戴王娟，覃蓮菊，崔毓桂，劉嘉茵

(南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南京 210029)

隨著現(xiàn)代社會(huì)醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，人類預(yù)期壽命自上世紀(jì)起開(kāi)始逐漸增加，但在女性絕經(jīng)時(shí)間與生殖潛能的保持方面，并沒(méi)有出現(xiàn)同步改善的趨勢(shì)。當(dāng)女性年齡超過(guò)35歲，其卵巢儲(chǔ)備功能開(kāi)始下降，并伴隨卵母細(xì)胞的質(zhì)量、數(shù)量下降以及異常胚胎發(fā)生率及流產(chǎn)率明顯升高。但我們目前對(duì)生殖衰老的機(jī)制仍不清楚[1]。

卵母細(xì)胞是影響卵子受精及發(fā)育成胚胎的核心環(huán)節(jié)之一，其數(shù)量的減少以及質(zhì)量的下降是造成女性不孕的重要因素。卵母細(xì)胞不同于體細(xì)胞，承擔(dān)著提供大量胚胎發(fā)育所需的母源性物質(zhì)的重要角色，其成熟依賴充足而穩(wěn)定的能量來(lái)源保障，而這種保障的基礎(chǔ)是線粒體作為“能量工廠”功能的正常發(fā)揮[2]。Ca2+作為細(xì)胞重要的第二信使，通過(guò)調(diào)控線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵酶的活性，對(duì)ATP生成具有重要意義。研究證實(shí)，當(dāng)線粒體Ca2+攝取不足會(huì)導(dǎo)致能量產(chǎn)生障礙，而線粒體Ca2+過(guò)載也會(huì)引起線粒體膜電位下降，繼而誘發(fā)線粒體功能障礙[3-4]。因此，卵母細(xì)胞中Ca2+傳導(dǎo)是胞質(zhì)成熟的基礎(chǔ)之一。

線粒體Ca2+攝取的主要來(lái)源是作為鈣儲(chǔ)庫(kù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)與線粒體外膜耦聯(lián)，形成“系繩”樣結(jié)構(gòu)，持續(xù)穩(wěn)定地傳輸Ca2+，這一特殊結(jié)構(gòu)被稱為線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(Mitochondrial associated membrane，MAM)[5]。目前有關(guān)MAM介導(dǎo)的線粒體Ca2+攝取異常在一些衰老疾病模型(如神經(jīng)退行性病變、心肌衰老等)中有所研究，但在生殖系統(tǒng)領(lǐng)域尚未見(jiàn)大篇幅研究報(bào)道。本文將通過(guò)綜述MAM的結(jié)構(gòu)組成、相關(guān)蛋白組分與功能，重點(diǎn)闡述MAM與卵母細(xì)胞成熟與發(fā)育之間的關(guān)系，并介紹相關(guān)研究的最新進(jìn)展。

一、MAM的結(jié)構(gòu)與功能

從形態(tài)學(xué)而言，MAM并非一個(gè)特化出的固定結(jié)構(gòu)。MAM的形成更多的是依賴于線粒體外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜膜間距而形成的一個(gè)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)[6]。當(dāng)兩種細(xì)胞器的膜間距處于一個(gè)合適的范圍時(shí)(目前研究者多認(rèn)為應(yīng)<100 nm)，MAM即可能形成[7]。Poston等[8]對(duì)MAM進(jìn)行了蛋白組學(xué)的鑒定，報(bào)道了存在于MAM的1 212個(gè)候選蛋白，并揭示了其結(jié)構(gòu)組成：位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體膜上的Ca2+通道、脂質(zhì)合成及轉(zhuǎn)移酶類、各種分子伴侶和連接蛋白。其中，定位于MAM介導(dǎo)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白主要有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3R)、線粒體外膜(Mitochondrial outer membrane，MOM)的電壓依賴性陰離子選擇性通道(Voltage-dependent anion channel，VDAC)和線粒體內(nèi)膜(Mitochondrial inner membrane，MIM)的線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(Mitochondrial calcium uniporter，MCU)。

雖然研究者們多將線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜間距<100 nm的區(qū)域定義為MAM，但不同細(xì)胞類型中其膜間距也存在差異，如人類肝臟細(xì)胞中的線粒體和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜間距為10～15 nm，而粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)因存有核糖體，此部位的MAM間距也較大，為20～30 nm。MAM的距離直接影響著線粒體Ca2+的攝取[9]。Csordas等[10]通過(guò)人工干預(yù)制造出的“人造連接”使MAM間距縮短，發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)Ca2+濃度明顯升高并繼發(fā)相關(guān)功能異常。但也有研究發(fā)現(xiàn)：若MAM距離<5 nm，線粒體也無(wú)法正常攝取鈣離子。這可能是由于MAM結(jié)構(gòu)中IP3R通道的大量胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域從滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面凸起的高度約為10～12 nm，而MAM的間距過(guò)小可能會(huì)影響到IP3R的蛋白構(gòu)象并繼而影響到其功能的正常發(fā)揮[11]。

