劉夢(mèng)夢(mèng)，郭 寧,*，劉雨昊，朱兆亮

(1.山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250101；2.中建八局第一建設(shè)有限公司，山東濟(jì)南 250101)

抗生素作為一種常用的藥物活性物質(zhì)被廣泛用于人類(lèi)及動(dòng)植物的疾病預(yù)防和治療中。研究[1]表明，30%～90%的抗生素通過(guò)人或動(dòng)物排泄物的形式釋放到環(huán)境中?？股氐拈L(zhǎng)期存在及不斷積累，會(huì)給生態(tài)系統(tǒng)及人類(lèi)健康帶來(lái)嚴(yán)重的潛在威脅。而傳統(tǒng)的活性污泥工藝對(duì)抗生素的去除效果并不佳[2-3]。

近期的研究[4-5]表明硝化污泥系統(tǒng)可以有效地促進(jìn)多種抗生素的去除。例如，Batt等[6]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)甲氧芐啶在硝化活性污泥中去除率可高達(dá)50%，而在傳統(tǒng)活性污泥中去除率僅為1%左右。另外，抗生素的存在不可避免地會(huì)對(duì)微生物施加選擇性壓力，導(dǎo)致微生物群落變化，進(jìn)而影響反應(yīng)器的性能。例如，Li等[7]通過(guò)考察發(fā)現(xiàn)，序批式反應(yīng)器中不同濃度的諾氟沙星對(duì)CODCr和氨氮存在不同程度的抑制作用，并且不同濃度的諾氟沙星對(duì)微生物的多樣性和豐富度均有影響。Deng等[8]在研究序批式反應(yīng)器中的抗生素鏈霉素[(3 955±1 910)μg/L]對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)影響時(shí)總結(jié)，污水處理系統(tǒng)可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)菌、古細(xì)菌和真核生物的組成以應(yīng)對(duì)高濃度抗生素的壓力，從而維持反應(yīng)器的正常運(yùn)行。因此，探究抗生素選擇壓力下系統(tǒng)運(yùn)行性能和微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)提高污水處理工藝的穩(wěn)定性和整體性能具有重要的理論和實(shí)際意義。目前，抗生素對(duì)硝化污泥系統(tǒng)運(yùn)行性能和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響仍不明確。

本研究選取廣泛應(yīng)用的磺胺甲惡唑(SMX)為研究對(duì)象，考察硝化污泥系統(tǒng)對(duì)抗生素的去除效果，分析抗生素對(duì)硝化污泥系統(tǒng)運(yùn)行性能的影響，并重點(diǎn)探討不同濃度抗生素對(duì)微生物量及微生物群落結(jié)構(gòu)分布的影響，以期為提高污水處理系統(tǒng)的運(yùn)行性能及抗生素的有效去除提供合理的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 污泥來(lái)源及主要試劑

原始污泥取自濟(jì)南光大水務(wù)公司二沉池的回流污泥。SMX(CAS:723-46-6，C10H11N3O3S)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海麥克林公司，甲醇、乙酸均為高效液相色譜級(jí)，其他普通化學(xué)試劑等均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 污泥馴化

