陳藝元，李嘉淳，王新雨，張楠，王一帆，徐業(yè)*

（1.北京生物制品研究所有限責(zé)任公司 國(guó)際合作部，北京 100176；2.北京生物制品研究所有限責(zé)任公司 分包裝凍干室，北京 100176）

隨著藥品監(jiān)管力度的加大和市場(chǎng)準(zhǔn)入要求的提升，藥品生產(chǎn)企業(yè)必須嚴(yán)控生產(chǎn)全過(guò)程，尤其是無(wú)菌藥品的生產(chǎn)全過(guò)程[1]。在潔凈室內(nèi)，人員的行為規(guī)范對(duì)環(huán)境微生物檢測(cè)結(jié)果有重要影響，因此規(guī)范潔凈室內(nèi)人員的相關(guān)行為有助于保證檢測(cè)結(jié)果真實(shí)反映生產(chǎn)車間的微生物控制效果[2]。環(huán)境監(jiān)測(cè)用培養(yǎng)基是微生物試驗(yàn)的基礎(chǔ)，直接影響微生物試驗(yàn)的結(jié)果[3-4]。北京生物制品研究所有限責(zé)任公司（以下簡(jiǎn)稱北京公司）生產(chǎn)車間日常手部消毒是在距離TSA平皿水平距離大于100 cm、垂直距離約40 cm處對(duì)手部進(jìn)行消毒劑噴灑，因此本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析了生產(chǎn)車間日常噴灑消毒劑造成的消毒劑殘留對(duì)環(huán)境監(jiān)測(cè)用預(yù)裝TSA培養(yǎng)基中環(huán)境微生物的影響，討論該消毒行為的合理性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

（1）材料。一次性接種環(huán)（批號(hào)5720617），10 μL，美國(guó)BD公司；pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)20211101），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（Tryptone Soya Agar，TSA；批號(hào)21308621B），90 mm，浙江天杭生物科技股份有限公司；含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)M127202202003），北京公司培養(yǎng)基科室；70%無(wú)菌異丙醇（Isopropyl Alcohol，IPA；批號(hào)313631），美國(guó) STERIS公司；75%乙醇（批號(hào)20201125），北京鴻志偉達(dá)工貿(mào)有限公司。

（2）儀器。BSC-1600ⅡA2型和BSC-1300ⅡA2型生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；J-2型菌落計(jì)數(shù)器，姜堰區(qū)康寧醫(yī)療器械廠；LRH-250F型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

（3）菌種。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B) 10104]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]、白 色 念 珠 菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F) 98003]，中國(guó)食品藥品檢定研究院；表皮葡萄球菌（Aspergillus niger）、嬰兒芽孢桿菌（Bacillus infantile）來(lái)自北京公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)用菌懸液制備

（1）細(xì)菌菌懸液的制備。將接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、嬰兒芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物置于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，取上述培養(yǎng)物分別加入pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，10倍系列稀釋制成理論濃度為200 CFU/mL的菌懸液[5-7]。

（2）真菌菌懸液的制備。將接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物置于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20～25 ℃培養(yǎng)2～3 d，取上述培養(yǎng)物用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，10倍系列稀釋制成理論濃度為200 CFU/mL的菌懸液。將接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物置于沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20～25 ℃培養(yǎng)5～7 d，加入適量含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫，取洗脫液10倍系列稀釋制成理論濃度為200 CFU/mL的菌懸液[5-7]。

1.3 平皿菌落計(jì)數(shù)及培養(yǎng)

分別取1.2項(xiàng)下制備的理論值為200 CFU/mL的菌懸液0.1 mL接種于TSA平皿，然后用L-棒涂均勻，一式兩份。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、嬰兒芽孢桿菌在30～35 ℃培養(yǎng)不超過(guò)3 d，白色念珠菌、黑曲霉在30～35 ℃培養(yǎng)不超過(guò)5 d[7]。

