李松文 孟凡亮 劉麗紅 簡 越 李園園 汪俏梅

（浙江大學(xué)園藝系/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝植物生長發(fā)育與品質(zhì)控制重點開放實驗室，浙江 杭州 310058）

番茄（Solanum lycopersicum）是茄科番茄屬一年生草本植物，起源于南美洲，具有悠久的栽培史，是我國乃至世界范圍內(nèi)種植最廣泛的蔬菜之一。番茄果實風(fēng)味獨特，營養(yǎng)豐富，富含多種生物活性物質(zhì)，深受消費(fèi)者的青睞［1］。番茄因具有較小的基因組、較短的生長發(fā)育周期、其轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成熟等優(yōu)點，成為分子研究領(lǐng)域的模式植物。2012年番茄全基因組序列得到解析，在很大程度上推動了以番茄為模式植物的分子生物學(xué)研究［1］。番茄果實的成熟是其生長發(fā)育的重要過程，因此成為研究的重點，其成熟過程主要包括外觀品質(zhì)、風(fēng)味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)的形成。其中類胡蘿卜素的組分和含量變化是番茄果實成熟過程中的重要變化之一，也是番茄品質(zhì)形成的重要基礎(chǔ)。

類胡蘿卜素是普遍存在于自然界的脂溶性天然色素，存在于所有光合生物（植物、光合藻類和光合細(xì)菌）［2-3］、部分非光合細(xì)菌和真菌中［4］，在光合生物中的主要生物學(xué)功能是光合作用和光保護(hù)［5］；在哺乳動物中，部分類胡蘿卜素作為維生素A（視黃醇）的前體，對視力和細(xì)胞生長分化等多個生理過程起著關(guān)鍵作用［6］，同時在抗氧化［7-8］、預(yù)防心血管疾病［9］、抗癌［10］等方面也具有重要功效，在食品［11］、化工［12］、醫(yī)藥［13-14］等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

類胡蘿卜素在成熟番茄果實中的含量豐富，是番茄果實品質(zhì)的重要組成部分。目前番茄中類胡蘿卜素的合成途徑已經(jīng)得到充分解析。類胡蘿卜素的合成在質(zhì)體中完成，從來自2-甲基赤蘚糖醇-4-磷酸（2-Cmethyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途徑產(chǎn)生的異戊烯焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）［15］開始，經(jīng)牻牛兒牻牛兒焦磷酸合成酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS）催化合成牻牛兒牻牛兒焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP），再由八氫番茄紅素合成酶1（phytoene synthase 1，PSY1）催化兩分子GGPP 縮合形成15-順式-八氫番茄紅素［16-17］，進(jìn)而通過八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS）、ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶（ζ-carotene isomerase，ZISO）和ζ-胡蘿卜素去飽和酶（ζ-carotene desaturase，ZDS）催化的連續(xù)生物反應(yīng)產(chǎn)生順式番茄紅素，然后由類胡蘿卜素異構(gòu)酶（carotene isomerase，CrtISO）轉(zhuǎn)化為反式番茄紅素，進(jìn)一步合成α-和β-胡蘿卜素［18-19］。在這一途徑中，PSY1 是關(guān)鍵的限速酶，該酶的缺失將阻礙果實成熟期間類胡蘿卜素的合成，使果實呈現(xiàn)出黃色［20］，而過表達(dá)將提高果實中類胡蘿卜素的積累［21］。茄科不同番茄屬中的同源PSY1基因具有高度保守的活性位點和催化位點，PSY1基因的表達(dá)與番茄果實中類胡蘿卜素含量直接相關(guān)［17，22］。

