李艷，李迎秋

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南 250353)

食用油脂在貯藏過程中會發(fā)生氧化酸敗，不僅風(fēng)味改變，營養(yǎng)價值下降，而且會產(chǎn)生有害物質(zhì)，危害人類健康[1-2]。添加抗氧化劑可以防止油脂的氧化酸敗[3]。由于傳統(tǒng)的人工抗氧化劑如BHT、BHA、TBHQ等被證明會產(chǎn)生毒副作用，尋找天然的抗氧化劑來預(yù)防油脂的氧化酸敗逐漸成為研究的重點[4]。

很多天然產(chǎn)物已被證明是有效的抗氧化劑且沒有嚴(yán)重的副作用。陳莉華等[5]報道麥冬葉總黃酮對植物油和動物油的抗氧化活性強(qiáng)于VC和檸檬酸。郭澤美[6]報道添加0.02%的葡萄皮渣多酚可顯著抑制芝麻油過氧化值的提升，抑制效果強(qiáng)于BHT和TBHQ。頡宇[7]報道添加檸條籽肽顯著抑制了核桃油過氧化值的提升，降低了油脂氧化速率。多肽類由于良好的抗氧化性、安全性以及豐富的營養(yǎng)價值已經(jīng)成為食品領(lǐng)域的研究熱點[8]。蛋白水解物是多肽的重要來源，由于動物中飽和脂肪酸含量以及畜牧業(yè)對環(huán)境的破壞性，植物源的蛋白水解物越來越受到人們的關(guān)注[9-10]。

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)，毛茛科芍藥屬植物，是我國著名的傳統(tǒng)花卉[11]。牡丹籽蛋白是一種重要的植物蛋白來源，具有良好的理化和功能特性[12]。Wang等[13]采用5種商業(yè)蛋白酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶)水解牡丹籽蛋白，表明堿性蛋白酶處理的牡丹籽蛋白水解物(AL-TPSPH)在體外具有最好的自由基清除能力、亞鐵離子螯合能力以及還原力，顯示出良好的抗氧化活性。然而，目前還沒有關(guān)于AL-TPSPH及其超濾組分對油脂質(zhì)量保護(hù)的研究。

因此，本實驗采用Schaal烘箱法,探究牡丹籽蛋白水解物AL-TPSPH及其超濾組分對貯藏期間的過氧化值、酸價、硫代巴比妥酸值、皂化值和碘值等質(zhì)量指標(biāo)的保護(hù)作用，以期為天然抗氧化劑和牡丹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡丹籽：由華瑞科技有限公司提供；堿性蛋白酶(alcalase)：購自北京索萊寶生物科技有限公司；冰乙酸；三氯甲烷；碘化鉀；硫代硫酸鈉；可溶性淀粉；95%乙醇；酚酞；氫氧化鉀；鹽酸溶液；環(huán)己烷；冰乙酸；韋氏試劑；三氯乙酸；乙二胺四乙酸二鈉；硫代巴比妥酸。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡丹籽蛋白的制備

參照高蕾蕾[14]的方法，采用傳統(tǒng)的堿溶酸沉法制備牡丹籽蛋白。取100 g脫脂的牡丹籽粉，加入1 000 mL蒸餾水并充分?jǐn)嚢?，?NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.50，置于恒溫磁力攪拌器(50 ℃)上提取3.5 h，冷卻至室溫，離心(4 ℃，6 000 r/min，5 min)取上清，用 HCl溶液調(diào)節(jié)pH至3.60(等電點)，再次離心(4 ℃，6 000 r/min，5 min)得到沉淀，水洗沉淀3次并調(diào)節(jié)pH至中性，冷凍干燥后即可得到牡丹籽蛋白，存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 AL-TPSPH及其超濾組分的制備

參照王穎穎等[15]的方法并稍作修改。稱取5 g牡丹籽蛋白溶于 250 mL蒸餾水中，將pH調(diào)至8.0，加入1%的堿性蛋白酶，60 ℃酶解3 h，期間加入NaOH溶液來維持pH，隨后，將酶解液煮沸10 min滅酶。冷卻至室溫后，離心(4 ℃，8 000 r/min，20 min)取上清液，一部分上清液進(jìn)行冷凍干燥即得AL-TPSPH，-20 ℃?zhèn)溆?；另一部分上清液依次通過分子截留量為30，10，5 kDa的超濾膜。依次收集>30 kDa,10～30 kDa,5～10 kDa 和<5 kDa的截留液，冷凍干燥后于-20 ℃保存。

1.2.3 乳狀液的制備

AL-TPSPH為水溶性，因此，需要加入乳化劑降低表面張力來制備乳狀液。參照穆同娜[16]的方法并稍作修改：采用油水法進(jìn)行乳狀液的制備，其中水、乳化劑和豬油的比例為49.5∶1∶49.5，乳化劑采用Span 80 (HLB=4.3)。稱取98 g豬油置于60 ℃水浴鍋中融化，加入1 g乳化劑和98 g水，采用高速均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速均質(zhì)混合液3 min，制得乳狀液。

