王立斌 王軍乾 趙 凌 黃振華 王 萌 王靖雷 余四九，2 潘陽陽，*

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070）

抑制素A（inhibin A，INHA）是由卵泡顆粒細胞分泌的一種調(diào)節(jié)卵泡生長發(fā)育、卵子生成和配子形成的內(nèi)分泌激素。雌性動物和雄性動物不同器官產(chǎn)生不同的抑制素（inhibin，INH）。雌性動物既能產(chǎn)生INHA 也能產(chǎn)生抑制素B（inhibin B，INHB），而雄性動物只能產(chǎn)生INHB［1-2］，說明INHA 在雌性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮獨特的作用。INHA 和INHB 失活對雄性生殖系統(tǒng)沒有明顯影響，但會導致雌性動物胚胎發(fā)育的吸收能力減弱及卵巢功能受損，而INHA 能增強雌性小鼠促卵泡素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）對卵泡發(fā)育的依賴性，并提高自然排卵率［3］。INH 的結(jié)合位點和受體位于垂體、卵泡膜細胞和卵泡顆粒細胞［4-5］。INH 可以通過內(nèi)分泌和局部作用的方式調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育［6-8］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，INH 免疫動物能使垂體分泌的FSH 和促黃體素（luteinizing hormone，LH）減少［9］，用抑制劑處理綿羊卵丘細胞可以抑制細胞內(nèi)促卵泡素受體（follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）、促黃體素受體（luteinizing hormone receptor，LHR）的表達［10］，由此推測INHA 對牦牛（Bos grunniens）卵泡顆粒細胞中FSH和LH及其受體同樣會產(chǎn)生影響。

FSH 和LH 主要調(diào)節(jié)卵泡的生長發(fā)育、成熟和排卵。在哺乳動物中，F(xiàn)SH和LH對卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂的作用機理是：二者通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）產(chǎn)生細胞生物學反應(yīng)［11-13］。MAPK 激活了顆粒細胞膜上的細胞生物學反應(yīng)，影響卵丘細胞和卵母細胞之間的信號轉(zhuǎn)導［14］，既提高顆粒細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的水平，也降低卵母細胞中的cAMP 和環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）水平，使卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂，最終促進卵泡完成排卵［15-16］。在雌性生殖系統(tǒng)中，F(xiàn)SH 調(diào)節(jié)小卵泡的生長發(fā)育，促進卵泡成熟，并刺激卵泡內(nèi)顆粒細胞合成INHA［17-18］。LH是由垂體分泌的調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的激素，通過與顆粒細胞膜上的受體結(jié)合，誘導成熟卵泡排卵，促進卵泡向黃體轉(zhuǎn)化［19］。說明顆粒細胞中FSHR和LHR影響FSH和LH對卵泡的調(diào)節(jié)作用。

INH 可以通過cAMP 和三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）的產(chǎn)生啟動主要信號級聯(lián)，從而調(diào)節(jié)FSH 和LH 的分泌，這些由FSH 和LH 調(diào)節(jié)的顆粒細胞信號級聯(lián)在卵泡發(fā)育、排卵中起重要作用［20］。INHA作為雌性動物特有的一種激素，目前關(guān)于INHA 對動物卵泡發(fā)育和生殖功能影響的研究較少。為探究INHA對卵泡顆粒細胞的調(diào)控作用，本研究用不同濃度的INHA 處理牦牛卵泡顆粒細胞并檢測激素和受體的表達變化情況，以進一步發(fā)掘INHA 對牦牛卵泡顆粒細胞的調(diào)節(jié)作用機制，以期為探索抑制素對雌性牦牛生殖調(diào)控的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品處理 試驗樣品取自青海省西寧市清源屠宰場，3～6 歲雌性牦牛，體況良好，無明顯臨床疾病。牦牛禁食8～10 h 后，頸動脈放血屠宰，30 min 內(nèi)采集10 對牦牛卵巢，用含有青霉素和鏈霉素的生理鹽水清洗3次，3 h內(nèi)帶回實驗室做原代顆粒細胞培養(yǎng)。

1.1.2 儀器設(shè)備 T100TMThermal Cycler PCR 儀，德國Eppendorf公司；BIO-RAD酶標儀，美國Biorad公司；實時熒光定量PCR 儀，上海Roche 生物科技公司；DP71 顯微照相系統(tǒng)、Olympus DSU 活細胞工作站，日本Olympus公司。