在擬南芥中，光敏色素互作因子PIF1（phytochrome interacting factor 1）可直接結(jié)合AtPSY1啟動子上的Gbox 負(fù)調(diào)控AtPSY1的表達(dá)；在pif突變體中，AtPSY1具有更高的表達(dá)量，且植株中類胡蘿卜素含量更高［23］；bZIP 家族轉(zhuǎn)錄因子HY5（long hypocotyl 5）同樣結(jié)合AtPSY1啟動子上的G-box 區(qū)域，正向調(diào)控AtPSY1的表達(dá)［24］。在番茄中，HY5 可結(jié)合SlPSY1啟動子區(qū)域的G-box 和ACE-box，正向調(diào)控其表達(dá)，hy5突變體果實成熟延遲，類胡蘿卜素含量明顯降低［25］；MADS家族轉(zhuǎn)錄因子TAGL1（tomato agamous-like 1）、RIN（ripening inhibitor）和FUL1（fruitfull 1）可直接結(jié)合SlPSY1的啟動子，正向調(diào)控SlPSY1的表達(dá)［26］；PIF1a可結(jié)合SlPSY1啟動子區(qū)域的PBE-box，負(fù)調(diào)控其表達(dá)；NAC家族轉(zhuǎn)錄因子NAC1 也可結(jié)合SlPSY1啟動子而抑制其表達(dá)；Bbox 家族蛋白BBX20 可結(jié)合SlPSY1啟動子區(qū)域的Gbox 調(diào)控SlPSY1的表達(dá)，過表達(dá)BBX20 可使SlPSY1表達(dá)量上升，且果實中類胡蘿卜素含量升高［26-27］；STAYGREEN（SlSGR）基因編碼的SlSGR1 蛋白與SlPSY1 蛋白可聚合為二聚體形式抑制SlPSY1 蛋白活性，抑制SlSGR1的表達(dá)可以促進(jìn)果實番茄紅素和β-胡蘿卜素的積累［28］。為深入探索番茄類胡蘿卜素代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本研究利用酵母單雜交篩庫技術(shù)篩選直接結(jié)合SlPSY1基因啟動子的轉(zhuǎn)錄因子，研究轉(zhuǎn)錄因子在番茄果實發(fā)育和品質(zhì)形成中的關(guān)鍵作用及其分子機(jī)制，以期為進(jìn)一步解析番茄類胡蘿卜素的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

番茄樣品為浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院汪俏梅教授實驗室種植的野生型Solanum lycopersicumL.Mill.cv.Ailsa Craig（AC）；限制性內(nèi)切酶購自賽默飛世爾公司（上海）；KOD Fx酶購于碩盟生物科技有限公司（杭州）；入門載體pEASY Blunt Zero cloning vector 和Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購于創(chuàng)試生物科技有限公司（杭州）；大腸桿菌E.coliDH5α、Y1H Gold 感受態(tài)細(xì)胞、PEG/LiAc 和Carrier DNA 購于唯地生物技術(shù)有限公司（上海）；Solution ⅠDNA 連接酶購于寶生物工程（大連）有限公司；金擔(dān)子素（aureobasidin A，AbA）購于翊圣生物科技有限公司（上海）；Easy Yeast Plasmid Isolation Kit酵母質(zhì)粒提取試劑盒（Cat.No.630467）購于柏贊生物科技有限公司（杭州）；引物序列均由擎科生物科技有限公司合成（杭州）。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因表達(dá)模式的分析 根據(jù)基因號，在Tomato eFP Browser（http：//bar.utoronto.ca/efp_tomato/cgi-bin/efpWeb.cgi）網(wǎng)站上搜索SlPSY1及其同源基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)，基于檢索得到的表達(dá)量數(shù)據(jù)，利用TBtools 軟件進(jìn)行不同基因的表達(dá)熱圖分析，使用Origin 9軟件對不同基因的表達(dá)量進(jìn)行柱狀圖分析。

