具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

植物胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant proteins，LEA)是一類龐大、多樣化的蛋白，主要定位在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中[3]。在棉花胚胎發(fā)育后期的子葉中LEA蛋白首次被發(fā)現(xiàn)，之后在玉米[4]、擬南芥[5]、水稻[6]、小麥[7]等植物中同樣發(fā)現(xiàn)了LEA蛋白的存在，發(fā)現(xiàn)LEA蛋白在維持植物正常生長發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮著十分重要作用?；蚩杀幻撀渌岷透鞣N非生物脅迫等如干旱，滲透脅迫等的誘導(dǎo)表達(dá)。在玉米中ZmLEA3蛋白在滲透和氧化脅迫下通過保護(hù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和結(jié)合金屬來保護(hù)植物免受傷害[8]；編碼了一個(gè)LEA家族蛋白，是一種正向抗旱性的調(diào)控因子，的過表達(dá)增加了ABA的敏感性，增強(qiáng)了水稻耐旱性[9]；過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱能力和耐鹽性[10]。過表達(dá)OsLEA3-2蛋白能改善鹽和干旱條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥和水稻的生長[11]；在大豆中LEA蛋白基因積極響應(yīng)鹽和滲透脅迫，研究發(fā)現(xiàn)該基因在擬南芥中過表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽和滲透脅迫的耐受能力[12]。

植物在面臨干旱脅迫時(shí)體內(nèi)的生理生化指標(biāo)會(huì)發(fā)生一定的變化，而抗氧化反應(yīng)是干旱脅迫最終的反應(yīng)之一，在干旱脅迫下作物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，活性氧的積累使細(xì)胞受到嚴(yán)重的傷害，從而導(dǎo)致代謝功能紊亂[13]。目前，在干旱脅迫等逆境中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等酶活性的變化在植物中已經(jīng)被廣泛作為生理生化指標(biāo)[14]。在相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)水分脅迫下玉米的抗旱性與SOD、POD、CAT等保護(hù)酶的活性呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，且抗旱性強(qiáng)的品種中SOD、POD、CAT等保護(hù)酶的活性較高[15]；干旱脅迫下小麥干物質(zhì)積累量降低，抗氧化酶活性隨著干旱程度的增強(qiáng)而增加[16]；和的表達(dá)水平隨著小麥干旱條件的變化而發(fā)生改變尤其在嚴(yán)重干旱時(shí)表達(dá)量顯著增強(qiáng)[17]。

本文利用實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)基因在正常生長條件和干旱脅迫下相對(duì)表達(dá)量差異達(dá)到極顯著的水平。對(duì)基因的生物信息學(xué)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并從玉米中克隆了基因的開放閱讀框，對(duì)ATG前2 000 bp啟動(dòng)子元件進(jìn)行分析，通過熒光定量PCR分析該基因在各組織中的表達(dá)情況以及非生物脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因積極響應(yīng)干旱脅迫。該研究結(jié)果為進(jìn)一步對(duì)玉米的抗旱機(jī)制的探究奠定了分子基礎(chǔ)，也為抗逆育種提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與處理

利用鄭36和B73兩個(gè)自交系作為實(shí)驗(yàn)材料，挑選出籽粒飽滿的種子種植在營養(yǎng)土中，并用Hoagland's營養(yǎng)液澆灌，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（光照培養(yǎng)30 ℃，16 h；黑暗培養(yǎng)26 ℃，8 h；相對(duì)濕度約35%～55%）。當(dāng)玉米苗長至三葉一心時(shí)，開始對(duì)長勢(shì)一致的玉米進(jìn)行20% PEG-6 000脅迫處理，分別對(duì)脅迫0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h的玉米苗的根和葉隨機(jī)進(jìn)行取樣，每3個(gè)樣品等量混合作為1個(gè)重復(fù)，各取3個(gè)重復(fù)；對(duì)正常生長和20% PEG-6 000脅迫5 d的葉片進(jìn)行取樣，每5株為1個(gè)樣品，取6個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分別用于進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析和生理生化指標(biāo)的測(cè)定，將樣品迅速放入液氮中，并在-80 ℃超低溫冰箱中保存。以及對(duì)鄭36的根、莖、葉、雄穗、雌穗、胚、胚乳組織進(jìn)行取樣，對(duì)基因的不同組織進(jìn)行特異性的表達(dá)分析。

