張廣濤，包厚天，黃衛(wèi)和，彭輝武，喻方圓*

(1.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.江西省萍鄉(xiāng)市林業(yè)科學(xué)研究所，江西 萍鄉(xiāng) 337000)

烏桕(Sapiumsebiferum)為大戟科(Euphorbiaceae)烏桕屬(Sapium)落葉喬木，在我國(guó)已有1 400多年的栽培歷史[1-2]。烏桕材質(zhì)優(yōu)良，樹(shù)干高大，可作木材，其根、皮、葉均可作藥用[3]；烏桕種子總出油率>40%，且種子油的運(yùn)動(dòng)黏度、十六烷值和廢氣排放物均符合生物柴油生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，是我國(guó)四大木本油料樹(shù)種之一[4-5]。烏桕外觀季相變化豐富，秋葉由綠變黃、紅或紫，觀賞價(jià)值很高[6]。目前關(guān)于烏桕的研究主要集中在秋葉變色、品種選育和育苗技術(shù)等方面[6-8]，在苗木生產(chǎn)中存在的主要問(wèn)題是生長(zhǎng)速度慢、苗木質(zhì)量參差不齊、造林效果不好。而苗木施肥是培育優(yōu)質(zhì)苗木、提高苗木質(zhì)量的有效措施[9]。N素作為植物不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素之一，缺少或過(guò)多都會(huì)造成養(yǎng)分脅迫，對(duì)植物的生長(zhǎng)造成抑制，研究植物生長(zhǎng)過(guò)程中的合理施N有重要的意義[10]。

一般容器苗生長(zhǎng)規(guī)律呈S形，生長(zhǎng)前期慢，速生期速度加快，后期達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)，這與Logistic生長(zhǎng)模型相適應(yīng)[11]。但目前傳統(tǒng)等量施肥法很難滿足苗木生長(zhǎng)各階段對(duì)養(yǎng)分的需求，通過(guò)大量試驗(yàn)研究，均發(fā)現(xiàn)指數(shù)施肥方法能明顯促進(jìn)苗木的生長(zhǎng)、增加營(yíng)養(yǎng)吸收利用效率[12-13]。指數(shù)施肥基于穩(wěn)態(tài)養(yǎng)分理論[14]，是根據(jù)植物生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)養(yǎng)分需求量的變化，以指數(shù)增加的方式給苗木施肥，養(yǎng)分供給速率和苗木生長(zhǎng)速率相吻合，使苗木體內(nèi)養(yǎng)分含量達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)、苗木養(yǎng)分消耗達(dá)到奢侈水平，最終形成養(yǎng)分高效荷載[15]。國(guó)內(nèi)最早對(duì)指數(shù)施肥理論進(jìn)行研究的是賈慧君等[16-17]。進(jìn)入21世紀(jì)后，國(guó)內(nèi)對(duì)指數(shù)施肥技術(shù)的研究先后涉及到了側(cè)柏(Platycladusorientalis)、馬尾松(Pinusmassoniana)、長(zhǎng)白落葉松(Larixolgensis)、西南樺(Betulaalnoides)、沉香(Aquilariasinensis)等[18-22]。雖然國(guó)內(nèi)對(duì)指數(shù)施肥研究報(bào)道逐漸增多，但對(duì)烏桕育苗的指數(shù)施肥研究尚未見(jiàn)報(bào)道。由于近幾年烏桕苗木需求旺盛，故如何改進(jìn)施肥技術(shù)，提高苗木養(yǎng)分利用效率，降低生產(chǎn)成本成為亟待解決的問(wèn)題。本文以當(dāng)年生烏桕容器苗為試驗(yàn)材料，設(shè)置傳統(tǒng)施肥和指數(shù)施肥處理，分別測(cè)定了不同N素施肥處理對(duì)烏桕容器苗營(yíng)養(yǎng)元素濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)、積累量和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量的影響，旨在篩選出烏桕容器苗培育的最佳施肥方法和施氮量，為烏桕容器苗的合理施肥和科學(xué)培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在南京林業(yè)大學(xué)下蜀林場(chǎng)育苗基地進(jìn)行，該林場(chǎng)位于江蘇省句容市境內(nèi)(119°14′E，31°59′N)，屬于北亞熱帶季風(fēng)氣候，干濕寒暑四季分明，光照充足，水熱資源豐富，具有發(fā)展林業(yè)生產(chǎn)的良好條件。