1.2.2 構(gòu)建酵母誘餌表達(dá)載體

1.2.2.1 目的基因啟動子序列的克隆 在植物基因組資源網(wǎng)站（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）中搜索SlPSY1基因啟動子序列（SlPSY1pro），設(shè)計啟動子的引物F1：5′-CGACGATAACAAGGATTAGGCAAC-3′和R1：5′-CTCTTTCAACAATGGCCACTCTG-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增（體系和程序參照KOD FX酶說明書），將擴(kuò)增的片段（啟動子序列見附錄）連接至入門載體pEASY Blunt Zero cloning vector 上，獲得重組質(zhì)粒SlPSY1pro-pEASY，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞中，在含卡那霉素的LB（Luria-Bertani medium）固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選單菌落用引物F1 和R1 進(jìn)行陽性檢測，選擇陽性菌落進(jìn)行搖菌并送至北京擎科生物科技有限公司測序，對測序正確的菌株用70%的甘油進(jìn)行保存，液氮速凍并放入-80 ℃冰箱備用。

1.2.2.2 目的基因啟動子序列連接pAbAi 載體 設(shè)計帶有KpnⅠ和SalⅠ酶切位點和保護(hù)堿基的引物F2：5′-GGggtaccCGACGATAACAAGGATTAGGCAAC-3′和R2：5′-GCgtcgacCTCTTTCAACAATGGCCACTCTG-3′，以測序正確的重組質(zhì)粒SlPSY1pro-pEASY 為模板用KOD 高保真酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（體系和程序見KOD FX酶說明書），將PCR產(chǎn)物和pAbAi載體用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SalⅠ酶切，酶切后的PCR 產(chǎn)物和載體采用solution ⅠDNA 連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α 中，涂板至氨芐霉素LB 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選單菌落使用載體引物pAbAi-F：5′-GTTCCTTATATGTAGCTTTCGACA-3′和片段引物R2進(jìn)行陽性檢測，挑取陽性菌落搖菌測序，將測序正確的菌株用70%的甘油進(jìn)行保存，液氮速凍并放入-80 ℃冰箱保存，即得到pSlPSY1pro-AbAi重組質(zhì)粒。

1.2.2.3 誘餌報告酵母菌株的構(gòu)建 使用BstB I 限制性內(nèi)切酶在65 ℃條件下將pSlPSY1pro-AbAi 重組質(zhì)粒酶切3 h，使其在URA3 基團(tuán)處斷開而處于線性化狀態(tài)。以未酶切的重組質(zhì)粒為對照，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并純化回收酶切產(chǎn)物。取100μL冰上融化的Y1H Gold 感受態(tài)細(xì)胞，依次加入冰上預(yù)冷的線性化pSlPSY1pro-AbAi 重組質(zhì)粒2～5 μg，Carrier DNA（95～100 ℃，5 min，快速冰浴，重復(fù)2 次）10 μL，PEG/LiAc 500μL并吸打混勻，30 ℃水浴30 min，42 ℃水浴15 min，5 000 r·min-1離心40 s，棄上清；加入400μL ddH2O 重懸，離心30 s 棄上清；加入50μL ddH2O 重懸，涂板于預(yù)先配制的SD/-Ura 固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48～96 h。挑選部分酵母單一菌落，用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 體系進(jìn)行菌落PCR（體系和程序參照2×Taq 酶說明書），以驗證pSlPSY1pro-AbAi 重組質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞中。分別挑取PCR 檢測呈陽性的誘餌克隆，在SD/-Ura 平板上劃線培養(yǎng)。30 ℃條件下孵育3 d 后，將平板置于4 ℃保存，即為新構(gòu)建的pSlPSY1pro-AbAi 酵母菌株。挑取單克隆在YPDA 液體培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose adenine medium）中過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，用1 mL預(yù)冷培養(yǎng)基［100 mL 滅菌的YPDA 與50 mL 滅菌的75%甘油混合］，重懸菌體，液氮速凍后置于-80 ℃條件下保存。

1.2.3 酵母單雜篩庫

1.2.3.1 cDNA 文庫的構(gòu)建 取野生型番茄（AC）的葉片以及綠熟期和紅熟期果實的鮮樣，送至TaKaRa公司（杭州）構(gòu)建番茄混合組織酵母雜交cDNA文庫。

