劉卓非，陸震鳴，張曉娟，柴麗娟，李信，史勁松，許正宏*

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；4.江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212143)

我國傳統(tǒng)發(fā)酵食醋具有獨特的風味和良好的保健功效，是深受人們喜愛的調(diào)味品之一[1]。研究表明[2-4]，我國傳統(tǒng)食醋含有黃酮、多酚、川芎嗪等多種生理活性物質(zhì)。其中，川芎嗪(2,3,5,6-四甲基吡嗪)對治療高血壓和腦血栓等疾病有積極作用[5-7]，并且在食醋中體現(xiàn)出了較高的抗氧化性和降血脂能力，具有治療心血管疾病的潛在功效[8-10]。同時，川芎嗪也是傳統(tǒng)食醋的重要風味物質(zhì)之一[11]。陳釀是傳統(tǒng)發(fā)酵食醋生產(chǎn)過程中的必要工序之一[12-13]。在陳釀過程中，川芎嗪含量隨著陳釀時間的延長而增加[14]。川芎嗪的合成主要有兩種途徑：一是乙偶姻、雙乙酰、氨基酸等前體化合物通過美拉德反應(yīng)生成[15]；二是通過芽孢桿菌等功能微生物代謝生成[16]。Xiao等[17-18]采用同位素示蹤法推斷，在食醋陳釀階段，乙偶姻與銨離子是川芎嗪合成的重要前體物質(zhì)。研究表明鎮(zhèn)江香醋中的川芎嗪主要在加熱煎煮后和陳釀階段通過美拉德反應(yīng)大量生成，而其前體物質(zhì)——乙偶姻與銨離子在發(fā)酵過程中積累[19]。目前有研究從醋醅中分離馴化了具有產(chǎn)乙偶姻功能的微生物群落[20]，進行了原位強化實驗，將鎮(zhèn)江香醋中乙偶姻含量提高了1倍以上[21]。

本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，通過生物強化促進醋酸發(fā)酵階段乙偶姻的積累，提高鎮(zhèn)江香醋中初始乙偶姻含量，考察初始乙偶姻含量和陳釀溫度對鎮(zhèn)江香醋陳釀過程中川芎嗪含量積累的影響，分析兩個因素的交互作用，并對不同陳釀溫度與初始乙偶姻含量下陳釀1年的鎮(zhèn)江香醋揮發(fā)性物質(zhì)差異進行分析，為提升鎮(zhèn)江香醋川芎嗪含量及控制產(chǎn)品品質(zhì)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎮(zhèn)江香醋樣品：由江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司提供。

乙偶姻標準品、叔戊醇(色譜純)：上海阿拉丁試劑有限公司；甲醇(色譜純)、乙酸(色譜純)、川芎嗪標準品、1-萘酚(分析純)、一水肌酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S220 pH計、BSA2202S電子天平 上海Mettler Toledo儀器有限公司；Waters e2695高效液相色譜儀(Empower色譜工作站、2489紫外可見光檢測器) 美國Waters公司；KQ-50E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機 美國Eppendorf公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；BWS-5恒溫水槽、水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-1000紫外分光光度計 翱藝儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 陳釀實驗條件

鎮(zhèn)江香醋樣品pH為3.50，總酸為5.5 g/dL，乙偶姻含量為240 mg/L，陳釀時間為0個月。對鎮(zhèn)江香醋樣品分別設(shè)置6個初始乙偶姻含量(240，480，960，1 440，1 920，2 400 mg/L)和5個陳釀溫度(20，25，30，40，50 ℃)，每組設(shè)置3個平行樣品。采用滅菌處理后的50 mL樣品瓶作為儲存容器，每個樣品裝液量為45 mL，置于不同溫度的培養(yǎng)箱中密封避光保存，共有90個樣品，分別在第0，1，2，4，5，10，12個月時取樣，分析乙偶姻和川芎嗪含量變化，陳釀時間為1年。