1.4 實(shí)驗(yàn)1組：涂布菌懸液后噴灑消毒劑

（1）TSA平皿菌懸液接種。取630塊TSA平皿，取1.2項(xiàng)下制備的7種菌懸液，每種菌懸液涂布90塊TSA平皿，接種量為0.1 mL。

（2）模擬消毒處理及對(duì)照。每種菌懸液組按照消毒處理方式分為3個(gè)小組（75%乙醇組、70%IPA組、對(duì)照組），將上述630塊涂布完菌懸液的TSA平皿分別敞口放置0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h，每小組每個(gè)敞口時(shí)間段分別設(shè)置6個(gè)重復(fù)。75%乙醇、70%IPA組共計(jì)420塊TSA平皿在敞口放置時(shí)間段分別按0.5 h每隔3 min、1 h每隔7 min、2 h每隔15 min、3 h每隔22 min、4 h每隔30 min模擬生產(chǎn)車間人員消毒頻次，在距離TSA平皿水平距離大于100 cm，垂直距離約40 cm處用相應(yīng)消毒劑對(duì)實(shí)驗(yàn)人員手部進(jìn)行消毒，每個(gè)時(shí)間段共計(jì)8次。對(duì)照組210塊TSA平皿不噴灑任何消毒劑。

（3）陰性對(duì)照組。分別均勻涂布0.1 mL pH 7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液及含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至TSA平皿表面，每種緩沖液設(shè)置2個(gè)重復(fù)。接受標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照組應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。

1.5 實(shí)驗(yàn)2組：噴灑消毒劑后涂布菌懸液

取126塊TSA平皿分成7組，每種菌懸液組各18塊TSA平皿，每種菌懸液組按照消毒處理方式分為3小組（75%乙醇組、70%IPA組、對(duì)照組）。每小組分別設(shè)置6個(gè)重復(fù)。75%乙醇組、70%IPA組（共計(jì)84塊）在距離TSA平皿水平距離大于100 cm，垂直距離約40 cm處用相應(yīng)消毒劑對(duì)實(shí)驗(yàn)人員手部進(jìn)行消毒8次，對(duì)照組42塊TSA平皿不噴灑任何消毒劑。上述TSA平皿消毒完成后室溫放置20 min，取1.2項(xiàng)下制備的7種菌懸液，接種量為0.1 mL。陰性對(duì)照組處理同步驟1.4（3）。

1.6 培養(yǎng)

將步驟1.4和1.5中TSA平皿在20～25 ℃培養(yǎng)72 h后在30～35 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)到期后，觀察平皿上菌落，計(jì)數(shù)并記錄結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間兩獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)，以P＞0.05為差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌懸液菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

分別取0.1 mL理論濃度為200 CFU/mL的實(shí)驗(yàn)用7種菌株進(jìn)行平皿計(jì)數(shù)，細(xì)菌30～35 ℃培養(yǎng)不超過(guò)3 d，真菌30～35 ℃培養(yǎng)不超過(guò)5 d，各實(shí)驗(yàn)菌平皿計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。表1數(shù)據(jù)顯示，黑曲霉的實(shí)際濃度最低，嬰兒芽孢桿菌的實(shí)際濃度最高，枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的實(shí)際濃度最接近理論濃度。

表1 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果（單位：CFU/mL）

2.1 日常消毒對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

如表2所示，實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組中75%乙醇組及70% IPA組在敞口放置不同時(shí)間內(nèi)的TSA平皿計(jì)數(shù)結(jié)果與對(duì)照組結(jié)果無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明北京公司當(dāng)前采用的手部消毒方式與頻次對(duì)環(huán)境微生物檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響，檢測(cè)結(jié)果可以反映車間內(nèi)真實(shí)的情況。