本試驗(yàn)采用好氧曝氣，逐步提高氨氮負(fù)荷的方式進(jìn)行污泥馴化。馴化污泥的裝置如圖1所示。整個(gè)馴化過(guò)程均由時(shí)控開(kāi)關(guān)控制，有效體積為12 L，排水比為1∶1，反應(yīng)周期為6 h，每天運(yùn)行4個(gè)周期，包括好氧進(jìn)水(30 min)、曝氣(270 min)、沉淀(30 min)、出水(10 min)、靜置(20 min)。馴化過(guò)程中定期排泥，保持污泥質(zhì)量濃度在4 000 mg/L左右。反應(yīng)過(guò)程控制DO質(zhì)量濃度為2.5～3.0 mg/L，pH值為7.5～8.5。定期測(cè)定進(jìn)出水的CODCr濃度、氨氮濃度、亞硝態(tài)氮濃度、硝態(tài)氮濃度。污泥馴化過(guò)程中詳細(xì)的進(jìn)出水參數(shù)如圖2～圖3所示。馴化過(guò)程中系統(tǒng)出水穩(wěn)定，CODCr去除率達(dá)90%以上，氨氮基本被完全去除且沒(méi)有亞硝態(tài)氮的積累，表明硝化污泥馴化完成。其中模擬廢水組分及質(zhì)量濃度分別為：CH3COONa為320、480、640 mg/L；NH4Cl為190、290、380 mg/L；K2HPO4為58 mg/L；KH2PO4為24 mg/L；CaCl2·H2O為67 mg/L；MgSO4·7H2O為42 mg/L；EDTA-2Na為42 mg/L；NaHCO3為1 000 mg/L；FeCl3·6H2O為30 mg/L；H3BO3為3 mg/L；CuSO4·5H2O為0.6 mg/L；KI為0.6 mg/L；NaMoO4·2H2O為1.2 mg/L；MnCl·4H2O為2.4 mg/L；ZnSO4·7H2O為2.4 mg/L；CoCl2·6H2O為3 mg/L。

圖1 污泥馴化裝置示意圖Fig.1 Schematic Diagram of Sludge Acclimation Unit

圖2 污泥馴化過(guò)程中反應(yīng)器CODCr的去除性能變化Fig.2 Changes of CODCr Removal Performance of the Reactor during Sludge Acclimation

圖3 污泥馴化過(guò)程中反應(yīng)器的脫氮性能變化Fig.3 Change of Denitrification Performance of the Reactor during Sludge Acclimation

1.2.2 硝化污泥系統(tǒng)性能研究

本試驗(yàn)在3個(gè)完全相同的SBR反應(yīng)器中進(jìn)行，SBR反應(yīng)器有效體積為4 L。接種污泥來(lái)自上述馴化過(guò)的硝化污泥，污泥質(zhì)量濃度在4 000 mg/L左右，污泥體積指數(shù)(SVI)為65%，具有良好的硝化活性和沉降性能。反應(yīng)器采用與污泥馴化階段一樣的工況參數(shù)，進(jìn)水CODCr質(zhì)量濃度控制在500 mg/L左右，氨氮質(zhì)量濃度控制在100 mg/L左右。3個(gè)反應(yīng)器投加不同質(zhì)量濃度的抗生素，分別為0.1、1.0、10.0 mg/L，保證其他的操作條件和進(jìn)水水質(zhì)不變。系統(tǒng)投加SMX運(yùn)行30 d后，在反應(yīng)周期內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)(0、1、2、3、4、5 h)測(cè)定出水中SMX濃度，以考察系統(tǒng)中SMX的去除效能，同時(shí)為了考察污泥對(duì)SMX的吸附，對(duì)反應(yīng)5 h時(shí)污泥中SMX濃度進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算其污泥吸附率[9]。通過(guò)SMX的質(zhì)量守恒，計(jì)算SMX的污泥吸附率Q、生物降解率R，計(jì)算如式(1)～式(2)，并測(cè)定出水中的CODCr及氨氮濃度，用于考察不同濃度的SMX對(duì)硝化污泥系統(tǒng)中CODCr去除及氨氧化進(jìn)程的影響。

Q=C污泥/C進(jìn)水×100%

(1)

R=[1-(C污泥+C出水)/C進(jìn)水]×100%

(2)

其中：C污泥——污泥中SMX的質(zhì)量濃度，mg/L；

C進(jìn)水——進(jìn)水中SMX的質(zhì)量濃度，mg/L；

C出水——出水中SMX的質(zhì)量濃度，mg/L。

1.2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

系統(tǒng)運(yùn)行30 d后，分別取3個(gè)反應(yīng)器的污泥樣本800 μL，用DNA提取試劑盒(TIANamp soil DNA Kit，天根)提取總DNA，利用Illumina NovaSeq平臺(tái)(諾禾致源基因公司)，進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序，以分析硝化污泥系統(tǒng)中不同SMX濃度條件下的微生物量及微生物群落結(jié)構(gòu)。為了測(cè)定微生物群落結(jié)構(gòu)，選擇16S rRNA 基因的V4～V5可變區(qū)作為測(cè)序區(qū)域，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，相應(yīng)的引物序列如表1所示。其中，16S rRNA 基因是基于RDP 分類(lèi)軟件(http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)，利用GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)(http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi)進(jìn)行注釋。