1.3.2 總酸含量的測定

采用GB/T 5009.41-2003《食醋衛(wèi)生標準的分析方法》[22]中的滴定法。

1.3.3 乙偶姻含量的測定

采用比色法測定[23]。準確稱取2.5 g乙偶姻，用去離子水定容至50 mL容量瓶中，配制成50 mg/mL的乙偶姻標準溶液，并稀釋至不同倍數(shù)。分別取不同濃度的標準溶液100 μL，加入2.4 mL去離子水、0.5 mL肌酸溶液(質(zhì)量濃度0.5%)、0.5 mL 1-萘酚溶液(質(zhì)量濃度5%)、0.5 mL氫氧化鈉溶液(質(zhì)量濃度10%)，混勻，于30 ℃水浴1 h后，測定溶液OD520 nm。以乙偶姻濃度為橫坐標，OD520 nm為縱坐標繪制標準曲線。取稀釋后的鎮(zhèn)江香醋樣品100 μL，根據(jù)標準曲線測定方法得到樣品的OD520 nm，利用標準曲線計算乙偶姻含量。實驗設(shè)置3個平行樣品。

1.3.4 川芎嗪含量的測定

采用HPLC法測定[24]。準確稱取25 mg川芎嗪，用流動相定容至50 mL容量瓶中，配制成500 μg/mL的川芎嗪標準液，并稀釋至不同倍數(shù)，通過HPLC法測定得到標準曲線。取4 mL鎮(zhèn)江香醋樣品，用氫氧化鈉固體顆粒調(diào)節(jié)pH值至7.2，用提取劑定容至25 mL。超聲提取45 min，然后以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，利用HPLC法檢測川芎嗪，并根據(jù)標準曲線計算其含量。實驗設(shè)置3個平行樣品。

色譜柱：Waters Atlantis T3(4.6 mm×150 mm×5 μm)；檢測器：紫外檢測器；檢測波長為297 nm；流動相為1%醋酸水溶液(加0.05%三氟乙酸)∶甲醇為70∶30；流速為0.8 mL/min。提取劑為1%醋酸水溶液(加0.05%三氟乙酸)∶甲醇為20∶80。

1.3.5 醋液揮發(fā)性風味物質(zhì)的檢測分析

采用頂空固相微萃取與GC-MS技術(shù)進行檢測。固相微萃取條件：20 mL氣質(zhì)瓶中加入2 mL醋液、4 mL純凈水、2.5 g氯化鈉和10 μL叔戊醇(8.05 g/L)，萃取頭(C-WR-95/PDMS/10，Agilent,CH，Switzerland)于50 ℃恒溫預(yù)熱老化10 min后，將萃取頭插入氣質(zhì)瓶吸附40 min，插入進樣口，解吸5 min。

色譜條件：采用DB-WAX柱(30 m×0.25 mm×0.5 μm，Agilent,CA，USA)，進樣口溫度為250 ℃，載氣為氦氣，流速為1 mL/min，進樣為無分離模式。采用不分流進樣方式，進行階段升溫，初始溫度40 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升溫至120 ℃，保持3 min，然后以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：信號采集使用全掃描方式進行，離子源溫度設(shè)置為230 ℃，四級桿溫度設(shè)置為150 ℃。電子能量為70 eV，檢測電壓為350 V，掃描范圍為35～350 amu。

揮發(fā)性化合物分析：數(shù)據(jù)通過MassHunter Workstation Quantitative Analysis (v10.0.707.0)軟件處理，將檢測到的揮發(fā)性化合物質(zhì)譜圖與NIST譜庫匹配，選取匹配度大于80%的化合物。采用內(nèi)標法定量，以叔戊醇(8.05 g/L)為內(nèi)標物，各揮發(fā)性化合物的含量等于內(nèi)標濃度乘以化合物與內(nèi)標峰面積之比。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel軟件對數(shù)據(jù)進行處理，采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行繪圖和數(shù)據(jù)處理，采用MATLAB和SPSS軟件進行相關(guān)性分析。檢測結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對鎮(zhèn)江香醋中川芎嗪含量的影響

由圖1中A可知，在陳釀1年時間內(nèi)，鎮(zhèn)江香醋中川芎嗪含量逐漸升高。在不改變鎮(zhèn)江香醋初始乙偶姻含量(240 mg/L)的條件下，相同陳釀時間的鎮(zhèn)江香醋中川芎嗪含量隨著陳釀溫度的上升而提高。將樣品置于50 ℃下陳釀1年時，川芎嗪含量從初始的(0.94±0.00) mg/L升至(33.48±1.47) mg/L，為不同溫度樣品組中的最大值。