1.1.3 試驗試劑 Inhibin A，美國R&D Systems；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（basic cell culture medium）和磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered salina，PBS），上海Gibco 公司；細胞計數(shù)試劑（cell counting kit-8，cck-8），武漢菲恩生物科技有限公司；FSHR 抗體（AF-5242），江蘇親科生物研究中心有限公司；LHR 抗體（bs-6431R）、熒光二抗、山羊抗兔抗體（Goat Anti-Rabbit IgG）和免疫組化染色試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；牛促卵泡素（FSH）、黃體生成素（LH）和雌二醇（estradiol，E2）酶聯(lián)免疫分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，上海機純實業(yè)有限公司；胰蛋白酶，美國Sigma 公司；曲拉通X-100（Triton X-100），武漢卡諾斯科技有限公司；細胞核染料（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚，4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），北京索萊寶生物公司；TransZol RNA 提取試劑盒，北京全式金公司；GoscriptTMReverse Transcription System 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Promega 公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），上海碧云天生物公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 利用Primer Premier 6.0 設(shè)計7 對引物（表1），由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.2.2 牦牛卵泡顆粒細胞體外培養(yǎng) 將牦牛卵巢置于37 ℃含有青霉素和鏈霉素的生理鹽水中清洗3 次，在3 h 內(nèi)用注射器抽取直徑為3～8 mm 卵泡中的卵泡液后注入15 mL 離心管，將混勻后的卵泡液用100 nm孔徑的細胞濾器過濾，然后以1 500 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min，形成的沉淀即為所需的原代牦牛顆粒細胞。再用配制的10%細胞培養(yǎng)液（10%全培）［90 mL 細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM/F12）+10 mL 胎牛血清+1 mL雙抗］清洗3 次后通過細胞板計數(shù)法調(diào)整密度接近5×105個·mL-1，并接種于25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，24 h 內(nèi)每隔8 h 按照半換液法（棄一半培養(yǎng)瓶中一半的細胞培養(yǎng)液，再加入等量配制的細胞培養(yǎng)液）換液，待細胞生長穩(wěn)定后每36 h更換一次10%全培。

1.2.3 CCK-8 法測細胞生長曲線 待第一代顆粒細胞在培養(yǎng)瓶中長滿以后，用0.25%的胰蛋白酶進行消化，顯微鏡觀察待細胞全部消化后加入10%全培中終止消化，再以1 500 r·min-1離心10 min，加入適量10%全培制成細胞懸液，再用活細胞計數(shù)法將細胞懸液濃度依次稀釋為0.5×104、1.5×104、2.5×104、3.5×104、4.5×104個·mL-1，將不同濃度的細胞懸液各加100 μL于96 孔板中，每個濃度重復(fù)加4 孔，并在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h 使細胞完全貼壁，然后棄去細胞培養(yǎng)液，用PBS 清洗3 次，每次3 min，之后每孔加入90 μL DMEM/F12 培養(yǎng)基和10 μL CCK-8 試劑，再置于細胞培養(yǎng)箱3 h 后以490 nm 波長測光密度（optical density，OD）值，以細胞懸液濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標建立顆粒細胞標準曲線方程。

將上述顆粒細胞以0.5×104個·mL-1細胞密度接種于96 孔板中，每孔加100μL 混有顆粒細胞的培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞完全貼壁后選擇其中4 孔棄去培養(yǎng)液，用PBS 清洗3 次，每次3 min，加入90 μL DMEM/F12 培養(yǎng)基和10 μL CCK-8 試劑，培養(yǎng)3 h 后在490 nm 波長下測OD 值，其余孔棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，每次3 min，然后加入10%的全培，24 h后再選擇4 孔按照上述方法以490 nm 波長測OD 值，連續(xù)測8 d 后，以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標，細胞數(shù)量為縱坐標繪制顆粒細胞生長曲線。

1.2.4 FSHR、LHR 在顆粒細胞的定位檢測 通過免疫熒光化學方法檢測牦牛卵泡顆粒粒細胞上FSHR、LHR 的表達。先用0.25%胰酶消化第一代顆粒細胞，待細胞全部消化后1 500 r·min-1離心10 min，用10%全培制成細胞懸液，用活細胞計數(shù)法將細胞密度調(diào)至5×105個·mL-1，然后接種到2 個放有蓋玻片的細胞培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后取出爬片，用PBS清洗3次，每次3 min，然后用4%多聚甲醛固定，再用PBS 清洗3 次，每次3 min，并加入0.1%TritonX-100 室溫條件下透化40 min，再用PBS 清洗3 次，每次5 min，用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉1 h，棄去封閉液并用PBS 清洗3 次×5 min，加入稀釋的FSHR、LHR 抗體（1∶100），4 ℃孵育12 h，再用PBS 清洗5 次，每次3 min，用熒光二抗（1∶200）孵育1 h，用PBS 清洗5 次，每次3 min 后，用DAPI 染色液染核5 min，再用PBS 清洗5 次，每次3 min后用抗熒光猝滅劑封片，在活細胞工作站觀察并拍照。