表2 平皿計(jì)數(shù)結(jié)果（±s，n=6）

表2 平皿計(jì)數(shù)結(jié)果（±s，n=6）

組別 銅綠假單胞菌 金黃色葡萄球菌 枯草芽孢桿菌 白色念珠菌組 黑曲霉 表皮葡萄球菌 嬰兒芽孢桿菌對(duì)照組實(shí)驗(yàn) 1 組 0.5 h 25.33±4.32 29.67±5.64 23.67±3.56 20.67±5.99 14.33±4.41 26.33±6.12 32.33±5.32實(shí)驗(yàn) 1 組 1.0 h 24.83±4.40 28.00±3.58 19.00±4.56 20.17±4.49 14.83±3.43 27.00±2.37 29.83±3.92實(shí)驗(yàn) 1 組 2.0 h 24.33±2.73 25.67±4.27 20.00±4.24 21.67±4.27 14.50±2.95 26.17±3.60 28.67±4.18實(shí)驗(yàn) 1 組 3.0 h 24.17±4.58 25.33±3.50 21.50±4.46 22.67±4.32 14.00±4.00 25.17±4.12 27.00±2.76實(shí)驗(yàn) 1 組 4.0 h 26.17±2.86 25.50±3.21 20.33±3.01 22.67±3.27 13.17±3.60 25.33±3.93 25.00±3.74實(shí)驗(yàn) 2 組 26.00±4.00 27.67±3.67 23.67±4.46 21.83±2.99 14.00±2.76 27.33±5.32 31.50±4.81 75%乙醇組實(shí)驗(yàn) 1 組 0.5 h 22.17±3.92 25.33±3.50 20.67±2.50 16.67±3.33 12.83±3.54 21.17±6.08 29.17±5.19實(shí)驗(yàn) 1 組 1.0 h 23.33±4.18 25.50±5.05 16.67±4.72 19.83±3.66 13.33±2.80 26.00±2.61 25.83±5.04實(shí)驗(yàn) 1 組 2.0 h 22.50±3.45 23.17±2.99 17.00±4.00 19.00±2.28 11.83±2.48 23.00±4.24 26.50±3.94實(shí)驗(yàn) 1 組 3.0 h 23.00±5.48 22.67±3.72 19.33±1.97 21.00±4.38 12.33±3.33 21.83±3.66 25.17±3.92實(shí)驗(yàn) 1 組 4.0 h 23.33±4.46 23.00±4.24 19.67±3.44 19.17±4.49 11.17±3.19 22.83±3.25 22.00±4.34實(shí)驗(yàn) 2 組 23.33±2.94 23.50±4.14 21.33±3.14 20.50±3.27 11.67±2.73 22.50±5.05 28.67±3.50 70%IPA組實(shí)驗(yàn) 1 組 0.5 h 22.17±4.12 26.00±4.38 20.33±4.68 16.33±3.01 11.33±2.94 22.00±4.34 29.83±3.66實(shí)驗(yàn) 1 組 1.0 h 23.67±3.50 26.67±2.80 20.50±7.87 19.50±4.64 14.17±3.19 25.17±3.43 26.33±6.06實(shí)驗(yàn) 1 組 2.0 h 22.17±3.66 23.17±4.07 17.33±3.39 19.50±3.21 12.33±3.93 22.67±4.63 25.50±4.64實(shí)驗(yàn) 1 組 3.0 h 21.00±4.43 23.00±4.73 18.83±3.76 20.33±3.27 11.67±2.58 21.67±3.93 23.50±5.17實(shí)驗(yàn) 1 組 4.0 h 23.00±4.29 23.50±3.27 19.17±3.54 18.50±5.21 12.33±2.80 22.33±2.66 22.00±3.41實(shí)驗(yàn) 2 組 22.17±3.66 24.00±4.82 20.67±4.27 19.17±2.317 12.33±2.42 23.17±5.81 30.00±4.20

3 結(jié)論

由于微生物實(shí)驗(yàn)的特殊性，在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)進(jìn)行充分和全面的評(píng)價(jià)，所有影響微生物監(jiān)測(cè)結(jié)果的條件和因素均應(yīng)考慮在內(nèi)，特別要了解實(shí)驗(yàn)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)的差別是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[2]。

本文驗(yàn)證了環(huán)境監(jiān)測(cè)用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中和消毒劑的效能，分別在接種前后模擬當(dāng)前公司潔凈車間工作人員手部消毒行為，觀察其對(duì)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果的影響。通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)顯著差異，P值均大于0.05，充分說(shuō)明北京公司現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)人員對(duì)手部消毒距離（人員距離TSA平皿水平距離大于100 cm，垂直距離約40 cm）對(duì)環(huán)境監(jiān)測(cè)用TSA平皿造成的消毒劑殘留不會(huì)影響環(huán)境監(jiān)測(cè)微生物的培養(yǎng)結(jié)果，環(huán)境監(jiān)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。