1.2 試驗(yàn)材料

2019年4月將烏桕種子(上海林業(yè)總站提供)播種于32穴穴盤(pán)并置于溫室苗床中，待其生長(zhǎng)至5月中旬，選取生長(zhǎng)狀況相對(duì)一致的烏桕實(shí)生苗630株移栽于規(guī)格為15 cm×20 cm(上口徑×高)的無(wú)紡布袋中，試驗(yàn)基質(zhì)為泥炭∶珍珠巖∶有機(jī)肥=7∶2∶1，按體積比充分均勻混合，以保證初始養(yǎng)分含量一致。待緩苗至6月初移至室外，進(jìn)行施肥試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用傳統(tǒng)施肥和指數(shù)施肥2種施肥模式，以不施肥為對(duì)照，共7組處理，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)為30株烏桕苗。傳統(tǒng)施肥采用等量施肥法，每周施1次，公式如下：

NT=TNt

(1)

式中:NT為施N總量，Nt為第t次施肥量，T為施肥周數(shù)(T=15)。指數(shù)施肥每周施肥量采用以下公式計(jì)算

NT=NS(erT-1)

(2)

式中:NT為總施氮量；NS為幼苗施肥前的初始含氮量；T為總施肥次數(shù)(T=15)；r是N素相對(duì)增加率。

Nt=NS(erT-1)-Nt-1

(3)

式中:Nt為第t次施氮量，Nt-1為(t-1)次前施N量總和。通過(guò)測(cè)定測(cè)得幼苗初始含氮量NS=17.81 mg·株-1。

參考萬(wàn)志兵等[23]對(duì)烏桕苗木進(jìn)行30 g·m-2的N肥施用得到的較好結(jié)果，經(jīng)過(guò)計(jì)算和對(duì)指數(shù)施肥梯度設(shè)置的考慮，設(shè)定傳統(tǒng)施肥設(shè)置為600 mg·株-1(總施氮量)，用C600表示；指數(shù)施肥設(shè)置了5個(gè)氮素梯度，分別為200、400、600、800、1 000 mg·株-1(總施氮量)，該次試驗(yàn)用Z200、Z400、Z600、Z800、Z1 000表示；不施肥的處理為對(duì)照，用CK表示。本試驗(yàn)采用水溶施肥法，每次用注射器施入20 mL溶液，每周施肥量見(jiàn)表1，施肥間隔為1周，共施15次肥。施用的N肥為尿素(N≥46.4%)。為了維持養(yǎng)分平衡，在施N的同時(shí)，模擬常規(guī)施肥，試驗(yàn)中適當(dāng)補(bǔ)充了P、K肥。其中P肥為過(guò)磷酸鈣(P2O5≥12%)，K肥為硫酸鉀(氧化鉀≥50%)，各施200 mg·株-1(總施用量)。試驗(yàn)期間共施P、K肥5次，施肥間隔周期為3周，每次施入40 mg·株-1，所有處理保證一致。9-10月減少灌溉量以利于苗木木質(zhì)化。11月初，對(duì)苗木進(jìn)行破壞取樣。每處理每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取9株苗木，用水小心沖洗掉根系周?chē)幕|(zhì)，并用蒸餾水潤(rùn)洗 2 次，然后將苗木的根、莖、葉剪開(kāi)，把不同植株的根、莖、葉分別裝入自封袋形成混合樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.4 指標(biāo)測(cè)定方法