1.3 分析方法

CODCr采用重鉻酸鉀滴定法測(cè)定；氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮分別采用國(guó)標(biāo)法中的鈉氏試劑分光光度法、紫外分光光度、分光光度法進(jìn)行測(cè)定；抗生素樣品經(jīng)0.22 μmol/L濾膜過(guò)濾后利用高效液相色譜儀(日本，島津)進(jìn)行分析，流動(dòng)相比例為甲醇∶1‰乙酸=9∶1，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)結(jié)束后根據(jù)其峰值計(jì)算樣品中的SMX濃度。

利用qPCR對(duì)16S rRNA進(jìn)行定量，在Applied biosystem Q1系統(tǒng)上進(jìn)行，qPCR的反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性 5 min、94 ℃變性 30 s、60 ℃ 退火 30 s、72 ℃ 延伸 1 min，39 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

圖4 不同濃度SMX下系統(tǒng)對(duì)SMX的去除Fig.4 Removal of SMX in the System under Different Concentrations of SMX

2 結(jié)果與討論

2.1 SMX的去除

如圖4所示，本研究探究了批次試驗(yàn)中，硝化污泥系統(tǒng)對(duì)不同質(zhì)量濃度的SMX(0.1、1.0、10.0 mg/L)的去除。質(zhì)量濃度為0.1、1.0、10.0 mg/L下，SMX的去除速率分別為0.019、0.193、1.927 mg/(L·h),5 h后的去除率分別為93.60%、91.54%、89.22%。結(jié)果表明，SMX在3個(gè)反應(yīng)器的去除率均能達(dá)到90%左右，這說(shuō)明硝化污泥系統(tǒng)能夠有效去除SMX，并且去除速率隨SMX濃度的升高而升高，這可能是因?yàn)槲勰鄬?duì)較高濃度的SMX吸附速率較快。

如圖5所示，3個(gè)反應(yīng)器中反應(yīng)5 h后SMX的污泥吸附率分別為33.3%、31.2%、30.1%，生物降解率為60.3%、60.3%、59.1%。該結(jié)果表明SMX的去除主要依靠生物降解，這與文獻(xiàn)[10-11]中的結(jié)果一致。硝化污泥系統(tǒng)中的氨氧化細(xì)菌和功能細(xì)菌共同促進(jìn)了SMX的去除，具體分析見(jiàn)2.3.4小節(jié)。

圖5 系統(tǒng)對(duì)SMX的吸附率和生物降解率Fig.5 Adsorption Rate and Biodegradation Rate of SMX in the System

2.2 SMX對(duì)硝化污泥系統(tǒng)性能的影響

2.2.1 SMX對(duì)CODCr去除的影響

如圖6所示，探究了批次試驗(yàn)中不同濃度SMX對(duì)CODCr去除的影響。在0、0.1、1.0、10.0 mg/L SMX質(zhì)量濃度條件下，CODCr的去除速率和5 h后的去除率分別為100.80、95.39、95.93、91.27 mg/(L·h)和95.76%、92.98%、94.90%、92.50%。值得注意的是，系統(tǒng)經(jīng)過(guò)30 d的運(yùn)行，即使在10.0 mg/L的SMX質(zhì)量濃度下，CODCr的去除率仍高達(dá)92%。同樣，吳偉民[13]在研究SMX馴化的不同污泥系統(tǒng)對(duì)CODCr去除情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，在10 mg/L SMX硝化污泥系統(tǒng)中，CODCr的去除率能高達(dá)90.20%?？梢?jiàn)，硝化污泥系統(tǒng)能夠較好適應(yīng)SMX的壓力沖擊。