由圖1中B可知，不同陳釀溫度下鎮(zhèn)江香醋中川芎嗪的生成速率均呈現(xiàn)先上升后平緩的趨勢，且生成速率隨著陳釀溫度的升高而上升。當樣品在50 ℃下陳釀5個月時，川芎嗪的生成速率達最高值，達到3.04 mg/(L·月)；在20 ℃下陳釀1個月時，川芎嗪的生成速率達最低值0.03 mg/(L·月)。在前期0～4個月的陳釀過程中，在30，40，50 ℃下陳釀的鎮(zhèn)江香醋中川芎嗪的生成速率呈現(xiàn)快速上升趨勢；在此后5～12個月的陳釀過程中，該3組的川芎嗪生成速率均維持在較高的水平。而20 ℃和25 ℃下陳釀的樣品中川芎嗪的生成速率雖在第0～4個月略有提高，但整體維持在一個較低的增長水平。結(jié)果表明，陳釀溫度是影響川芎嗪物質(zhì)生成的關(guān)鍵因素之一。川芎嗪在食醋陳釀階段通過美拉德反應(yīng)生成，而美拉德反應(yīng)作為一種吸熱反應(yīng)，溫度升高可以有效提高反應(yīng)速率[25]，所以提高陳釀溫度有助于川芎嗪的積累及生成速率的提升。

采用Logistic回歸方程對不同陳釀溫度下的鎮(zhèn)江香醋中川芎嗪含量變化進行曲線擬合，方程及參數(shù)見表1。

表1 不同陳釀溫度下鎮(zhèn)江香醋陳釀過程中川芎嗪含量變化的擬合方程及參數(shù)Table 1 Fitting equations and parameters of ligustrazine content changes during the aging process of Zhenjiang aromatic vinegar at different aging temperatures

續(xù) 表

由表1可知，所有擬合方程的方差(R2)均在0.990以上，說明Logistic回歸方程對川芎嗪含量變化的擬合效果良好。計算各擬合方程中斜率最大值所對應(yīng)的時間，獲得不同陳釀溫度下川芎嗪生成速率達到最大時所需的時間。結(jié)果表明，陳釀溫度越高，川芎嗪生成速率達到最大值所需的時間越短，在20～50 ℃的陳釀溫度范圍內(nèi)，最多可縮短30.30%的時間。由美拉德反應(yīng)生成的風味物質(zhì)在反應(yīng)前期呈現(xiàn)出線性變化，而后隨著加熱時間的延長，物質(zhì)積累逐漸達到平衡狀態(tài)[26]，所以在鎮(zhèn)江香醋的陳釀過程前期，川芎嗪的生成速率達到最大值需要一定的時間，而根據(jù)擬合方程的計算結(jié)果可知，升高陳釀溫度可以縮短川芎嗪積累所需要的時間，從而快速提高食醋中的川芎嗪含量。

2.2 初始乙偶姻含量對鎮(zhèn)江香醋中川芎嗪含量的影響

圖2 初始乙偶姻含量對鎮(zhèn)江香醋陳釀過程中川芎嗪含量(A)及生成速率(B)的影響(陳釀溫度：50 ℃)Fig.2 Effect of initial acetoin content on the content (A) and formation rate (B) of ligustrazine in the aging process of Zhenjiang aromatic vinegar (aging temperature: 50 ℃)

由圖2中A可知，在1年的陳釀時間內(nèi)，不同初始乙偶姻含量的鎮(zhèn)江香醋樣品組中的川芎嗪含量均逐漸增大。在陳釀溫度為50 ℃的條件下，同一時間內(nèi)的鎮(zhèn)江香醋中川芎嗪含量隨著初始乙偶姻含量的增大而增大。初始乙偶姻含量為2 400 mg/L的樣品組陳釀1年時，川芎嗪含量為所有樣品組中的最大值，可達(60.39±5.16) mg/L。由圖2中B可知，在同一時間內(nèi)，川芎嗪的生成速率隨著初始乙偶姻含量的增加而提升。不同初始乙偶姻含量樣品組中的川芎嗪生成速率均呈現(xiàn)先上升后平緩下降的趨勢。在0～5個月的陳釀時間內(nèi)，不同初始乙偶姻含量樣品中的川芎嗪生成速率呈現(xiàn)上升趨勢，且最高生成速率出現(xiàn)在陳釀5個月時，最高生成速率可達6.21 mg/(L·月)；而在第5～12個月中，川芎嗪的生成速率開始放緩，其中初始乙偶姻含量為960，1 440，1 920，2 400 mg/L的樣品組中川芎嗪的生成速率在10～12個月中略有降低。由結(jié)果可以看出，乙偶姻在該反應(yīng)中作為川芎嗪的前體物質(zhì)，提高反應(yīng)物的含量有助于反應(yīng)的正向進行，提高川芎嗪的含量及生成速率。而隨著反應(yīng)的不斷進行，乙偶姻被逐漸消耗，因此，川芎嗪的生成速率在后期有緩慢降低的趨勢。