將烘干的根、莖、葉分別均勻放入粉碎機(jī)打碎成粉末，過(guò)0.25 mm網(wǎng)篩后，置于干燥器中。采用凱式法測(cè)定全N含量，鉬銻抗比色法測(cè)定全P含量，火焰分光光度計(jì)法測(cè)定全K含量(LY/T 1269-1999和LY/T 1270-1999)?？扇苄蕴呛亢偷矸酆康臏y(cè)定采用蒽酮比色法[24]。其中，各指標(biāo)每個(gè)處理測(cè)定3次，取平均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2013對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析及Duncan多重比較檢驗(yàn)差異性。

表1 烏桕容器苗不同指數(shù)施肥水平每周施氮肥量

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施N處理對(duì)烏桕容器苗營(yíng)養(yǎng)元素濃度的影響

2.1.1 對(duì)烏桕容器苗全N濃度的影響 由表2可知，不同施肥均顯著地增加了烏桕容器苗根、莖和葉中的N素濃度，其中根、莖和葉中的N濃度，相比對(duì)照組分別提高了55.7%～93.5%、50.6%～83.1%和26.9%～70.2%。且指數(shù)施肥處理下，烏桕容器苗根、莖、葉各器官中N濃度隨施N量的增加均呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。在Z600處理下，根、莖、葉中的氮濃度均顯著高于其他處理，且依次是C600的1.16、1.13倍和1.28倍。由此可見(jiàn)，施N能促進(jìn)烏桕容器苗根、莖、葉中N濃度的提升，指數(shù)施肥600 mg·株-1是促進(jìn)烏桕容器苗根、莖、葉氮濃度提高的最佳施氮量。

表2 不同施N處理對(duì)烏桕容器苗不同器官N濃度的影響

2.1.2 對(duì)烏桕容器苗全P濃度的影響 由表3可知，各施肥處理下的烏桕容器苗根、莖、葉中的P濃度均顯著低于對(duì)照，各施肥處理下的根、莖和葉中P濃度比對(duì)照分別降低了13.9%～27.4%、4.1%～20.6%和7.1%～22.4%，說(shuō)明施N對(duì)烏桕容器苗各器官中P濃度的增加有抑制作用。且指數(shù)施肥處理下烏桕容器苗根和葉中的P濃度隨施N量的增加而減少，莖中P濃度隨施N量的增加出現(xiàn)了先增后減的趨勢(shì)。

表3 不同施N處理對(duì)烏桕容器苗不同器官P濃度的影響

2.1.3 對(duì)烏桕容器苗全K濃度的影響 由表4可知，各施肥處理下的烏桕容器苗根中的K濃度顯著低于對(duì)照(P<0.05)，降低了10.5%～38.3%，說(shuō)明施N對(duì)其造成抑制作用；不同施肥處理烏桕容器苗地上部分、地下部分以及植株總體的N積累量有明顯差異，其中Z600處理的烏桕容器苗各部分的N積累量顯著地大于其他處理(P<0.05)。

2.2 不同施N處理對(duì)烏桕容器苗營(yíng)養(yǎng)元素積累量的影響

營(yíng)養(yǎng)元素積累量是各器官的營(yíng)養(yǎng)元素含量和其生物量的乘積。由表5可知，烏桕容器苗N積累量總體表現(xiàn)為：地上部分>地下部分。不同施肥處理烏桕容器苗地上部分、地下部分以及植株總體的N積累量有明顯差異，其中Z600處理的烏桕容器苗各部分的N積累量顯著地大于其他處理(P<0.05)。指數(shù)施肥條件下，不管是地上部分、地下部分還是植株總體的氮積累量都隨施N量的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，且均在Z600處理下達(dá)到最大值，分別是2 438.93、1 358.74 mg·株-1和3 797.67 mg·株-1，分別是對(duì)照的4.36、3.76倍和4.13倍。說(shuō)明適量施N能有效提高氮素積累量，過(guò)量施N則會(huì)產(chǎn)生抑制作用。相同施肥量條件下，處理Z600氮積累量大于C600，地上部分、地下部分和植株總體分別是C600的1.40、1.50倍和1.43倍。多重比較結(jié)果表明，無(wú)論地上部分、地下部分還是植株總體，各施肥處理的N積累量都明顯高于對(duì)照，說(shuō)明施肥對(duì)烏桕容器苗N素的積累有促進(jìn)作用，且指數(shù)施肥的N素積累量要高于傳統(tǒng)施肥。