1.2.4 AL-TPSPH添加濃度的篩選及過氧化值(POV)的測定

采用Schaal烘箱法，取200 g AL-TPSPH添加量為0.02%、0.1%、0.2%、0.3%以及BHT添加量為0.02%的乳狀液于蜀牛瓶中。將乳狀液置于60 ℃的烘箱中強(qiáng)化保存，每隔24 h攪拌一次，并交換它們在烘箱中的位置。定期測定過氧化值(POV)篩選出合適的AL-TPSPH添加濃度。根據(jù)篩選的濃度添加不同分子量(>30 kDa, 10～30 kDa, 5～10 kDa 和<5 kDa)的AL-TPSPH制備乳狀液，置于60 ℃的烘箱中強(qiáng)化保存并定期測定油樣的質(zhì)量指標(biāo)。其中，過氧化值(POV)根據(jù)GB 5009.227-2016提供的方法進(jìn)行測定。

1.2.5 硫代巴比妥酸值的測定

參考GB 5009.181-2016提供的分光光度法并進(jìn)行了一定修改，具體如下：稱取4 g樣品于 50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入40 mL三氯乙酸溶液(10 g/L)。置于 60 ℃水浴鍋中保溫30 min，用漩渦振蕩器振搖5 min后，于4 ℃ 冰箱中冷藏2 h。用雙層濾紙慢速過濾，取5 mL濾液、三氯乙酸溶液(空白)于25 mL具塞試管中，加入5 mL硫代巴比妥酸水溶液(0.02 mol/L)，加塞，混勻，置于95 ℃水浴鍋中孵育40 min。冷卻至室溫后，用紫外分光光度計于532 nm處測定吸光度值，根據(jù)國標(biāo)方法換算出硫代巴比妥酸值。

1.2.6 碘值的測定

根據(jù)GB/T 5532-2008提供的方法進(jìn)行碘值的測定。

1.2.7 酸價的測定

根據(jù)GB 5009.229-2016提供的熱乙醇指示劑滴定法進(jìn)行酸價的測定。

1.2.8 皂化值的測定

根據(jù)GB/T 5534-2008提供的方法進(jìn)行皂化值的測定。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均為3個重復(fù)，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。所有圖形制作均使用Origin 8.0軟件(Microcal, USA)。此外，通過SPSS軟件(Version 23.0, SPSS Inc. Chicago, IL, USA)進(jìn)行單因素方差分析，通過 LSD(Fisher 's least significant difference)法進(jìn)行顯著性檢驗，P<0.05定義為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 AL-TPSPH濃度的篩選

圖1 不同濃度AL-TPSPH對豬油貯藏期間過氧化值的影響Fig.1 Effect of different concentrations of AL-TPSPH on peroxide values of lard during storage

過氧化值能夠反映油脂中脂質(zhì)氫過氧化物的含量，是衡量油脂氧化程度的指標(biāo)[17]。由圖1可知，隨著貯藏時間的延長，豬油的過氧化值呈現(xiàn)出上升的趨勢。其中空白對照的過氧化值最高，在貯藏時間為25 d時達(dá)到0.859 6 mmol/kg，遠(yuǎn)高于氧化的臨界值0.2 mmol/kg。與空白對照相比，AL-TPSPH的加入顯著降低了豬油的過氧化值，且隨著AL-TPSPH添加量的增加，過氧化值呈現(xiàn)降低的趨勢。當(dāng)AL-TPSPH的添加量為0.2%時，對豬油過氧化值的抑制作用與0.02%的BHT相當(dāng)。因此，選擇0.2%作為不同分子量AL-TPSPH的添加量。

2.2 AL-TPSPH對豬油貯藏期間過氧化值的影響

圖2 AL-TPSPH對豬油貯藏期間過氧化值的影響Fig.2 Effect of AL-TPSPH on peroxide value of lard during storage

由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，空白對照組的過氧化值顯著提升，貯藏時間為25 d時，過氧化值達(dá)到0.859 6 mmol/kg。加入BHT和AL-TPSPH對豬油的過氧化值有明顯的抑制作用，當(dāng)貯藏時間為25 d時，過氧化值分別為0.024 5(BHT)，0.024 6(混合多肽)，0.082 7(>30 kDa)，0.276 3(10～30 kDa)，0.024 1(5～10 kDa)，0.066 4 (<5 kDa) mmol/kg。其中5～10 kDa的AL-TPSPH顯示出最好的抑制效果，且當(dāng)貯藏時間為5，10,15 d時，過氧化值一直為0，顯示出最強(qiáng)的脂質(zhì)氫過氧化物抑制能力。王穎穎[18]報道5～10 kDa的AL-TPSPH中含有最高含量的疏水性氨基酸(42.59%)，增強(qiáng)了清除自由基的能力，這可能是增強(qiáng)其抑制脂質(zhì)氫過氧化物的重要原因。

2.3 AL-TPSPH對豬油貯藏期間酸價的影響

圖3 AL-TPSPH對豬油貯藏期間酸價的影響Fig.3 Effect of AL-TPSPH on acid value of lard during storage