1.2.5 不同濃度INHA 處理顆粒細胞 將第一代對數(shù)生長期的牦牛卵泡顆粒細胞進行胰酶消化，全部消化后加入適量的10%全培以1 500 r·min轉(zhuǎn)速離心10 min，再用10%全培把細胞密度調(diào)至2.0×104個·mL-1，接種在6 孔板中，顯微鏡下觀察至細胞貼壁生長到60%左右時，棄去細胞培養(yǎng)液，用PBS 清洗3 次，每次3 min，再加入無血清細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h 進行饑餓處理，然后添加不同濃度INHA 的細胞培養(yǎng)液對其進行處理：INHA 濃度分別為0、1.25、2.5、5、10、20 ng·mL-1，培養(yǎng)12 h后各收集1 mL 6個不同濃度INHA的細胞培養(yǎng)液，并棄去剩余的細胞培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，每次3 min，用0.25%胰酶消化細胞，完全消化后1 500 r·min-1離心10 min，將6 組處理的細胞加入1 mL PBS 中震蕩并在-80 ℃下反復(fù)凍融6 次（每次60 min，室溫條件下溶解后渦旋），完成6 次凍融后即可提取細胞內(nèi)容物。以同樣的方法用不同濃度的INHA 處理顆粒細胞后，分別提取細胞總RNA。

1.2.6 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）檢測FSHβ、LHβ、FSHR、LHR基因的表達 用TransZol 試劑盒提取6 組INHA處理的顆粒細胞RNA，再參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，置于-20 ℃條件下保存。qRT-PCR 反應(yīng)體系共20μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL、cDNA 2μL、上下游引物各0.5 μL、H2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。每個樣品重復(fù)檢測3次，利用2-ΔΔct法分析基因的相對表達量。

1.2.7 酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）檢測FSH、LH 含量 將提取的顆粒細胞上清液和內(nèi)容物在4 ℃、1 500 r·min-1條件下離心15 min，取上清液作為樣品待測。然后依次參照牛促卵泡素、牛促黃體素酶聯(lián)免疫分析試劑盒的操作步驟進行：加標準品、加樣品、加酶、溫育、配液、洗滌、顯色、終止，以450 nm 波長測定OD 值。再以標準品濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標建立標準曲線方程，將樣品OD 值代入標準曲線方程得出相應(yīng)濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為樣品的實際濃度。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 單因素方差分析4 種基因的相對表達水平，利用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)，用Graphpad prism 7.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛卵泡顆粒細胞體外培養(yǎng)結(jié)果

牦牛原代顆粒細胞生長速度較慢，形態(tài)呈多邊形；第二代顆粒細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可辨，生長速度較快，細胞貼壁較好，形態(tài)近似為梭形，細胞間出現(xiàn)接觸抑制，細胞生長融合度達到80%以上（圖1）。

圖1 牦牛顆粒細胞體外培養(yǎng)的生長情況Fig.1 Growth of yak granulosa cells in vitro culture

2.2 牦牛顆粒細胞的生長曲線

以第二代牦牛顆粒細胞培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標，細胞數(shù)量為縱坐標，繪制顆粒細胞生長曲線，結(jié)果生長曲線呈“平穩(wěn)-上升-平穩(wěn)”的走勢（圖2）。細胞培養(yǎng)第1～第2 天為緩慢生長的潛伏期，第3～第4 天為快速生長的對數(shù)期，第5～第8 天細胞生長緩慢，此階段為平臺期。

圖2 牦牛顆粒細胞生長曲線Fig.2 Growth curve of yak granulosa cells

2.3 FSHR和LHR在牦牛顆粒細胞中的分布

用FSHR、LHR 蛋白對牦牛顆粒細胞進行免疫標記（圖3），免疫熒光檢測顯示，DAPI主要在牦牛顆粒細胞的細胞核上顯色，F(xiàn)SHR 和LHR 的目的蛋白在細胞核和細胞質(zhì)均有表達，疊加后發(fā)現(xiàn)LHR 在細胞質(zhì)的表達比FSHR強。