表4 不同施N處理對(duì)烏桕容器苗不同器官K濃度的影響

烏桕容器苗P積累量總體表現(xiàn)為：地上部分>地下部分。不同施肥處理烏桕容器苗地上部分、地下部分以及植株總體的磷積累量有明顯差異，其中Z600處理的烏桕容器苗各部分P積累量顯著地大于其他處理。指數(shù)施肥條件下，無(wú)論是地上部分、地下部分還是植株總體的P積累量都是隨施N量的增加出現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，且最大值都出現(xiàn)在Z600處，分別是43.45、22.69 mg·株-1和66.14 mg·株-1，是對(duì)照的2.19、1.53倍和1.91倍，說(shuō)明適量施N能有效提高P積累量。相同施肥量條件下，處理Z600磷積累量大于C600，地上部分、地下部分和植株總體分別是C600的1.41、1.25倍和1.35倍。多重比較結(jié)果表明，無(wú)論地上部分、地下部分還是植株總體，各施肥處理組的P積累量都高于對(duì)照，說(shuō)明施肥對(duì)烏桕容器苗P素的積累有促進(jìn)作用。

烏桕容器苗K積累量總體表現(xiàn)為：地上部分>地下部分。不同施肥處理烏桕容器苗地上部分、地下部分以及植株總體的鉀積累量有明顯差異，Z600處理下的烏桕容器苗各部分的K積累量顯著地大于其他處理。指數(shù)施肥條件下，無(wú)論地上部分、地下部分還是植株總體的K積累量都是隨施N量的增加出現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，且最大值都出現(xiàn)在Z600處，分別是129.28、111.05 mg·株-1和240.32 mg·株-1，是對(duì)照的3.01、1.52倍和2.07倍，說(shuō)明適量施N能有效提高K積累量，過(guò)多則會(huì)產(chǎn)生抑制作用。相同施肥量條件下，處理Z600鉀積累量大于C600，地上部分、地下部分和植株總體分別是C600的1.43、1.52倍和2.07倍。多重比較結(jié)果表明，施N肥對(duì)烏桕容器苗K含量積累有促進(jìn)作用，且指數(shù)施肥效果好于傳統(tǒng)施肥。

表5 不同施N處理對(duì)烏桕容器苗營(yíng)養(yǎng)元素積累量的影響

2.3 不同施氮處理對(duì)烏桕容器苗非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量的影響

2.3.1 對(duì)烏桕容器苗可溶性糖含量的影響 由表6可見(jiàn)，不同施N處理烏桕容器苗各器官可溶性糖含量總體趨勢(shì)為：葉>根>莖，且在指數(shù)施肥條件下的烏桕容器苗各器官可溶性糖含量都隨施N量的增加出現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。Z600處理下根中可溶性糖含量顯著地高于其他處理(P<0.05)，是對(duì)照的2.01倍，是C600的1.25倍。Z200處理下根中可溶性糖含量雖在各施肥處理中最低，卻是對(duì)照的1.49倍；除Z400和Z800外，不同施肥處理烏桕容器苗莖中可溶性糖含量有明顯差異，且Z600處理下的莖中可溶性糖含量顯著高于其他處理，是對(duì)照的1.71倍，是C600的1.24倍，含量最低的是Z200，是對(duì)照的1.21倍；Z600處理下葉中可溶性糖含量仍是最高，與對(duì)照、C600 2組處理差異顯著，分別是它們的1.41倍和1.40倍，在C600處理下，葉中可溶性糖含量在各施肥組中最低，是對(duì)照的1.01倍，無(wú)顯著差異。多重比較結(jié)果表明：在根部和莖部，各施肥處理可溶性糖含量與對(duì)照差異顯著，在葉部，除C600、Z200和Z1 000外，其他施肥處理組可溶性糖含量與對(duì)照存在顯著差異，說(shuō)明施肥促進(jìn)烏桕容器苗各器官可溶性糖含量積累。在指數(shù)施肥的各處理中，根、莖、葉各器官中的可溶性糖含量均呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì)，在指數(shù)施肥Z600處達(dá)到最大，分別為63.73、55.55 mg·g-1和134.70 mg·g-1。處理Z600在根、莖、葉各器官中可溶性糖含量均高于C600，說(shuō)明相同施肥總量條件下，指數(shù)施肥促進(jìn)烏桕容器苗可溶性糖含量的積累優(yōu)于傳統(tǒng)施肥。