關(guān)于MAM的研究目前多集中在衰老疾病。研究表明，MAM介入氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、Ca2+超載、線粒體功能障礙、炎癥、細(xì)胞凋亡等多個(gè)疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[12]。鑒于卵母細(xì)胞衰老及功能障礙可能也和MAM的功能異常密切相關(guān)，因此有研究者已經(jīng)開(kāi)始相關(guān)領(lǐng)域的探索，其具體內(nèi)容綜述如下。

二、MAM與卵母細(xì)胞中氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激/活性氧簇(ROS)誘發(fā)凋亡在女性生殖衰老的病理生理進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。隨著年齡增長(zhǎng)，機(jī)體各系統(tǒng)中均存在ROS增加及抗氧化防御能力降低現(xiàn)象。生理狀態(tài)下，ROS在卵母細(xì)胞的發(fā)育中發(fā)揮著細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的作用——適量活性氧雖可增強(qiáng)卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，但ROS異常升高亦可加速卵母細(xì)胞老化[13]。在卵泡內(nèi)，由卵母細(xì)胞和體細(xì)胞形成的微環(huán)境中，ROS對(duì)卵母細(xì)胞的影響主要表現(xiàn)為細(xì)胞核DNA斷裂、細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜空泡化以及凋亡小體的生成并最終啟動(dòng)細(xì)胞死亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體是ROS產(chǎn)生的兩大來(lái)源，而MAM是兩者ROS交換發(fā)生的地方[14]。因此，MAM結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定是影響ROS代謝的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，許多細(xì)胞氧化狀態(tài)的調(diào)節(jié)因子就位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體聯(lián)結(jié)處，其中包括66 kD的Shc蛋白(p66Shc)。p66Shc是線粒體中通過(guò)產(chǎn)生ROS促進(jìn)哺乳動(dòng)物衰老的氧化還原酶，通常被認(rèn)為是導(dǎo)致年齡相關(guān)功能障礙的促進(jìn)因子。MAM中的p66Shc水平及線粒體中ROS的產(chǎn)生隨年齡增大而增加[15-16]。RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)是未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response，UPR)中的關(guān)鍵內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器，也在MAM處富集，通過(guò)Ca2+和ROS轉(zhuǎn)移促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的功能交流，PERK缺陷的細(xì)胞表現(xiàn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)和Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)，影響ROS從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體的轉(zhuǎn)移，細(xì)胞隨之發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并走向凋亡[17]。

三、MAM與卵母細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

卵泡生長(zhǎng)是通過(guò)卵母細(xì)胞大小的增加伴隨周圍顆粒細(xì)胞(Granule cells，GCs)的增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Monniaux等[18]發(fā)現(xiàn)，進(jìn)入次級(jí)卵泡期后，隨著卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和GCs增殖速率逐漸增加，卵母細(xì)胞及其微環(huán)境會(huì)出現(xiàn)缺氧現(xiàn)象，進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR。研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)分泌和旁分泌作用下，機(jī)體會(huì)從同時(shí)發(fā)育的多個(gè)卵泡中選擇一個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡，并將其他卵泡閉鎖，這種卵泡的選擇性發(fā)育機(jī)制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)[19-21]。

干擾細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR。毒胡蘿卜素(一種Ca2+-ATP酶抑制劑)可降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度并導(dǎo)致UPR通路激活。不僅如此，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平也可誘導(dǎo)UPR通路，例如離子霉素就可以通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度誘導(dǎo)UPR的發(fā)生，并引起B(yǎng)ip/Grp78表達(dá)的增加[22]。

MAM中鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin)、鈣結(jié)合蛋白(Calnexin)是調(diào)控和保障內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白正確折疊的關(guān)鍵因子，而Calreticulin或Calnexin功能的發(fā)揮依賴于Ca2+的激活。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+儲(chǔ)存濃度下降，影響蛋白質(zhì)的正確折疊，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白蓄積和UPR激活[23-24]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器蛋白Ero1-α作為氧化折疊和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原狀態(tài)的關(guān)鍵控制器，位于MAM，其表達(dá)增加會(huì)促進(jìn)IP3R激動(dòng)劑作用下從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到線粒體的被動(dòng)Ca2+外流，導(dǎo)致線粒體鈣超載后引發(fā)細(xì)胞凋亡[25]。以上研究均表明，MAM結(jié)構(gòu)中定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的相關(guān)蛋白可通過(guò)Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，也間接影響了卵泡發(fā)育中卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟。

四、MAM與卵母細(xì)胞中線粒體應(yīng)激

1.線粒體的能量代謝與凋亡：MAM最重要的功能之一就是促進(jìn)線粒體Ca2+攝取，調(diào)控氧化代謝及凋亡，這一功能對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育中線粒體ATP合成的累積及細(xì)胞凋亡具有重要意義[26-27]。Pinton等[28]觀察到神經(jīng)酰胺處理的HeLa細(xì)胞中的Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放并進(jìn)入線粒體，造成線粒體鈣超載，細(xì)胞器隨后發(fā)生腫脹、斷裂，與細(xì)胞色素C(Cyto C)釋放同步發(fā)生；而降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放可阻止上述損傷性變化。也有研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)條件下，老化的卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)持續(xù)高Ca2+狀態(tài)會(huì)誘導(dǎo)鈣調(diào)蛋白依賴激酶Ⅱ(Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)的活化，活化的CaMKⅡ可激活Wee1并誘導(dǎo)CyclinB1降解以及Cdk1的Thr14/Tyr15磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致成熟促進(jìn)因子(Maturation-promoting factor，MPF)不穩(wěn)定，而持續(xù)低水平的MPF則會(huì)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞發(fā)生凋亡[29]。