1.2.3.2 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備 吸取10 μL 保存于-80 ℃的pSlPSY1pro-AbAi 酵母菌株至10 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r·min-1搖菌2 d，待酵母搖至OD600為1.0 左右即可；取10 mL 酵母菌液轉(zhuǎn)移到含有200 mL YPDA 液體培養(yǎng)基的1 L 錐形瓶中，搖菌至OD600為0.4～0.6，將酵母菌液分裝到5個50 mL離心管，室溫下4 000 r·min-1離心5 min；棄上清，向每個離心管中加入25 mL ddH2O，震蕩重懸，室溫下4 000 r·min-1離心5 min；棄上清，向每個離心管中加入200 μL 現(xiàn)配的LiAc/TE 溶液，重懸酵母菌液并立即置于冰上備用。

1.2.3.3 酵母轉(zhuǎn)化 吸取100μL 冰上制備的酵母感受態(tài)，依次加入預(yù)冷的cDNA 文庫2～5μg，Carrier DNA 10 μL（95 ℃，5 min，快速冰浴，重復(fù)2 次），PEG/LiAc 500 μL 并用槍頭吸打混勻，30 ℃水浴30 min；42 ℃水浴15 min，室溫下5 000 r·min-1離心40 s 棄上清；加入400 μL ddH2O 重懸，離心30 s 棄上清；加入150 μL ddH2O 重懸，吸取100 μL 涂板于預(yù)先配制的SD/-Leu/AbA150固體培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)4～6 d。

1.2.3.4 陽性克隆的鑒定 將陽性克隆在SD/-Leu/AbA150固體培養(yǎng)基上重新劃線，產(chǎn)生新的單克隆，2～4 d后，選擇能夠正常生長的單克隆，加入3～5 mL SD/-URA的液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r·min-1條件下過夜搖菌；為了鑒定陽性互作的基因，用酵母質(zhì)粒提取試劑盒提取酵母質(zhì)粒；將提取的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，并用含有100μg·mL-1氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，挑選能正常生長的大腸桿菌，使用2×Taqmix 50μL體 系，以T7：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′和3′AD：5′-AGATGGTGCACGATGCACAG-3′為引物，對插入到pGADT7 載體中的cDNA 片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（體系和程序參照2×Taq 酶說明書），取10 μL PCR 產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，挑選陽性產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司利用T7引物測序。然后將測序結(jié)果在JGI網(wǎng)站上（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）進(jìn)行在線比對，確認(rèn)未產(chǎn)生移碼突變，即作為候選基因繼續(xù)酵母單雜點對點驗證試驗。

1.2.4 酵母單雜點對點驗證 根據(jù)JGI 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中SlJERF1基因序列設(shè)計PCR 引物，以番茄葉片的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到番茄cDNA，用KOD Fx酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接至入門載體pEASY Blunt Zero cloning vector 上，得到SlJERF1-pEASY 重組質(zhì)粒。用分別帶有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點和保護(hù)堿基的SlJERF1特異性引物F3：5′-GgaattcATGTGTGGTGGTGCAATTATCTC-3′和R3：5′-CGggatccTTAGTAGGCACCTCCCATTAAAG-3′，以SlJERF1-pEASY 重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（體系和程序參照KOD FX 酶說明書），得到帶有酶切位點的SlJERF1特異性片段。將產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收并純化，用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ對SlJERF1特異性片段和pGADT7-AD 載體進(jìn)行雙酶切，回收目的片段和酶切后的載體，用Solution ⅠDNA 連接酶進(jìn)行連接，得到pGADT7-SlJERF1重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化pSlPSY1pro-AbAi 菌株感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Leu 和SD/-Leu/AbA150培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)3 d，以pGADT7-AD 空載轉(zhuǎn)化到pSlPSY1pro-AbAi 酵母作為陰性對照，觀察菌斑生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlPSY1及其同源基因表達(dá)模式的分析