表6 不同施N處理對(duì)烏桕容器苗可溶性糖含量的影響

2.3.2 不同施氮處理對(duì)烏桕容器苗淀粉含量的影響 由表7可知，不同施N處理烏桕容器苗各器官淀粉含量總體趨勢(shì)為：葉>根>莖，這與烏桕容器苗可溶性糖含量總體趨勢(shì)相同。C600處理下的烏桕容器苗根中淀粉含量顯著大于其他處理(P<0.05)，是對(duì)照的1.30倍，是Z600的1.83倍，Z1000根中淀粉含量最低，比對(duì)照減少了48.8%，存在顯著差異；不同施肥處理烏桕容器苗莖中淀粉含量無(wú)明顯差異。莖淀粉含量最大為Z600，是對(duì)照的1.15倍，是C600的1.03倍，最小為Z1 000，比對(duì)照降低了5%；不同施肥處理烏桕容器苗葉中淀粉含量無(wú)明顯差異。處理C600葉淀粉含量最大，是對(duì)照的1.13倍，是Z600的1.14倍，Z800葉淀粉含量最低，比對(duì)照減少了8.6%。多重比較結(jié)果表明：除C600和Z200外，其他各施肥處理間根淀粉含量均較對(duì)照有下降趨勢(shì)，且在指數(shù)施肥條件下根部淀粉含量隨施氮量的增加而減少。在莖和葉中，各施肥處理和對(duì)照的淀粉含量無(wú)明顯差異。說(shuō)明施N肥對(duì)烏桕容器苗根部淀粉含量積累有一定抑制作用，且同等施肥量條件下，指數(shù)施肥抑制作用更強(qiáng)，施氮肥對(duì)烏桕容器苗莖和葉淀粉積累量無(wú)明顯影響。

表7 不同施N處理對(duì)烏桕容器苗淀粉含量的影響

3 結(jié)論與討論

施N對(duì)烏桕容器苗營(yíng)養(yǎng)元素含量、營(yíng)養(yǎng)元素積累和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量增加有促進(jìn)作用，且指數(shù)施肥在整體上優(yōu)于傳統(tǒng)施肥。指數(shù)施肥600 mg·株-1為烏桕容器苗最佳施肥處理。