1.2 ZmLEA34基因的克隆

利用NCBI網(wǎng)站BLAST基因（）的CDS序列，設(shè)計(jì)特異性引物（ZmLEA34-F：CCAGCGGTGATCTGTAGTAGC；ZmLEA34-R：CTTCAGAGTCCAGGACACGC）對(duì)基因進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增的產(chǎn)物與T載進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑出陽性單克?。ú簧儆?個(gè)）送到華大測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序的結(jié)果與Maize GDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)。

1.3 ZmLEA34基因的生物信息分析

利用ExPASy ProtParam 軟件在線分析ZmLEA34蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性和疏水性等；利用TMHMM分析跨膜螺旋區(qū)；利用SOPMA進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用NetPhoS在線預(yù)測(cè)蛋白磷酸化位點(diǎn)；利用BLASTP對(duì)ZmLEA34蛋白的其他物種同源序列進(jìn)行搜索，DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)，軟件MEGA6.1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用MEME分析蛋白的保守基序進(jìn)行，最大基序值設(shè)置為10；利用PlantCARE對(duì)啟動(dòng)子元件進(jìn)行分析。

1.4 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR數(shù)據(jù)處理

利用RNA提取試劑盒（EasyPure RNA Purification Kit）抽提玉米的總RNA，用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并放在-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。根?jù)基因序列設(shè)計(jì)熒光定量引物（ZmLEA34-F：GAGACGAGGACAAGGCCAC；ZmLEA34-R：TCGTTCCTGTTGCGGTTCTC），并利用玉米18S（18S-F：CCTGCGGCTTAATTGACTC；18S-R：GTTAGCAGGCTGAGGTCTGG）作為內(nèi)參，利用熒光定量試劑盒（SYBR Premix Ex Taq TM）上的實(shí)驗(yàn)操作在CFX96實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀進(jìn)行qRT-PCR分析，每個(gè)樣品3次重復(fù)，相對(duì)表達(dá)量利用2^-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

1.5 生理生化指標(biāo)的測(cè)定方法

超氧化物歧化酶SOD活性利用氮藍(lán)四唑法測(cè)定；過氧化物酶POD活性利用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定；過氧化氫酶CAT的活性利用紫外吸收法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下不同玉米生理生化指標(biāo)的測(cè)定

前人研究中，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下玉米的抗旱性與抗氧化酶的活性呈正相關(guān)。本研究利用鄭36和B73兩個(gè)自交系為實(shí)驗(yàn)材料，在苗期時(shí)進(jìn)行干旱脅迫，對(duì)抗氧化酶活性進(jìn)行測(cè)定。發(fā)現(xiàn)干旱脅迫后這兩個(gè)材料的超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物歧化酶（POD）活性和過氧化氫酶（CAT）的活性均顯著提高（圖1），但鄭36抗氧化酶活性提高幅度遠(yuǎn)高于B73，說明鄭36抗旱能力比B73強(qiáng)。

圖1 干旱脅迫下ZmLEA34基因生理指標(biāo)測(cè)定

2.2 ZmLEA34基因的鑒定

實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)玉米三葉期幼苗進(jìn)行干旱脅迫處理，取玉米葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并分析基因的FPKM值和功能注釋，發(fā)現(xiàn)基因在正常生長條件和干旱脅迫下差異達(dá)到極顯著的水平。另對(duì)玉米葉片中基因進(jìn)行qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)該基因在干旱脅迫后相對(duì)表達(dá)量顯著提高，這與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果是一致的（圖2），因此表明了基因在玉米響應(yīng)干旱脅迫過程中發(fā)揮著十分重要的作用。

圖2 ZmLEA34基因的qRT-PCR

RPKM：每百萬個(gè)比對(duì)上的reads中比對(duì)到外顯子的每1 000個(gè)堿基上的片段個(gè)數(shù)

RPKM: Number of fragments per 1 000 bases of an exon matched in reads per million alignments

2.3 ZmLEA34基因的克隆

利用RT-PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行擴(kuò)增，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳得到了一條大小約為900 bp的條帶（圖3）。通過條帶回收和連接載體，并挑選出陽性的單克隆，將菌液送到測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這個(gè)序列是一個(gè)完整的876 bp的開放閱讀框，編碼了291個(gè)氨基酸，這與B73的序列是一致的。