對番茄PSY的3 個同源基因SlPSY1（Solyc03g0318 60）、SlPSY2（Solyc02g081330）和SlPSY3（Solyc01g0059 40）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示SlPSY1在番茄果實成熟過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。由圖1可以看出，SlPSY2和SlPSY3在番茄生長發(fā)育的整個過程中表達(dá)量較低或不表達(dá)，而SlPSY1基因在果實成熟，特別是破色期之后表達(dá)量急劇升高。為深入探索番茄果實類胡蘿卜素代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，利用酵母單雜交篩庫技術(shù)篩選直接結(jié)合SlPSY1基因啟動子的轉(zhuǎn)錄因子。

圖1 SlPSY1及其同源基因在不同時期表達(dá)量Fig.1 Expression of SlPSY1 and its homologous genes in different periods

2.2 pSlPSY1pro-AbAi酵母誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)SlPSY1基因啟動子序列，使用特異性引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2-A所示，擴(kuò)增條帶大小為1 016 bp，將目的片段轉(zhuǎn)入至入門載體pEASY Blunt Zero cloning vector上，獲得重組質(zhì)粒SlPSY1pro-pEASY。以重組質(zhì)粒SlPSY1pro-pEASY 為模板，使用帶有KpnⅠ和SalⅠ酶切位點和保護(hù)堿基的引物F2 和R2進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并將PCR 產(chǎn)物和pAbAi 載體用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SalⅠ酶切，連接，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌，使用引物pAbAi-F 和引物R2 進(jìn)行PCR 檢測，如圖2-B 所示，陽性pSlPSY1pro-AbAi載體的擴(kuò)增條帶大小為1 270 bp。將陽性pSlPSY1pro-AbAi 線性化，結(jié)果如圖2-C 所示，為環(huán)狀和線性化的pSlPSY1pro-AbAi載體，將線性化的pSlPSY1pro-AbAi 載體轉(zhuǎn)入Y1H Gold 感受態(tài)細(xì)胞，用Matchmaker Insert Check PCR Mix1 對Y1H Gold 酵母感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖2-D所示，陽性誘餌載體電泳條帶大小為2 350 bp，表明pSlPSY1pro-AbAi 酵母誘餌表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 pSlPSY1pro-AbAi酵母誘餌表達(dá)載體構(gòu)建Fig.2 Construction of pSlPSY1pro-AbAi yeast bait vector

2.3 AbA背景濃度的篩選

以SlPSY1pro-pEASY質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR獲得目的啟動子序列并構(gòu)建到誘餌載體上，將獲得的pSlPSY1pro-AbAi 重組質(zhì)粒經(jīng)線性化并轉(zhuǎn)化Y1H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞，得到陽性誘餌菌株，經(jīng)搖菌并涂布于SD/-Ura固體培養(yǎng)基上篩選，觀察酵母生長情況。結(jié)果顯示，抑制酵母生長的AbA 最小濃度為100 ng·mL-1，在后續(xù)試驗中采用150 ng·mL-1的AbA 濃度以充分抑制酵母的生長。

2.4 酵母單雜篩庫

通過酵母單雜交技術(shù)篩選出與番茄PSY1啟動子結(jié)合的蛋白。轉(zhuǎn)化后的酵母在SD/-Leu/AbA150固體培養(yǎng)基上生長3～5 d，為減少假陽性，將長出的酵母菌斑在SD/-Leu/AbA150固體培養(yǎng)基上重新劃線培養(yǎng)，初步排除假陽性后，利用T7 和3′AD 引物進(jìn)行PCR，對插入到pGADT7 載體中的cDNA 片段進(jìn)行擴(kuò)增，如圖3所示，電泳結(jié)果表明條帶長度大部分在500～1 500 bp 之間。經(jīng)測序并在JGI 網(wǎng)站進(jìn)行蛋白預(yù)測分析，結(jié)果如表1所示，初步獲得SlJERF1轉(zhuǎn)錄因子和多個未知功能的蛋白，選擇ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子SlJERF1 進(jìn)行酵母單雜點對點驗證。

圖3 酵母單雜交篩庫部分菌落PCR鑒定Fig.3 PCR identification of selected colonies in yeast-one-hybrid screening library

表1 SlPSY1啟動子DNA結(jié)合蛋白篩選Table 1 The binding protein screening of SlPSY1 promoter sequence