圖3 FSHR、LHR在牦牛顆粒細胞的定位Fig.3 Localization of FSHR，LHR in yak granulosa cells

2.4 不同濃度INHA處理后對顆粒細胞FSHβ、LHβ、FSHR、LHR表達的調(diào)節(jié)

用濃度為0（A）、1.25（B）、2.5（C）、5（D）、10（E）、20 ng·mL-1（F）的INHA 處理第二代牦牛顆粒細胞12 h，結(jié)果如圖4所示。適當濃度的INHA 能明顯改變牦牛顆粒細胞FSHβ、LHβ、FSHR、LHR的表達水平。當INHA 濃度小于5 ng·mL-1時，顆粒細胞中FSHβ的表達量隨著INHA 濃度的增大而降低；當INHA 濃度大于5 ng·mL-1時，F(xiàn)SHβ的表達量顯著高于D 處理組。當INHA 濃度小于10 ng·mL-1時，顆粒細胞中LHβ的表達量隨著INHA 濃度的增大而降低；當INHA 濃度大于10 ng·mL-1時，LHβ的表達量顯著高于E處理組。A～F六個處理組結(jié)果均顯示，隨著INHA 濃度的增大，顆粒細胞中FSHR和LHR的表達量逐漸降低（圖4）。

圖4 不同濃度INHA作用牦牛顆粒細胞后FSHβ、FSHR、LHβ、LHR基因的相對表達水平Fig.4 Relative expression levels of FSHβ，F(xiàn)SHR，LHβ，LHR by yak granulosa cells treated with different concentrations of INHA

2.5 不同濃度INHA 處理后對顆粒細胞分泌FSH、LH的調(diào)節(jié)

用濃度為0（A）、1.25（B）、2.5（C）、5（D）、10（E）、20 ng·mL-1（F）的INHA 處理第二代牦牛顆粒細胞12 h，結(jié)果如圖5所示。當INHA 濃度為5 ng·mL-1時，細胞內(nèi)外FSH 含量均最低；INHA 濃度為10 ng·mL-1時，細胞內(nèi)外LH 含量均最低。在細胞內(nèi)容物中，D 處理組的FSH 含量顯著低于E 處理組，而E 處理組的FSH 含量顯著低于A、B、C、F 處理組；E 處理組的細胞內(nèi)LH 含量顯著低于D 處理組，而D 處理組的LH 含量顯著低于A、B、C、F 處理組。在細胞上清液中，D處理組的FSH 含量顯著低于A、B、C、E、F 處理組，而B、C、E、F 處理組的FSH 含量顯著低于A 處理組；細胞外E 處理組的LH 含量顯著低于A、B、C、D、F 處理組，而B、C、D、F 處理組的LH 含量顯著低于A 處理組。

圖5 不同濃度INHA作用牦牛顆粒細胞后分泌FSH、LH的激素水平Fig.5 Hormone levels of FSH and LH secreted by yak granulosa cells treated with different concentrations of INHA

3 討論

顆粒細胞是卵巢中的主要細胞類型，為卵母細胞的生長提供微環(huán)境和物理支持［21］。研究發(fā)現(xiàn)，在不同的細胞模型中，INHA 被認為與細胞增殖和凋亡有關(guān)，即能促進顆粒細胞增殖并抑制顆粒細胞凋亡［22］；顆粒細胞可以維持卵巢的正常功能，當顆粒細胞發(fā)生凋亡時會導致卵泡閉鎖［23］。本試驗結(jié)果顯示，適當濃度的INHA 可以降低牦牛卵泡顆粒細胞中FSH、LH 及其受體的表達，說明INHA 作為雌性動物特有的一種激素，對調(diào)控牦牛生殖機理具有重要影響。用濃度為0、1.25、2.5、5、10、20 ng·mL-1的INHA 處理牦牛卵泡顆粒細胞12 h，發(fā)現(xiàn)FSH、LH 在顆粒細胞內(nèi)容物和細胞上清液中的含量存在顯著差異，且二者通過與顆粒細胞膜上的受體結(jié)合調(diào)節(jié)卵泡的生長發(fā)育和排卵［24］，證明INHA對雌性牦牛的生殖調(diào)控具有重要影響。