圖3 ZmLEA34基因PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

M. 2 000 bp DNA Marker; 1.

2.4 ZmLEA34基因的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy ProtParam軟件對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ZmLEA34的相對(duì)分子質(zhì)量約為28.41kDa，理論等電點(diǎn)為4.51，分子式為C1 196H1 923N373O42S5；不穩(wěn)定系數(shù)為32.77，屬于穩(wěn)定性蛋白；脂肪系數(shù)為70.76；利用ProtScale在線分析GRAVY值大小為-0.209，屬于親水性蛋白；通過對(duì)PHD跨膜螺旋區(qū)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，不是跨膜蛋白；利用SOPMA對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，顯示該蛋白無規(guī)則卷曲占比45.02%，α螺旋占40.21%，β折疊占6.78%，主要以無規(guī)則卷曲為主（表1）。NetPhoS在線分析顯示ZmLEA34蛋白包含5個(gè)絲氨酸和7個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)，表明該蛋白很有可能被絲氨酸和蘇氨酸激酶激活，調(diào)控其響應(yīng)基因，參與植物生長發(fā)育過程、逆境脅迫過程等。

表1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

2.5 玉米ZmLEA34蛋白進(jìn)化樹分析

利用BLAST在線軟件對(duì)ZmLEA34蛋白的同源序列進(jìn)行搜索，選擇同源性較高的其他物種的蛋白序列。利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)玉米ZmLEA34蛋白與高粱的同源關(guān)系最近，同源度高達(dá)95%，其次是芒草、洋槐，與狗尾草和畫眉草親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4）。為了進(jìn)一步對(duì)ZmLEA34蛋白和同源蛋白的保守性進(jìn)行分析，利用在線軟件MEME對(duì)10個(gè)保守基序進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)玉米不僅與高粱的同源性高，而且在氨基酸相同位置含有相同的保守基序，說明了物種之間的同源性越高，保守基序就越相似，之間的關(guān)系也就越親近。

圖4 ZmLEA34蛋白與其他物種同源蛋白的進(jìn)化樹及保守基序分析

2.6 ZmLEA34基因啟動(dòng)子元件分析

為了進(jìn)一步探究基因潛在的調(diào)控機(jī)制，利用Plantcare分析基因啟動(dòng)子區(qū)域2 000 bp進(jìn)行順式元件調(diào)控分析（表2）。發(fā)現(xiàn)有多種啟動(dòng)子響應(yīng)元件，有CAAT-box、TATA-box、A-box等啟動(dòng)子基本的元件，還含有G-Box、ACE、ABRE、CGTCA-motif、LTR等結(jié)合位點(diǎn)。ABRE參與脫落酸反應(yīng)，在ABA信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用，響應(yīng)干旱脅迫；LTR是低溫應(yīng)激相關(guān)元件；CGTCA-motif、TGACG-motif等參與茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑；還有ACE、G-box、GA-motif等大量的光反應(yīng)響應(yīng)元件。因此推測(cè)基因除了應(yīng)對(duì)非生物脅迫外，還參與調(diào)控植物開花和光合作用等。

表2 ZmLEA34基因啟動(dòng)子順式元件分析

2.7 ZmLEA34基因在玉米不同組織中的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步了解基因的在玉米組織中的表達(dá)模式，對(duì)玉米的根、莖、葉、雄穗、雌穗、胚和胚乳進(jìn)行qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)基因在這些組織中均有所表達(dá)，但相對(duì)表達(dá)量有較大差異（圖5）。其中在胚中的表達(dá)量最高，其次是葉和根，但在雌穗和胚乳中相對(duì)表達(dá)量極低。說明基因是組成型表達(dá)基因，在不同組織中相對(duì)表達(dá)量有顯著差異，在玉米的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著十分重要的作用。

圖5 ZmLEA34基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

2.8 ZmLEA34基因響應(yīng)干旱脅迫的表達(dá)模式分析

為揭示基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式，對(duì)玉米抗旱自交系鄭36和旱敏感性自交系B73的根和葉的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)基因隨著干旱時(shí)間增長，相對(duì)表達(dá)量逐步升高，且在干旱脅迫48 h時(shí)，在根和葉片中的表達(dá)量均達(dá)到了最大，鄭36與B73中的表達(dá)量相差倍數(shù)分別為1.7倍和2.3倍（圖6）。結(jié)果表明基因相對(duì)表達(dá)量的高低與材料的抗旱能力存在著密切聯(lián)系，推測(cè)相對(duì)表達(dá)量越高，材料的抗旱性就越強(qiáng)。