2.5 酵母單雜點對點互作驗證

利用特異性引物克隆獲得SlJERF1基因大小為11.9 bp（如圖4-A 所示）。圖4-B 為成功構(gòu)建的pGADT7-SlJERF1重組質(zhì)粒電泳圖，將重組質(zhì)粒和pGADT7-AD 空載分別轉(zhuǎn)化至pSlPSY1pro-AbAi 酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Leu 和SD/-Leu/AbA150固體培養(yǎng)基上，如圖4-C 所示，pGADT7-AD 空載對應(yīng)的酵母細(xì)胞在SD/-Leu 培養(yǎng)基上正常生長，而在SD/-Leu/AbA150培養(yǎng)基上不能正常生長；pGADT7-SlJERF1重組質(zhì)粒對應(yīng)的酵母細(xì)胞在SD/-Leu和SD/-Leu/AbA150培養(yǎng)基上均能正常生長，表明SlJERF1 與SlPSY1基因啟動子之間的相互作用激活了報告基因AbAr的表達(dá)，進(jìn)而證明轉(zhuǎn)錄因子SlJERF1與SlPSY1基因啟動子間存在互作。為進(jìn)一步驗證其互作關(guān)系，取0、10-1、10-2和10-3四種稀釋倍數(shù)的pGADT7-SlJERF1重組質(zhì)粒對應(yīng)的酵母感受態(tài)細(xì)胞和pGADT7-AD 空載對應(yīng)的酵母感受態(tài)細(xì)胞滴板于SD/-Leu 和SD/-Leu/AbA150固體培養(yǎng)基上，如圖4-D 所示，在SD/-Leu 培養(yǎng)基上，pGADT7-AD 和pGADT7-SlJERF1在四種稀釋倍數(shù)下均能正常生長；而在SD/-Leu/AbA150培養(yǎng)基上，pGADT7-AD 在不稀釋的情況下只有微弱的生長，在10-1、10-2和10-3三種稀釋倍數(shù)下均不能正常生長，pGADT7-SlJERF1在0、10-1、10-2和10-3四種稀釋倍數(shù)下均能正常生長，由此進(jìn)一步證明了SlJERF1與SlPSY1基因啟動子存在互作。

圖4 SlJERF1酵母點對點驗證Fig.4 SlJERF1 yeast point-to-point validation

2.6 SlPSY1及SlJERF1的共表達(dá)分析

利用Tomato eFP Browser 網(wǎng)站檢索SlPSY1（Solyc03g031860）和SlJERF1（Solyc06g063070）基因不同時期的表達(dá)量數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖5所示。從1 cm 果開始，SlPSY1和SlJERF1的表達(dá)量均逐漸提高，其中SlJERF1的表達(dá)量在破色期達(dá)到峰值，而SlPSY1的表達(dá)量在破色期后繼續(xù)增高，表明SlJERF1的表達(dá)量峰值提前于SlPSY1的表達(dá)量峰值，符合轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控功能蛋白的表達(dá)模式，從側(cè)面反映了SlJERF1 可能調(diào)控SlPSY1的表達(dá)。

圖5 SlPSY1和SlJERF1在番茄果實不同生長時期的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression of SlPSY1 and SlJERF1 in tomato fruit at different growth stages

3 討論

酵母單雜交技術(shù)是利用目的基因上游的啟動子誘餌序列，與cDNA 文庫之間的獵物轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行相互作用，啟動誘餌序列下游報告基因的表達(dá)，通過篩選得到與誘餌序列互作的轉(zhuǎn)錄因子，是篩選轉(zhuǎn)錄因子的有效方法［29］。本研究利用酵母單雜交技術(shù)，以SlPSY1基因啟動子序列為誘餌，篩選出調(diào)控SlPSY1基因的轉(zhuǎn)錄因子SlJERF1，并通過酵母單雜點對點驗證試驗證明了SlJERF1與SlPSY1基因啟動子存在互作。

