張東旭，馮 艷，張永芳，李 鳳

(山西大同大學(xué)農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山西大同037009)

1 引言

黑牛肝菌(Boletus aereus)，又稱褐牛肝菌、銅色牛肝菌，屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)傘菌目(Agaricales)牛肝菌科(Boletaceae)牛肝菌屬(Boletus)，其子實體通體呈黑色，味道鮮美，在我國四川、云南、貴州等多個地區(qū)廣泛分布，在歐洲、非洲等地也有廣泛分布，是一種世界性珍稀食用菌[1]。黑牛肝菌是目前1 000 多種牛肝菌之中唯一可以進行人工栽種和培養(yǎng)，已實現(xiàn)工廠化栽培的菌類[2]。黑牛桿菌具有“高蛋白、低脂肪、低熱量”等的特點，是一種極具營養(yǎng)價值和商業(yè)價值的食用菌[3]。黑牛肝菌含有大量的風(fēng)味物質(zhì)[4-5]，這些物質(zhì)不僅可以提供鮮美的味道,還具有豐富的生物活性，被廣泛用在保健果飲、醬油、保健品、天然色素、調(diào)味醬、發(fā)酵酒、豆奶、復(fù)合調(diào)味料、米酒、牛肝菌豆瓣醬等生產(chǎn)之中。黑牛肝菌可以降低血清中的總膽固醇（TCHO）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），提升高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量，對血脂有明顯的降低作用[6]。黑牛肝菌提取物具有抵抗病毒、抵抗癌及提高人體免疫力的功效,可降低“三高”，在醫(yī)藥和食品保健領(lǐng)域有著極大的開發(fā)潛力和應(yīng)用潛力[1]。黑牛肝菌多糖具有清除自由基[7]、保護急性酒精導(dǎo)致的內(nèi)臟損傷[1]、抑制癌細(xì)胞的活性、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，補血氣等功效[8]。因此，規(guī)模化發(fā)展黑牛肝菌栽培產(chǎn)業(yè)前景光明。

在“林菌”產(chǎn)業(yè)發(fā)展中，恰當(dāng)形式的菌種對提高栽培便利性、降低勞動力成本、降低材料成本以及降低生產(chǎn)復(fù)雜性具有重要意義。通過使用生物發(fā)酵技術(shù)[9]可以獲得大量的菌絲體代替?zhèn)鹘y(tǒng)食用真菌栽培固體原種，充分利用了液體菌種生長速度快、菌絲活力高、生產(chǎn)成本低、使用便利等優(yōu)點[10]。通過液體發(fā)酵技術(shù)制備菌種是黑牛肝菌人工栽植和及工廠化栽植的發(fā)展方向[11]。本研究旨在篩選出一種適宜黑牛肝菌液體發(fā)酵的培養(yǎng)基以及合適的培養(yǎng)條件，為推動黑牛肝菌“林菌”林下經(jīng)濟發(fā)展，助力晉北地區(qū)乃至全省的鄉(xiāng)村振興事業(yè)。

2 材料與方法

黑牛肝菌采購于甘肅臨夏。

2.1 培養(yǎng)基的配制

菌種分離與活化使用PDA 培養(yǎng)基，菌種純化使用CPDA 培養(yǎng)基，菌種活化使用M1 培養(yǎng)基[12]。

2.2 菌種的分離和純化菌種分離

將新鮮的黑牛肝菌菌種接種至PDA 培養(yǎng)基上，在室溫條件下培養(yǎng)3 周，待褐色菌絲長滿培養(yǎng)皿后2～4 ℃冷藏備用。菌種純化：用接種針挑去適量活化后的菌絲接種到CPDA純化培養(yǎng)基上，在室溫條件下，培養(yǎng)2 周。菌種活化：用接種針將純化一代后的菌絲體適量接種至M1 培養(yǎng)基上，在室溫條件下，培養(yǎng)2周即得發(fā)酵所用菌絲體。菌絲生成量的測定，用紫外分光光度計在波長600 nm 下測定菌液的吸光度值。

2.3 最適液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

參考前人研究，選擇5 種液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行黑牛肝菌液體發(fā)酵。培養(yǎng)基1 號：葡萄糖37.5 g/L、蛋白胨8.5 g/L、磷酸二氫鉀2 g/L、硫酸鎂1 g/L、維生素B1 0.01 g/L、碳酸鈣2 g/L[13]。培養(yǎng)基2 號：葡萄糖5 g/L、麥芽糖22.5 g/L、酵母膏14 g/L、硫酸銨2.7 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、硫酸亞鐵67 mg/L、硫酸銅100 μg/L。培養(yǎng)基3 號：葡萄糖30 g/L、玉米粉20 g/L、酵母膏7 g/L、磷酸二氫鉀2 g/L、硫酸鎂1 g/L、維生素B10.01 g/L、碳酸鈣2 g/L[14]。培養(yǎng)基4 號：馬鈴薯100 g/L、麥麩30 g/L、蔗糖27 g/L、蛋白胨1.4 g/L、磷酸二氫鉀0.85 g/L、硫酸鎂1 g/L[15]。培養(yǎng)基5號：馬鈴薯200 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母膏5 g/L、牛肉膏3 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀3 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、維生素B1 30 mg/L[16]。分別在250 mL 三角瓶中裝入95 mL 的培養(yǎng)液，在121 ℃下高壓滅菌20 min 后，接入半徑4 cm 菌餅，培養(yǎng)溫度28 ℃，搖床震蕩轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)8h，每2h 測定一次培養(yǎng)基的吸光度值，選取最適液體發(fā)酵培養(yǎng)液。