圖6 ZmLEA34基因表達(dá)模式分析

2.9 ZmLEA34蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)

為探究基因可能存在的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，利用STRING在線預(yù)測(cè)ZmLEA34蛋白的互作蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與ZmLEA34的互作蛋白主要有胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白、3’,5’二磷酸核苷酸酶、腺嘌呤核苷酸α水解酶家族蛋白、tRNA鳥?；D(zhuǎn)移酶1、質(zhì)膜膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、RNA結(jié)合家族蛋白。這些結(jié)構(gòu)域主要參與植物細(xì)胞的生長發(fā)育、次生代謝物的合成與降解、以及響應(yīng)植物非生物脅迫等整個(gè)植物的生長過程。因此推測(cè)ZmLEA34蛋白與互作蛋白協(xié)同構(gòu)建一張網(wǎng)絡(luò)，來調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過程等。

表3 ZmLEA34基因的互作蛋白預(yù)測(cè)

3 討論

玉米是世界上重要的糧食作物、飼料作物和加工原料，在我國的糧食安全和人民的增收中發(fā)揮著非常重要的作用。近年來，隨著氣候溫度的升高，非生物脅迫發(fā)生的頻率逐漸增多，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到全球糧食安全。干旱是主要影響農(nóng)作物產(chǎn)量的因素之一，其造成的玉米減產(chǎn)成為迫切解決的問題。因此抗旱基因的挖掘，抗旱機(jī)制的解析，抗旱種質(zhì)資源的篩選，從分子的層面來探究植物的抗旱能力，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究克隆了一個(gè)胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白基因，對(duì)ZmLEA34蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲和α螺旋為主，且屬于親水性蛋白，這與大多數(shù)LEA蛋白結(jié)構(gòu)是一致[18,19]；對(duì)該蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹和保守基序進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ZmLEA34蛋白具有較高的保守性，且ZmLEA34蛋白與高粱的同源性最高，這與Nagaraju M的研究結(jié)果是一致的[20]；對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域順式元件分析，得到了低溫、脫落酸、茉莉酸響應(yīng)等相關(guān)的順式作用元件，有實(shí)驗(yàn)研究表明這些順式元件在基因響應(yīng)非生物脅迫中起著十分重要的作用。高粱、上游啟動(dòng)子區(qū)域含有與干旱和ABA 響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件MYC、ABRE[21]，但也并不能說明含有這些順式作用元件一定能夠響應(yīng)非生物脅迫，這需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。為進(jìn)一步了解基因的表達(dá)模式，對(duì)玉米的各個(gè)組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，發(fā)現(xiàn)是組成型表達(dá)基因，且在胚、葉和根中的表達(dá)量較高，這與前人研究只在胚中高表達(dá)是不一致的[22]，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了我們所克隆到的基因與其他的 LEA基因有明顯不同特點(diǎn)；LEA蛋白是一種功能蛋白，通過大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，其主要的功能特征是基因能夠響應(yīng)低溫、干旱等多種非生物脅迫[23]?；蛟诓煌魑镏械谋磉_(dá)趨勢(shì)不同，過表達(dá)基因可以增強(qiáng)農(nóng)作物對(duì)逆境脅迫的耐受性。的過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草（）和酵母對(duì)干旱脅迫和低溫脅迫的耐受能力[24]?？梢栽诟鞣N非生物脅迫中表達(dá)，在高鹽、滲透脅迫和氧化脅迫中高表達(dá)，過表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)滲透脅迫的抗性[8]；過表達(dá)LEA基因能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)水分脅迫的耐受能力[25]。干旱條件下，過表達(dá)的擬南芥的耐旱能力強(qiáng)于野生型，且嚴(yán)重缺水時(shí)，AtLEA4蛋白的積累比野生型更加敏感[26]。在鹽和干旱生長條件下，過表達(dá)基因可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥和水稻的生長[27]；基因的誘導(dǎo)表達(dá)增強(qiáng)了小麥的的耐鹽和耐旱性[28]；基因在不同植物的組織中均有所表達(dá)，且該基因在擬南芥[29]和甘薯[30]中過表達(dá)提高了對(duì)鹽的耐受力。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)基因隨著干旱脅迫時(shí)間增長，表達(dá)量逐漸增高，在48 h時(shí)達(dá)到高峰，并與玉米的抗旱性存在正相關(guān)性，自交系鄭36的表達(dá)量始終高于B73，且增長幅度遠(yuǎn)高于B73，說明基因與材料的抗旱能力存在著密切聯(lián)系，后續(xù)可以通過該基因的過表達(dá)研究其提高玉米耐旱性的作用機(jī)理，為抗逆玉米新品種的選育提供理論基礎(chǔ)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)基因在正常和干旱脅迫下相對(duì)表達(dá)量達(dá)到極顯著差異水平。本文對(duì)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆诮M成型表達(dá)的基因，在胚、根和葉中高表達(dá)；進(jìn)化樹分析，ZmLEA34蛋白與高粱的同源性最高，且保守基序相似度也高，進(jìn)化關(guān)系最近；干旱脅迫下，基因在抗旱玉米自交系鄭36中的表達(dá)量始終高于B73，推測(cè)其表達(dá)量與玉米的抗旱性存呈正相關(guān)；并通過蛋白互作網(wǎng)站預(yù)測(cè)，或許該基因與其他基因協(xié)同調(diào)控玉米干旱脅迫的過程。該研究結(jié)果為進(jìn)一步確定基因在逆境脅迫中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為抗逆育種提供了新思路。