哺乳動物卵泡的發(fā)育和排卵主要受促性腺激素的調(diào)控，尤其是FSH 和LH 在卵泡不同發(fā)育階段發(fā)揮重要作用［25］。FSH主要促進有腔卵泡的生長發(fā)育，LH能夠觸發(fā)成熟卵泡排卵，且二者協(xié)同促進卵泡中雌激素的分泌［19］。INH 對卵泡顆粒細胞中的FSH 和LH 具有負反饋調(diào)節(jié)作用，INH 可以抑制垂體分泌FSH 和LH，而FSH 可以刺激卵泡顆粒細胞分泌INHA［17］，由此推斷INHA 對牦牛卵泡顆粒細胞有重要影響。本試驗結(jié)果顯示，牦牛卵泡顆粒細胞中FSHβ和LHβ基因的表達與INHA 呈劑量依賴性關(guān)系，其表達量隨INHA 濃度的增大呈先下降后上升的趨勢，且FSHβ和LHβ表達量最低時，INHA 濃度分別接近5 ng·mL-1和10 ng·mL-1，證明INHA 能夠影響FSHβ和LHβ在顆粒細胞中的表達，而是顆粒細胞中兩種基因的表達量受INHA 濃度變化的影響。

本研究以牦牛卵泡顆粒細胞為模型進行體外細胞培養(yǎng)試驗，經(jīng)牦牛卵泡顆粒細胞原代培養(yǎng)后進行傳代，獲得了細胞生長穩(wěn)定、形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰的第二代牦牛卵泡顆粒細胞。IF 檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)SHR 和LHR 在牦牛顆粒細胞的細胞核和細胞質(zhì)均有表達，而LHR 在細胞質(zhì)的表達比FSHR 強，說明LHR 的作用部位以細胞質(zhì)為主，F(xiàn)SHR 在細胞質(zhì)和細胞核均發(fā)揮作用。由于受體在細胞內(nèi)需要與相應(yīng)的配體結(jié)合發(fā)揮其作用［26-27］，由此推斷FSH 和LH 對卵巢發(fā)揮的作用主要由受體決定。

本試驗用0、1.25、2.5、5、10、20 ng·mL-1INHA 處理第二代牦牛卵泡顆粒細胞12 h后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR和LHR基因在牦牛卵泡顆粒細胞中的表達水平隨著INHA 濃度的增大而降低。INHA 明顯抑制FSHR、LHR在顆粒細胞中的表達，且抑制作用隨INHA 濃度增大而增強。FSHR 和LHR 能夠與相應(yīng)的配體結(jié)合發(fā)揮作用，INHA的抑制作用明顯降低了FSH、LH 與受體的結(jié)合率，最終導致FSHβ和LHβ基因在顆粒細胞中的表達量升高，由此推斷INHA可以降低FSH、LH與其受體的結(jié)合率。

INHA由卵泡顆粒細胞產(chǎn)生，該物質(zhì)可以對顆粒細胞內(nèi)的激素發(fā)揮協(xié)調(diào)作用［28-29］，其中FSH 和LH 直接影響動物的發(fā)情、排卵、妊娠等過程［30］。本研究通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，A～F六個處理組中，D處理組的顆粒細胞內(nèi)外FSH 含量顯著低于其他5 個處理組，而E 處理組的顆粒細胞內(nèi)外LH 含量顯著低于其他5 個處理組，說明適當濃度的INHA 可以減少顆粒細胞中FSH和LH 的含量，以此證明INHA 可以抑制顆粒細胞分泌FSH 和LH［9］。將細胞內(nèi)容物中FSH 和LH 的含量與細胞上清液中FSH 和LH 的含量相比發(fā)現(xiàn)，除對照組A外，當細胞內(nèi)容物中FSH 和LH 含量下降時，細胞上清液中FSH 和LH 含量呈上升趨勢，由此說明INHA 對調(diào)控顆粒細胞內(nèi)外FSH 和LH 的含量有濃度適應(yīng)性，從而維護卵巢功能的穩(wěn)定。本試驗還需要驗證相關(guān)受體在牦牛卵巢和卵泡中的表達變化規(guī)律。

4 結(jié)論

INHA 對FSHR 和LHR 在牦牛卵泡顆粒細胞中的表達存在明顯的抑制作用，并且影響FSH 和LH 在卵泡中發(fā)揮的作用。研究表明INHA 能抑制牦牛卵泡顆粒細胞中FSH、LH與其受體的結(jié)合，同時INHA對顆粒細胞內(nèi)外FSH和LH的含量有重要調(diào)節(jié)作用。