3.1 施N處理對(duì)烏桕容器苗營(yíng)養(yǎng)元素濃度和積累量的影響

N、P、K對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育起關(guān)鍵作用[25-26]。外源施N能夠刺激土壤N向幼苗轉(zhuǎn)運(yùn)，提高苗木根、莖、葉的氮濃度以及N、P、K的總積累量，促進(jìn)苗木生長(zhǎng)發(fā)育，提高造林成活率[27-29]。在養(yǎng)分供給過(guò)程中，隨施N量的增加，苗木會(huì)出現(xiàn)養(yǎng)分虧缺、奢養(yǎng)階段和養(yǎng)分毒害3個(gè)階段[30]。在養(yǎng)分虧缺階段時(shí)，苗木的養(yǎng)分濃度和積累量都會(huì)隨施N量的增加而快速增加；在奢養(yǎng)階段時(shí)，苗木養(yǎng)分濃度和積累量隨施N量增加繼續(xù)增加，但增加速度變慢；當(dāng)養(yǎng)分供給量超過(guò)苗木所需量時(shí)，便進(jìn)入了毒害階段，隨施N量的增加苗木養(yǎng)分濃度和積累量都開(kāi)始逐漸減少[31-33]。過(guò)量的N可能會(huì)導(dǎo)致葉面大量元素和微量元素的不平衡，從而對(duì)樹(shù)木生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害效應(yīng)[34]。指數(shù)施肥的一個(gè)重要目的就是通過(guò)使苗木生長(zhǎng)時(shí)處于養(yǎng)分奢養(yǎng)階段，從而增加苗木中的養(yǎng)分儲(chǔ)備，提高苗木在大田中的早期形態(tài)建成[35]。本試驗(yàn)中，指數(shù)施肥0～600 mg·株-1時(shí)各器官中N的濃度和養(yǎng)分積累量不斷增加，且最大值都出現(xiàn)在Z600處，施N量大于600 mg·株-1時(shí)，N的濃度和養(yǎng)分積累量逐漸下降，由此可知，烏桕容器苗在指數(shù)施肥施N量大于600 mg·株-1后處于毒害階段，這和唐桂蘭等[36]對(duì)夏臘梅(Calycanthuschinensis)的研究結(jié)果相似。本研究中Z600與傳統(tǒng)施肥總施N量均為600 mg·株-1，然而與傳統(tǒng)施肥相比，Z600處理顯著提高了烏桕容器苗中N素的積累量，這可能是因?yàn)橹笖?shù)施肥是一種基于增長(zhǎng)率的養(yǎng)分供應(yīng)模型，更能適應(yīng)幼苗生長(zhǎng)和需肥規(guī)律[37]，也有可能是因?yàn)橹笖?shù)施肥可以減少土壤N淋失，從而提高了苗木的N利用效率(NUE)[38]。以上結(jié)果表明，指數(shù)施肥Z600處理更有利于烏桕苗對(duì)N、P、K各元素的吸收和積累，這對(duì)提高烏桕容器苗抗性，促進(jìn)烏桕容器苗來(lái)年的生長(zhǎng)發(fā)育都有著重要作用。

3.2 施N處理對(duì)烏桕容器苗非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量的影響

非結(jié)構(gòu)性碳水化合物——可溶性糖和淀粉是參與生命代謝的重要物質(zhì)，是苗木生長(zhǎng)代謝過(guò)程中重要的能量來(lái)源，和苗木的抗性也有著密切的關(guān)系[39-40]。本研究中，各施肥處理組烏桕容器苗中的可溶性糖含量都高于對(duì)照，且指數(shù)施肥條件下隨施氮量的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，這和廖曦等[41]對(duì)格木(Erythrophleumfordii)的研究結(jié)論相同。適量施N會(huì)促進(jìn)植株的生長(zhǎng)發(fā)育和光合作用，促進(jìn)可溶性糖的積累，提高苗木可溶性糖含量，施N過(guò)量則會(huì)造成抑制作用[42-43]，原因可能是過(guò)量施N干擾了葉的生理活動(dòng)[34]。Pokharel等[35,44]的研究發(fā)現(xiàn)，指數(shù)施肥可以調(diào)控苗木生物量和氮的分配，增加葉和莖中的生物量和N含量，并且降低分配給根的比例，這可能會(huì)有利于增強(qiáng)植物的光合作用和競(jìng)爭(zhēng)能力[45]。本研究中，不同施肥處理后的烏桕容器苗根淀粉含量較對(duì)照都有所降低，莖部和葉部沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明施N會(huì)抑制烏桕容器苗根部淀粉含量增加，對(duì)莖和葉部無(wú)明顯影響。根部淀粉含量降低的原因可能是施氮使得根部生長(zhǎng)旺盛，促進(jìn)了根系的生命活動(dòng)，加速了對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗,也有可能是因?yàn)橹笖?shù)施肥會(huì)促進(jìn)淀粉更多地分配到苗木其他器官中，這一現(xiàn)象值得進(jìn)一步研究。