對不同初始乙偶姻含量下的鎮(zhèn)江香醋中川芎嗪含量變化進行Logistic回歸方程擬合，方程參數(shù)及結(jié)果見表2。

表2 不同初始乙偶姻含量下鎮(zhèn)江香醋陳釀過程中川芎嗪含量變化的擬合方程及參數(shù)Table 2 Fitting equations and parameters of ligustrazine content changes during the aging process of Zhenjiang aromatic vinegar with different initial acetoin content

由表2可知，各擬合方程的R2均在0.990以上且均方根誤差(RMSE)最高僅為1.50，說明擬合效果良好。計算得到在不同初始乙偶姻含量的條件下鎮(zhèn)江香醋中川芎嗪生成速率達到最大值所需時間。結(jié)果表明，隨著初始乙偶姻含量的升高，川芎嗪生成速率達到最大值所需的時間隨之縮短，在初始乙偶姻含量為240～2 400 mg/L的范圍內(nèi)，最高可縮短時間9.82%。說明初始乙偶姻含量的增加有助于縮短川芎嗪積累所需要的時間，但與受陳釀溫度影響縮短的時間(30.30%)相比較小，一方面可能是由于在反應(yīng)初期，乙偶姻作為前體物質(zhì)含量較為充足，在陳釀溫度不變的情況下，只提高乙偶姻含量對前期川芎嗪的生成速率影響有限；另一方面可能是因為在美拉德反應(yīng)過程中，乙偶姻除轉(zhuǎn)化成川芎嗪外，還可能會生成如吡咯、噻唑等其他產(chǎn)物。

2.3 陳釀溫度與乙偶姻含量的交互作用分析

不同初始乙偶姻含量的鎮(zhèn)江香醋在不同陳釀溫度下陳釀1年時，所有樣品組中的川芎嗪含量差異見圖3。

圖3 陳釀1年時不同陳釀溫度和乙偶姻含量下鎮(zhèn)江香醋中川芎嗪含量對比Fig.3 Comparison of ligustrazine content in Zhenjiang aromatic vinegar at different aging temperatures and acetoin content during one-year aging

由圖3可知，初始乙偶姻含量為2 400 mg/L的鎮(zhèn)江香醋樣品在50 ℃下陳釀1年的川芎嗪含量最高，達到(60.39±5.16) mg/L；在20 ℃下陳釀，初始乙偶姻含量為240 mg/L的鎮(zhèn)江香醋樣品中川芎嗪含量最低，為(10.28±0.60) mg/L。而在不同陳釀溫度下的鎮(zhèn)江香醋樣品組中，初始乙偶姻含量為2 400 mg/L樣品中的川芎嗪含量均為各組中最高值。

以初始乙偶姻含量為240 mg/L樣品組中的川芎嗪含量為對照組，分別計算與其他不同初始乙偶姻含量樣品組中川芎嗪含量的差值，結(jié)果見圖4中A。同時，以陳釀溫度為20 ℃的樣品組中的川芎嗪含量為對照組，分別計算與其他溫度下樣品組中川芎嗪含量的差值，結(jié)果見圖4中B。

圖4 陳釀溫度對不同初始乙偶姻含量的鎮(zhèn)江香醋中川芎嗪含量的影響(A)及初始乙偶姻含量對不同陳釀溫度下鎮(zhèn)江香醋中川芎嗪含量的影響(B)(陳釀1年時)Fig.4 Effect of aging temperature on the content of ligustrazine in Zhenjiang aromatic vinegar with different initial acetoin content (A) and effect of initial acetoin content on the content of ligustrazine in Zhenjiang aromatic vinegar at different aging temperatures (B) (aging for one year)

由圖4中A可知，陳釀溫度的升高會增大240 mg/L初始乙偶姻含量樣品組中川芎嗪含量與其余樣品組間的差值，說明陳釀溫度的上升會提高初始乙偶姻含量對樣品中川芎嗪含量的影響。由圖4中B可知，隨著初始乙偶姻含量的增大，不同陳釀溫度下樣品組間川芎嗪含量的差值也隨之增大，說明兩個因素對川芎嗪含量的影響是相互的。