酸價表示中和1 g游離羧基所需的氫氧化鉀的毫克數(shù)，是反映油脂酸敗程度的重要指標(biāo)[19]。由圖3可知，新鮮的豬油酸價很低，僅為0.83 mg/g。隨著貯藏時間的延長，豬油的酸價整體呈現(xiàn)上升趨勢。當(dāng)貯藏溫度為60 ℃，貯藏時間為25 d時，空白對照中的油樣酸價為2.77 mg/g，超過了食用油的酸價臨界值2.5 mg/g。加入抗氧化劑抑制了豬油酸價的提升，尤其是10～30 kDa組分的AL-TPSPH，當(dāng)貯藏時間為25 d時，豬油的酸價僅為1.5 mg/g，強(qiáng)于BHT(1.88 mg/g)。這可能是因為與其他組的AL-TPSPH相比，10～30 kDa組分的AL-TPSPH中含有最高含量的酸性氨基酸(Asp和Glu)，抑制了豬油的酸敗[18]。然而添加>30 kDa 組分的AL-TPSPH時，酸價遠(yuǎn)高于空白對照組，這可能是因為此組分含有較多的大分子肽、蛋白等，在貯藏過程中水解產(chǎn)生了較多的羧基基團(tuán)。

2.4 AL-TPSPH對豬油貯藏期間硫代巴比妥酸值的影響

圖4 AL-TPSPH對豬油貯藏期間硫代巴比妥酸值的影響Fig.4 Effect of AL-TPSPH on thiobarbituric acid value of lard during storage

硫代巴比妥酸值可以反映不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)物醛類如丙二醛等的含量，也是衡量油脂氧化程度的重要指標(biāo)[20]。由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，所有組的硫代巴比妥酸值均呈現(xiàn)上升趨勢。當(dāng)貯藏時間為25 d時，空白對照組的硫代巴比妥酸值已顯著提升至0.944 5 mg/kg，而其他組的硫代巴比妥酸值分別為0.196 7(BHT)，0.182 7(混合多肽)，0.165 2(>30 kDa)，0.474 1(10～30 kDa)，0.184 2(5～10 kDa)，0.140 5(<5 kDa) mg/kg。結(jié)果表明，加入BHT和AL-TPSPH均對貯藏期間豬油硫代巴比妥酸值的提升有明顯抑制作用，且AL-TPSPH(混合物)，>30 kDa，5～10 kDa 以及<5 kDa 組分的AL-TPSPH的抑制作用與 BHT 相當(dāng)。

2.5 AL-TPSPH對豬油貯藏期間皂化值的影響

油脂的皂化值可以反映其相對分子質(zhì)量大小[21]。貯藏期間不同處理方式下豬油皂化值的變化情況見圖5。

圖5 AL-TPSPH對豬油貯藏期間皂化值的影響Fig.5 Effect of AL-TPSPH on saponification value of lard during storage

總體來看，豬油的皂化值在貯藏期間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但不同的處理方式之間無顯著性差異，表明AL-TPSPH和BHT對豬油的皂化值影響不大，所有處理組豬油的相對分子質(zhì)量無明顯變化。

2.6 AL-TPSPH對豬油貯藏期間碘值的影響

碘值是反映油脂不飽和程度的指標(biāo)。油脂被氧化后，碘值下降[22]。貯藏期間不同處理方式下豬油碘值的變化情況見圖6。

圖6 AL-TPSPH對豬油貯藏期間碘值的影響Fig.6 Effect of AL-TPSPH on iodine value of lard during storage

所有處理組豬油碘值均呈現(xiàn)下降趨勢，這說明所有組的豬油均發(fā)生了不同程度的氧化。當(dāng)貯藏時間為25 d時，空白處理組豬油的碘值最低，為43.92 g/100 g。加入BHT和AL-TPSPH后一定程度上抑制了豬油碘值的下降，在貯藏時間為25 d時，碘值分別為48.78(BHT)，47.11(混合多肽)，48.8(>30 kDa)，47.97(10～30 kDa)，49.66(5～10 kDa)，46.65(<5 kDa) g/100 g。其中抑制作用最好的 5～10 kDa組分的AL-TPSPH與過氧化值一致。

3 結(jié)論

總的來說，添加0.2%的AL-TPSPH對豬油貯藏期間的過氧化值、酸價、硫代巴比妥酸值以及碘值等質(zhì)量指標(biāo)的改變顯示出強(qiáng)大的保護(hù)作用。其中，5～10 kDa組分的AL-TPSPH對豬油過氧化值提升和碘值下降的抑制作用最強(qiáng)，優(yōu)于BHT。10～30 kDa組分的AL-TPSPH對豬油酸價的提升顯示出最好的抑制作用，優(yōu)于BHT。除了10～30 kDa組分的AL-TPSPH外，所有組分的AL-TPSPH均對豬油硫代巴比妥酸值的提升顯示出良好的抑制效果，與 BHT 相當(dāng)，而BHT和AL-TPSPH對豬油的皂化值無明顯作用。因此，牡丹籽蛋白水解物可以顯著抑制油脂的過氧化，尤其是5～10 kDa的超濾組分，為抗氧化劑的開發(fā)以及牡丹籽粕的綜合利用提供了更為廣闊的思路。