2.4 最適液體發(fā)酵條件的篩選

（1）最適轉(zhuǎn)速的篩選：選取4號培養(yǎng)液，設(shè)定轉(zhuǎn)速為120、140、160、180 r/min，經(jīng)搖床培養(yǎng)8h，每2h測定一次培養(yǎng)基的吸光度，以確定最適轉(zhuǎn)速。

（2）最適裝液量篩選：選取4號培養(yǎng)液，在250 mL錐形瓶中分別裝入50、65、80、95、110 mL培養(yǎng)液，經(jīng)搖床培養(yǎng)8h，每2h測定一次培養(yǎng)基的吸光度，以確定最適裝液量。

（3）最適培養(yǎng)溫度篩選：選取4號培養(yǎng)液，分別在23、28、33、38 ℃下進行發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)搖床培養(yǎng)8h，每2h 測定一次培養(yǎng)基的吸光度，以確定最適培養(yǎng)溫度。

3 結(jié)果與分析

3.1 最佳培養(yǎng)基的篩選

由圖1-a 可知，初始接種牛肝菌菌液濃度較高的處理，在培養(yǎng)過程中菌液的濃度始終較高。就菌液的生長速率而言，顯然4 號培養(yǎng)基的曲線斜率最大，培養(yǎng)效果最佳。因此，在后續(xù)培育條件研究中，均采用4 號培養(yǎng)基進行黑牛肝菌發(fā)酵培養(yǎng)。

3.2 最適轉(zhuǎn)速的確定

由圖1-b 可知，在恒溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速為160 r/min時，菌絲體生長速率最快，在培養(yǎng)8h就可以達到較高的濃度。不同搖床轉(zhuǎn)速下菌絲體的吸光度值排序為：160 r/min＞180 r/min＞140 r/min＞120 r/min。因此，選擇160 r/min 為牛肝菌液體發(fā)酵的最佳搖床轉(zhuǎn)速，與郭永月等（2012）報道一致[13]。

3.3 最適裝液量的確定

由圖1-c可見，菌絲濃度的吸光度排序為：80 mL ＞95 mL ＞50 mL ＞110 mL＞65 mL。在250 mL的三角瓶中裝液量為80 mL和95 mL時，牛肝菌生長菌絲體均在8h 達到理想濃度，但80 mL 裝液量最佳。郭永月等（2012）的研究表明，在250 mL的三角瓶中裝液量為95 mL 時，最適合牛肝菌發(fā)酵[13]。兩個研究結(jié)果有一定差異。

3.4 最適培養(yǎng)溫度的確定

由圖1-d 可知，牛肝菌在23～38 ℃范圍內(nèi)，均可以快速生長，但是在培養(yǎng)溫度為28 ℃時，菌絲生長最快。按菌絲體的吸光度排序為：28 ℃＞33 ℃＞38 ℃＞23 ℃。郭永月等報道牛肝菌液體發(fā)酵的最適溫度是28 ℃[13]，羅順珍等報道牛肝菌的最適發(fā)酵溫度是27～33 ℃[17]，王文斌等報道暗褐網(wǎng)柄牛肝菌液體深層發(fā)酵的最適溫度是29～33℃[18]。本研究結(jié)果與上述研究一致，28～33 ℃范是適合牛肝菌菌絲生長的溫度，有利于縮短黑牛肝菌的生長周期，降低生產(chǎn)成本。

圖1 黑牛肝菌在液體發(fā)酵培養(yǎng)條件下菌液的濃度變化規(guī)律

4 結(jié)論

黑牛肝菌是一種非常值得研究和開發(fā)的藥食同源食用菌，其含有大量的風(fēng)味物質(zhì)、茶氨酸和聚氨基-D-葡萄糖等，使黑牛肝菌的味道鮮美，有著很高食用價值。本研究發(fā)現(xiàn)4號培養(yǎng)基更適合牛肝菌發(fā)酵，該培養(yǎng)基原本是杏鮑菇發(fā)酵的培養(yǎng)基[16]。黑牛肝菌液體發(fā)酵的溫度與搖床轉(zhuǎn)速均與前人研究相似，但是最適裝液量僅80 mL,與前人研究差異較大，可能與本研究的菌種有更高的生物活性有關(guān)。黑牛肝菌市場平均價格500 g 在60 元以上，且需求量逐年上升。黑牛肝菌液態(tài)發(fā)酵技術(shù)，為制備出干粉菌種，使低成本利用林下環(huán)境“仿野生”栽培牛肝菌成為可能，助力我省林下經(jīng)濟發(fā)展。