對陳釀1年的所有樣品進行陳釀溫度與初始乙偶姻含量兩個因素間的交互作用分析,結(jié)果見表3。

表3 陳釀溫度和初始乙偶姻含量的交互作用對川芎嗪生成影響的分析結(jié)果Table 3 Analysis results of the effect of the interaction between aging temperature and initial acetoin content on the formation of ligustrazine

由表3可知，兩個因素間的交互作用對川芎嗪的生成具有高度顯著的影響(P<0.001)，說明在鎮(zhèn)江香醋的陳釀過程中，在川芎嗪前體物質(zhì)乙偶姻含量充足的情況下，提升食醋的陳釀溫度，可以有效提升川芎嗪的含量，起到協(xié)同增效的作用。因此，通過生物強化技術(shù)提高醋酸發(fā)酵過程中乙偶姻的積累，從而增大鎮(zhèn)江香醋的初始乙偶姻含量，再適當提高陳釀溫度可以加速川芎嗪的生成與積累，進而提升食醋品質(zhì)。

2.4 不同陳釀溫度與初始乙偶姻含量下鎮(zhèn)江香醋中揮發(fā)性化合物的差異

不同陳釀溫度和乙偶姻含量對陳釀1年的鎮(zhèn)江香醋揮發(fā)性化合物含量的影響見圖5。

圖5 不同陳釀溫度和乙偶姻含量對陳釀1年的鎮(zhèn)江香醋揮發(fā)性化合物含量的影響Fig.5 Effect of different aging temperatures and acetoin content on the content of volatile compounds in one-year-aged Zhenjiang aromatic vinegar

在陳釀1年的90個鎮(zhèn)江香醋樣品中，共檢測到80種揮發(fā)性化合物，陳釀后的鎮(zhèn)江香醋揮發(fā)性化合物整體組成上較為一致，包括醇類、醛類、酸類、酯類、酚類、酮類、吡嗪類等化合物，其中主要為酯類物質(zhì)(22種)和醇類物質(zhì)(12種)。由圖5可知，酸類和醇類物質(zhì)含量受溫度及初始乙偶姻含量的影響較小。在50 ℃下陳釀的樣品中，酯類物質(zhì)含量較低，可能是由于酯類物質(zhì)在高溫下易發(fā)生水解[27]；而醛類物質(zhì)含量較高，可能是由于發(fā)生了美拉德反應(yīng)[28]。在初始乙偶姻含量不變的情況下，酮類物質(zhì)含量隨著陳釀溫度的升高而降低，其中含量最高的酮類物質(zhì)為3-羥基-2-丁酮(乙偶姻)；而初始乙偶姻含量的增加有助于增強食醋的奶油香氣。吡嗪類化合物共檢測到9種，其中含量較高的吡嗪類物質(zhì)包括2,3,5-三甲基吡嗪(川芎嗪)、2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪等，吡嗪類物質(zhì)通常具有堅果香和烘焙香，是鎮(zhèn)江香醋的重要香氣組成之一[29]。吡嗪類物質(zhì)主要通過美拉德反應(yīng)生成，所以50 ℃下陳釀的樣品組中吡嗪類物質(zhì)含量高于其余各組，且隨著初始乙偶姻含量的增加而提高，證明高溫條件下陳釀可以促進食醋中美拉德反應(yīng)的進行，乙偶姻含量的增加有助于吡嗪類化合物的積累，對鎮(zhèn)江香醋的品質(zhì)提升具有積極作用。

3 結(jié)論

在1年的陳釀過程中，溫度和初始乙偶姻含量的提高均對鎮(zhèn)江香醋中川芎嗪的積累具有促進作用。陳釀溫度(20～50 ℃)的升高和初始乙偶姻含量(240～2 400 mg/L)的增大可以提高川芎嗪的含量及生成速率，還可縮短川芎嗪達到最大生成速率所需時間。當鎮(zhèn)江香醋陳釀1年時，川芎嗪含量與陳釀溫度和初始乙偶姻含量間具有高度顯著的相關(guān)性(P<0.001)，且兩個因素間的交互作用對鎮(zhèn)江香醋中川芎嗪的生成具有高度顯著的影響(P<0.001)。陳釀溫度和初始乙偶姻含量的提升有助于鎮(zhèn)江香醋中吡嗪類物質(zhì)的積累，提升食醋的風味。本研究結(jié)果可為食醋品質(zhì)的提升及質(zhì)量控制等提供研究基礎(chǔ)。