2.2.2 SMX對(duì)氨氧化進(jìn)程的影響

不同濃度SMX下系統(tǒng)的氨氧化進(jìn)程如圖7所示。0、0.1、1.0、10.0 mg/L SMX質(zhì)量濃度下氨氮的去除速率分別為20.78、20.56、20.50、19.67 mg/(L·h),5 h后的去除率分別為99.99%、99.53%、98.02%、95.11%。與未加SMX系統(tǒng)相比，0.1、1.0 mg/L SMX下系統(tǒng)的氨氮去除速率和去除率沒(méi)有明顯變化，而10.0 mg/L SMX對(duì)氨氮去除的影響較大。這主要是因?yàn)檩^高濃度的SMX會(huì)對(duì)系統(tǒng)中硝化細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，這與楊騰飛等[14]的研究結(jié)果一致。雖然不同濃度SMX對(duì)氨氧化進(jìn)程有一定程度的影響，但SMX濃度的增加并未顯著影響氨氮的去除率，氨氮去除率均高于95%。這說(shuō)明硝化污泥系統(tǒng)抗SMX沖擊負(fù)荷能力較強(qiáng)，與CODCr去除的結(jié)論一致。

圖7 不同濃度SMX下系統(tǒng)對(duì)氨氧化進(jìn)程的影響Fig.7 Effect of the System on the Process of Ammonia Oxidation under Different Concentrations of SMX

2.3 SMX對(duì)硝化污泥系統(tǒng)中微生物群落的影響

2.3.1 微生物量的變化

研究[12]表明，16S rRNA可代表總微生物量。本研究對(duì)硝化污泥系統(tǒng)中不同SMX壓力下的16S rRNA基因拷貝數(shù)進(jìn)行了測(cè)定。如圖8所示，隨著SMX濃度的增多，硝化污泥系統(tǒng)中微生物量呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢(shì)，未投加SMX的硝化污泥系統(tǒng)中16S rRNA的基因濃度最高達(dá)到2.47×109copies/μL。這說(shuō)明抗生素SMX抑制了系統(tǒng)中微生物的活性，從而導(dǎo)致微生物量的減少，并且抗生素SMX的濃度越高，對(duì)硝化污泥系統(tǒng)中微生物的毒性越大。

圖8 不同濃度SMX下系統(tǒng)中16S rRNA濃度的變化Fig.8 Changes of 16S rRNA Concentration in the System under Different Concentrations of SMX

2.3.2 Alpha多樣性指數(shù)分析

利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)硝化污泥樣本進(jìn)行了Alpha多樣性分析，分析結(jié)果如表2所示。Alpha多樣性包括OTUs、Shannon、Simpson、Chao1、ACE等多種指數(shù)，可以多角度反映樣品中微生物群落多樣性的差異情況[15]。由表2可知，OTUs、Shannon、Simpson指數(shù)均呈現(xiàn)隨著抗生素SMX濃度增大而減小的趨勢(shì)，抗生素SMX直接影響了硝化污泥中微生物群落的多樣性和均勻度。這時(shí)SMX持續(xù)產(chǎn)生選擇性壓力，無(wú)法耐受SMX的微生物逐漸死亡，導(dǎo)致多樣性的減少。由Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)可知，0.1、1.0 mg/L SMX系統(tǒng)中的微生物群落相對(duì)豐度要高于其他系統(tǒng)，并且1.0 mg/L SMX系統(tǒng)中微生物群落相對(duì)豐度最高，10.0 mg/L SMX系統(tǒng)中最低。這是因?yàn)榻?jīng)過(guò)一段時(shí)間的馴化，適宜濃度的SMX可以提高系統(tǒng)中微生物群落的豐富度。而SMX濃度過(guò)高，導(dǎo)致一些微生物無(wú)法適應(yīng)而死亡，造成微生物豐富度的降低。