抗凋亡蛋白Bcl-2是第一個(gè)被證實(shí)通過(guò)調(diào)控線粒體內(nèi)Ca2+來(lái)抑制凋亡的蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白大量富集于MAM區(qū)域，通過(guò)與IP3R相互作用抑制其Ca2+通道活性，阻止線粒體攝取過(guò)多Ca2+，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[30-31]。也有研究顯示，在老化的卵母細(xì)胞中，持續(xù)的MPF降低或者氧化應(yīng)激增加都會(huì)引起B(yǎng)cl-2家族成員Bax過(guò)表達(dá)和Bcl-2的低表達(dá)，導(dǎo)致線粒體膜上Bax/Bcl-2比率改變和繼發(fā)的膜電勢(shì)改變，促使卵母細(xì)胞內(nèi)CytoC增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[32]。

2.線粒體的融合與分裂：近期研究者們發(fā)現(xiàn)在評(píng)估線粒體功能的時(shí)候，除了mtDNA拷貝數(shù)以及線粒體ATP的生成外，線粒體的動(dòng)態(tài)能動(dòng)性也是不容忽視的環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體可通過(guò)瞬時(shí)的線粒體融合進(jìn)行功能互補(bǔ)，此現(xiàn)象被形象地命名為“kiss and run”[33-34]。這為基于線粒體功能評(píng)估卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟水平提供了新的視角。有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體在融合與分裂過(guò)程中受到了MAM結(jié)構(gòu)中融合相關(guān)蛋白MFN1、MFN2和分裂相關(guān)蛋白DRP1的調(diào)控[35]。Zhang等[36]研究顯示，線粒體分裂嚴(yán)格依賴于Ca2+，線粒鈣超載后引發(fā)DRP1向線粒體外膜的募集，進(jìn)而通過(guò)水解GTP引起自身構(gòu)象變化，促進(jìn)線粒體分裂，過(guò)度的線粒體分裂則會(huì)導(dǎo)致線粒體氧化呼吸功能損傷以及誘發(fā)凋亡。Cherubini等[37]發(fā)現(xiàn)，亨廷頓舞蹈癥突變小鼠模型的紋狀體內(nèi)異常的DRP1積聚會(huì)誘發(fā)線粒體斷裂，迫使線粒體遠(yuǎn)離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體的耦聯(lián)，繼而導(dǎo)致Ca2+外流障礙和線粒體超氧化物的過(guò)度產(chǎn)生。在生殖系統(tǒng)領(lǐng)域，Zhang等[38]研究發(fā)現(xiàn)，MFN2基因敲除小鼠可出現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)育延遲，并且因胎盤缺陷導(dǎo)致胚胎死亡，對(duì)卵母細(xì)胞特異性敲除該基因后會(huì)導(dǎo)致雌性小鼠不孕；研究還發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞中MFN1缺失會(huì)引起卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞通訊受損，鈣粘蛋白和連接蛋白下調(diào)，從而導(dǎo)致卵泡發(fā)育停滯在次級(jí)卵泡階段，引起與卵母細(xì)胞成熟障礙相關(guān)的不孕。Hou等[39]通過(guò)對(duì)敲除了MFN2基因的卵母細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，MFN2基因缺失的卵母細(xì)胞表現(xiàn)出端?？s短、細(xì)胞凋亡增加和線粒體功能障礙，導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量受損和卵泡耗竭加速，與卵巢儲(chǔ)備功能減退表型一致。

五、總結(jié)

在過(guò)去的幾十年中，“以線粒體為中心”的觀念逐漸受到“細(xì)胞器間通訊”概念的挑戰(zhàn)。過(guò)去人們以為，細(xì)胞關(guān)鍵生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞的代謝和死亡，可能僅僅以線粒體自主的方式發(fā)生；而現(xiàn)在研究者逐漸發(fā)現(xiàn)，盡管線粒體在細(xì)胞生命活動(dòng)的各個(gè)方面起著舉足輕重的作用，而對(duì)細(xì)胞命運(yùn)至關(guān)重要的生命活動(dòng)則更多依賴于線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)動(dòng)態(tài)建立的相互作用。正因如此，MAM現(xiàn)在被越來(lái)越多地認(rèn)為是分子信號(hào)交換和蛋白質(zhì)復(fù)合物形成的一個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞功能平臺(tái)，調(diào)控著各種細(xì)胞生命活動(dòng)，其中當(dāng)然也包括Ca2+介導(dǎo)并參與的卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過(guò)程。