[1] 陸偉婷,于歡,曹勝男,等.近20年黃淮海地區(qū)氣候變暖對(duì)夏玉米生育進(jìn)程及產(chǎn)量的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,48(16):3132-3145

[2] 李瑞雪,周榮,蘇雪強(qiáng),等.干旱對(duì)植物的影響及植物干旱適應(yīng)性反應(yīng)研究進(jìn)展——以桑樹為例[J].廣西蠶業(yè),2021,58(4):29-37

[3] Candat A, Paszkiewicz G, Neveu M,. The ubiquitous distribution of late embryogenesis abundant proteins across cell compartments in Arabidopsis offers tailored protection against abiotic stress [J]. Plant Cell. 2014,26(7):3148-3166

[4] Amara I, Odena A, Oliveira E,. Insights into Maize LEA proteins: from proteomics to functional approaches [J]. Plant & cell physiology, 2012,53(2):312-329

[5] Hundertmark M, Hincha DK. LEA ( Late Embryogenesis Abundant ) proteins and their encoding genes in[J]. BMC Genom, 2008,9(1):118-120

[6] Wang XS, Zhu HB, Jin GL,. Genome-scale identification and analysis of LEA genes in rice (L.) [J]. Plant Science: An International Journal of Experimental Plant Biology, 2007,172(2):414-420

[7] Bhattacharya S, Dhar S, Banerjee A,. Structural, functional, and evolutionary analysis of late embryogenesis abundant proteins (LEA) in Triticum aestivum: A detailed molecular level biochemistry using in silico approach [J]. Computational Biology and Chemistry, 2019,82:9-24

[8] 劉洋.玉米LEA蛋白基因，和的分離與功能分析[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2014

[9] Yu J, Lai YM, Wu X,. Overexpression ofencoding a group I LEA protein confers enhanced drought tolerance in rice [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2016,478(2):703-709

[10] Huang LP, Zhang MY, Jia J,. An atypical late embryogenesis abundant proteinplays a positive role in ABA-induced antioxidant defense inL [J]. Plant & cell physiology, 2018,59(5):916-929

[11] Duan JL, Cai WM., an abiotic stress induced gene of rice plays a key role in salt and drought tolerance [J]. PLoS ONE, 2017,7(9):e45117

[12] Sun MZ, Shen Y, Yin KD,. A late embryogenesis abundant proteininteracts with a receptor like cytoplasmic kinase GsCBRLK and regulates environmental stress responses [J]. Plant Science, 2019,283:70-82

[13] Blokhina O, Virolainen E, Fagerstedt KV. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress:a review [J]. Annals of Botany (London), 2003,91:179-194

[14] 鄭世英,商學(xué)芳,余曉帥,等.鹽脅迫下不同鹽敏感型玉米抗氧化酶活性的變化[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,42(1):1-5

[15] 李廣敏,唐連順,商振清,等.滲透脅迫對(duì)玉米幼苗保護(hù)酶系統(tǒng)的影響及其與抗旱性的關(guān)系[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1994,17(2):1-5

[16] 袁蕊,李萍,胡曉雪,等.干旱脅迫對(duì)小麥生理特性及產(chǎn)量的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(10):1446-1449,1466

[17] Luna CM, Pastori GM, Driscoll S,. Drought controls on H2O2accumulation, catalase (CAT) activity and CAT gene expression in wheat [J]. J Exp Bot. 2005,56(411):417-423