表2 Alpha多樣性指數(shù)Tab.2 Alpha Diversity Indices

2.3.3 門(mén)水平上的菌群變化

系統(tǒng)中微生物在門(mén)水平上的種類(lèi)和相對(duì)豐度如圖9所示。在各硝化污泥樣本中變形菌門(mén)(Proteobacteria)是相對(duì)豐度最高的菌門(mén)，占50%以上。該結(jié)果說(shuō)明SMX的投加及其濃度變化并未對(duì)Proteobacteria的相對(duì)豐度產(chǎn)生顯著影響。研究[16-17]表明，Proteobacteria含有能夠降解芳香族污染物的細(xì)菌，在活性污泥中具有極為重要的作用，是常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)菌。擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)是不同SMX濃度的污泥樣本中另外一種優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其豐度隨著抗生素濃度的升高而不斷升高。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是由于Bacteroidota中大多數(shù)細(xì)菌為化能自養(yǎng)型，它們能夠降解復(fù)雜的有機(jī)物，SMX濃度的提高為它們提供了足夠的碳源和能源。綜上，在不同抗生素SMX壓力下，硝化污泥系統(tǒng)中微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化。

圖9 不同SMX濃度樣本中門(mén)水平上菌群的相對(duì)豐度Fig.9 Relative Abundance of Microorganisms in Samples with Different SMX Concentration at Phylum Level

2.3.4 屬水平上的菌群變化

微生物菌群在屬水平上相對(duì)豐度的變化如圖10所示。由圖10可知，抗生素SMX濃度越高，其對(duì)微生物群落的影響越大。亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、unidentified_Nitrospiraceae、球衣菌屬(Sphaerotilus)、動(dòng)膠菌屬(Zoogloea)、噬氫菌屬(Hydrogenophaga)的相對(duì)豐度在0.1、1.0 mg/L的SMX的硝化污泥樣本中較高，Nitrosomonas、Nitrospiraceae是常見(jiàn)的氨氧化細(xì)菌，其分泌的氨單加氧酶可以共代謝降解多種抗生素[5,18-19]，Sphaerotilus、Zoogloea、Hydrogenophaga均有降解有毒物質(zhì)和有機(jī)物的能力[20-21]。因此，氨氧化細(xì)菌(Nitrosomonas、Nitrospiraceae)和優(yōu)勢(shì)菌(Sphaerotilus、Zoogloea、Hydrogenophaga)共同促進(jìn)了0.1、1.0 mg/L SMX的去除。而在10.0 mg/L SMX的污泥樣本中，氨氧化細(xì)菌豐度較低，這與上述10.0 mg/L的SMX影響氨氧化進(jìn)程結(jié)果一致(圖7)。另外，優(yōu)勢(shì)菌屬[陶厄氏菌屬(Thauera)、固氮弧菌屬(Azoarcus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)]隨著SMX濃度的增大，其相對(duì)豐度呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。研究[22]發(fā)現(xiàn)Thauera能夠降解芳香族污染物，Azoarcus可以代謝苯系污染物，而SMX是一種含有芳香結(jié)構(gòu)的抗生素，推測(cè)Thauera和Azoarcus是一種SMX降解菌。Flavobacterium可以降解多種抗菌藥物，其可能對(duì)磺胺類(lèi)抗生素也存在一定的降解能力。因此，Thauera、Azoarcus、Flavobacterium的富集使10.0 mg/L的SMX得到高效去除。

圖10 不同SMX濃度樣本中屬水平上菌群的相對(duì)豐度Fig.10 Relative Abundance of Microorganisms in Samples with Different SMX Concentration at Phylum Level

3 結(jié)論

(1)硝化污泥系統(tǒng)能夠有效去除SMX，不同濃度SMX(0.1、1.0、10.0 mg/L)的去除率均能達(dá)到90%左右。其中，SMX主要是通過(guò)生物降解去除的。

(2)不同濃度SMX系統(tǒng)中CODCr和氨氮的去除率均高于90%，硝化污泥系統(tǒng)抗SMX沖擊負(fù)荷能力較強(qiáng)。

(3)不同SMX壓力會(huì)顯著地影響硝化污泥系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)。Proteobacteria和Bacteroidota是不同污泥樣本中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，氨氧化細(xì)菌(Nitrosomonas、unidentified_Nitrospiraceae)和優(yōu)勢(shì)菌(Sphaerotilus、Zoogloea、Hydrogenophaga)共同促進(jìn)了0.1、1.0 mg/L SMX的去除，而Thauera、Azoarcus、Flavobacterium的富集使10.0 mg/L的SMX得到高效去除。