SlJERF1屬于AP2/ERF（APETALA2/ethylene responsive element binding factors）大家族，ERF亞族的轉(zhuǎn)錄因子。已有研究表明，AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子包含大約由60個氨基酸組成的AP2 DNA 結(jié)合域，可直接與順式作用元件相互作用［30］，包括脫水反應(yīng)元件（dehydration responsive element，DRE）、C 重復(fù)元件（C-repeat element，CRT）和GCC 盒元件（GCC-box）等［31］。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)植物發(fā)育的各個過程，在激素調(diào)節(jié)和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。在本研究中，SlJERF1 與SlPSY1基因啟動子存在互作，對啟動子序列進(jìn)行順式作用元件分析時，存在多個ARE、CAATbox、CAT-box、ERE、G-box、TATA-box、W-box、CArGbox 以及負(fù)責(zé)SlPSY1啟動子活性的ATCTA 序列等元件。且在序列中未找到可以與AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子直接作用的DRE/CRT/GCC-box 元件。表明AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子可能通過結(jié)合SlPSY1啟動子的ATCTA序列從而發(fā)揮作用，進(jìn)而調(diào)控SlPSY1的表達(dá)，這為AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子的研究提供了新思路。

前人研究表明，JERF1的過表達(dá)可以激活脅迫相關(guān)和脫落酸（abscisic acid，ABA）合成相關(guān)的基因表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)煙草對高鹽［32］和低溫［33］的耐受性；在水稻中，過表達(dá)JERF1激活A(yù)BA 合成和其他脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻的耐旱性［34］。在分子和生理水平上，JERF1可以上調(diào)信號和防御相關(guān)基因的表達(dá)，增加脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）和苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）的活性，從而提高轉(zhuǎn)基因水稻對紋枯病的抗性［35］；在番茄中，鹽、乙烯、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）和ABA 處理均可誘導(dǎo)JERF1基因的表達(dá)，表明JERF1 在不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起著核心作用［32］。在果實的成熟過程中，ERF家族成員發(fā)揮著不可忽視的作用。番茄基因組中有77 個ERF 轉(zhuǎn)錄因子，對野生型和成熟受損的番茄突變體（rin，nor，Nr）進(jìn)行ERFs綜合表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)27 個ERFs在成熟開始時表達(dá)增強(qiáng)，28 個ERFs在成熟過程中表達(dá)減少，表明不同的ERF在果實成熟過程中可能發(fā)揮著相反的作用［36］，其中SlJERF1在成熟突變體中表現(xiàn)出顯著的下調(diào)，說明SlJERF1 可能有助于番茄果實的成熟［36］。本研究證明SlJERF1與SlPSY1基因啟動子存在相互作用，結(jié)合前人的研究，可以推測SlJERF1可能通過調(diào)控SlPSY1的表達(dá)，進(jìn)而對番茄果實類胡蘿卜素的合成和果實成熟發(fā)揮作用，這為進(jìn)一步豐富類胡蘿卜素合成和果實成熟調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的思路。

4 結(jié)論

本研究首先對SlPSY1及其同源基因SlPSY2、SlPSY3的表達(dá)量進(jìn)行分析，表明SlPSY1在果實轉(zhuǎn)色過程中表達(dá)量急劇升高，而SlPSY2、SlPSY3基本不表達(dá)。SlPSY1 是類胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶，后續(xù)選擇SlPSY1為目的基因，克隆其啟動子序列，構(gòu)建pSlPSY1pro-AbAi 酵母誘餌表達(dá)載體，利用以野生型番茄葉片及綠熟期和紅熟期果實的鮮樣構(gòu)建的番茄混合組織酵母雜交cDNA 文庫進(jìn)行酵母單雜交驗證，篩選得到AP2/ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子SlJERF1，并通過酵母單雜點對點驗證進(jìn)行驗證。結(jié)果表明，SlJERF1 可以與SlPSY1基因啟動子相互作用，可能對SlPSY1基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。

附錄 SlPSY1啟動子序列（5′→3′）

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