[18] Tunnacliffe A, Wise MJ. The continuing conundrum of the LEA proteins [J]. Die Naturwissenschaften, 2007,94(10):791-812

[19] Battaglia M, Olvera-Carrillo Y, Garciarrubio A,. The enigmatic LEA proteins and other Hydrophilins [J]. Plant Physiology, 2008,148(1):6-24

[20] Nagaraju M, Kumar SA, Reddy PS,. Genome-scale identification, classification, and tissue specific expression analysis of late embryogenesis abundant (LEA) genes under abiotic stress conditions inr L. [J]. PloS one, 2019,14(1):e0209980

[21] 王震,杜小云,劉文,等.高粱LEA基因家族的鑒定及表達(dá)分析[J].生物資源,2019,41(4):324-334

[22] Walley JW, Sartor RC, Shen Z,. Integration of omic networks in a developmental atlas of maize [J]. Science, 2016,353(6301):814-818

[23] Kosová K, Vítámvás P, Prá?il IT. Wheat and barley dehydrins under cold, drought, and salinity--what can LEA-II proteins tell us about plant stress response? [J]. Frontiers in Plant Science, 2014,5:343

[24] Liu Y, Wang L, Jiang S,. Group 5 LEA protein,, enhance tolerance to osmotic and low temperature stresses in transgenic tobacco and yeast [J]. Plant Physiology Biochemisty, 2014,84:22-31

[25] Amara I, Capellades M, Ludevid MD,. Enhanced water stress tolerance of transgenic maize plants over-expressing LEAgene [J]. Journal of Plant Physiology, 2013,170(9):864-873

[26] Olvera-Carrillo Y, Campos F, Reyes JL,. Functional analysis of the group 4 late embryogenesis abundant proteins reveals their relevance in the adaptive response during water deficit in Arabidopsis [J]. Plant physiology, 2010,154(1):373-790

[27] Duan J, Cai W, Park S., an abiotic stress induced gene of rice plays a key role in salt and drought tolerance [J]. Plos One, 2012,7(9):e45117

[28] Habib I, Shahzad K, Rauf M,.Dehydrin responsivedriven inducible gene expression enhanced salt and drought tolerance in wheat [J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2022,180:124-133

[29] Jia FJ, Qi SD, Li H,. Overexpression of Late Embryogenesis Abundant 14 enhancessalt stress tolerance [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2014,454(4):505-511

[30] Park SC, Kim YH, Jeong JC,. Sweetpotato late embryogenesis abundant 14 () gene influences lignification and increases osmotic- and salt stress-tolerance of transgenic calli [J]. Planta, 2011,233(3):621-634

Molecular Characteristics, Cloning and Expression Analysis ofGene in Maize in Response to Drought Stress

ZHANG Qian-jin, CAO Li-ru, MA Chen-chen, PANG Yun-yun, YE Fei-yu, LU Xiao-min*

450002,

Late embryogenesis abundant proteins is a kind of dehydrating protective protein enriched in late embryo development, which plays an important role in resistingdrought, high salt and other stresses. In this paper, we cloned a protein-rich genein late embryonic development. The gene contains an 876 bp open reading frame and codes 291 amino acids, which is a hydrophilic protein. The analysis of protein evolutionary tree showed that ZmLEA34 had the closest homology relationship with sorghum, and had the same conserved motif in the same location. Cis-acting element analysis showed that the gene contained multiple binding sites in response to stress, plant hormone signal transduction and light signal. The results of qRT-PCR showed thatwas a constitutive expression gene, with a high expression level in embryo, root and leaf. ZmLEA34 was significantly up-regulated in roots and leaves under drought stress, and the expression level of drought-resistant maize inbred line Zheng 36 was always higher than that in B73. It was speculated that the expression level of this gene was significantly and positively related to the drought tolerance of the materials. The results lay a foundation for further revealing the mechanism ofgene.

Maize; constitutive expression; drought tolerance

S513

A

1000-2324(2022)05-0665-08

2022-09-14

2022-12-10

河南省重大科技專項(xiàng)-子課題:玉米關(guān)鍵性狀優(yōu)異基因挖掘與新品種選育(221100110300);中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金:玉米抗旱遺傳機(jī)制解析與種質(zhì)創(chuàng)制(Z20221343040)

張前進(jìn)(1973-),男,碩士研究生,副研究員,主要從事玉米遺傳育種研究. E-mail:zqjin@126.com

通訊作者:Author for correspondence. E-mail:luxiaomin2004@163.com