李 敖，王玉然，王文浩

（濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科1，放療科2，山東 濰坊 261041）

截至2020 年，肺癌發(fā)病率位居第2 位，死亡率高居首位[1，2]。肺腺癌是肺癌常見的組織學(xué)亞型之一。肺癌發(fā)病機(jī)制、進(jìn)展及耐藥的分子機(jī)制是肺癌精確治療的研究熱點(diǎn)，也是藥物治療的關(guān)鍵?？煽康纳飿?biāo)志物對(duì)于肺癌的準(zhǔn)確診斷和治療至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)[3]，自噬在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展、治療和耐藥中起重要作用。自噬是發(fā)生在特定生物過程中，由多種信號(hào)通路調(diào)控的一種細(xì)胞程序性死亡方式[4]，其可參與腫瘤生長調(diào)控[5，6]。在肺癌細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑可以激活自噬。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)肺腺癌中自噬相關(guān)基因（autophagy-related genes，ATGs）的差異表達(dá)進(jìn)行分析，根據(jù)Cox 分析建立ATGs 的預(yù)后模型，以期為ATGs 在肺腺癌患者預(yù)后評(píng)估和靶向治療中的應(yīng)用提供新的研究方向，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 肺腺癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床基礎(chǔ)數(shù)據(jù)來源于TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）。從TCGA 數(shù)據(jù)庫獲取54 例正常組織和497 例腫瘤組織的RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)，并獲取相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)。利用R 軟件對(duì)樣本中的差異表達(dá)基因進(jìn)行Wilcox 檢驗(yàn)。從人類自噬數(shù)據(jù)庫HADb（http://www.autophagy.lu/）中共檢索到232 個(gè)ATGs。為了篩選差異表達(dá)的ATGs，閾值設(shè)定為logFC＞1.0，F(xiàn)DR＜0.05。

1.2 GO 和KEGG 對(duì)差異表達(dá)ATGs 富集分析 使用R 軟件進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 富集分析，其中GO 富集分析包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cell components，CC）和分子功能（molecular functions，MF）3 類。使用公共蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫PPI（https://string-db.org/）生成差異ATGs 的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape 軟件（3.7.2 版）編輯蛋白質(zhì)相互作用圖像。

1.3 預(yù)后模型構(gòu)建 應(yīng)用R 軟件進(jìn)行單因素Cox 分析，篩選出與肺腺癌預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)基因。利用多變量Cox 回歸分析構(gòu)建肺腺癌ATGs 的預(yù)后模型。使用特定的公式計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，用中位風(fēng)險(xiǎn)閾值將肺腺癌患者分為高危和低危2 組。應(yīng)用Kaplan-Meier 分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)分析采用R 軟件（4.0.4 版）進(jìn)行。采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)和K-M 分析法繪制生存曲線。單因素和多因素分析采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。用雙側(cè)t檢驗(yàn)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床參數(shù)的統(tǒng)計(jì)比較。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATGs 的差異表達(dá)分析 以TCGA 數(shù)據(jù)庫中54例正常組織和497 例肺腺癌組織的mRNA 陣列分析為基礎(chǔ)，以絕對(duì)mRNA 基因表達(dá)水平logFC＞1.0 和FDR＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行ATGs 的差異表達(dá)分析。R 軟件包“l(fā)imma”和“ggpubr”分析共獲得200 個(gè)ATGs。ATGs 分布散點(diǎn)圖見圖1A。以LogFC＞1.0 和P＜0.05 為選擇標(biāo)準(zhǔn)，篩選出在肺腺癌數(shù)據(jù)庫中差異表達(dá)的30 個(gè)ATGs，見圖1B、1C。

圖1 ATGs 在肺腺癌TCGA 數(shù)據(jù)庫中的差異表達(dá)

2.2 ATGs 的功能富集分析 在生物學(xué)過程中，GO 最顯著富集的前3 個(gè)功能是內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路、巨噬細(xì)胞自噬和神經(jīng)元死亡，細(xì)胞成分包括自噬小體、自噬體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶復(fù)合體。在分子功能上，ATGs 主要是濃縮蛋白磷酸酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合和蛋白二硫鍵異構(gòu)酶活性。KEGG 通路富集分析顯示，這些基因與自噬（動(dòng)物）通路、ErbB 信號(hào)通路和IL-17信號(hào)通路相關(guān)。此外，從在線STRING 數(shù)據(jù)庫中獲得了30 個(gè)ATGs 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

圖2 GO 和KEGG 富集功能分析與PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.3 自噬相關(guān)危險(xiǎn)因素與肺腺癌預(yù)后關(guān)系的研究對(duì)200 個(gè)ATGs 進(jìn)行單因素Cox 回歸分析，從肺腺癌TCGA 數(shù)據(jù)庫（圖3A）中獲得了21 個(gè)預(yù)后相關(guān)ATGs，其中9 個(gè)ATGs（ATG4A、NLRC4、PRKCD、DAPK2、SIRT2、CCR2、ATG16L2、DLC1、DRAM1）被認(rèn)為是保護(hù)性基因（HR＜1），其余12 個(gè)ATGs（ITGB4、BIRC5、CTSL、SPHK1、APOL1、ITGA6、ITGB1、GAPDH、ERO1A、EIF2S1、MBTPS2、ST13）被認(rèn)為是危險(xiǎn)性基因（HR＞1）。通過多因素Cox 回歸分析，從21 個(gè)ATGs 中篩選出與肺腺癌患者預(yù)后相關(guān)的8個(gè)關(guān)鍵基因（ATG4A、CCR2、MBTPS2、APOL1、ERO1A、SPHK1、ST13 和ITGA6），見表1。通過多因素Cox 回歸分析得到了各危險(xiǎn)基因的系數(shù)值，根據(jù)ATGs 公式構(gòu)建自噬預(yù)后模型：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（-0.5562×ATG4A表達(dá)值）+（-0.3777×CCR2 表達(dá)值）+（0.3398×MBTPS2）+（0.1319 ×APOL1 表達(dá)值）+（0.2030 ×ERO1A 表達(dá)值）+（0.1832 ×SPHK1 表達(dá)值）+（0.2893×ST13 表達(dá)值）+（0.1399×ITGA6 表達(dá)值）。根據(jù)此公式，從TCGA 數(shù)據(jù)庫獲得患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。圖3B 顯示了肺腺癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布，圖3C顯示了生存時(shí)間和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分之間的相關(guān)性。建立熱圖分析低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組中包含的8 個(gè)ATGs 的表達(dá)差異（圖3D），結(jié)果顯示高危組患者傾向于表達(dá)危險(xiǎn)基因，而低危組患者傾向于表達(dá)保護(hù)基因。

圖3 自噬相關(guān)的危險(xiǎn)因素與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

表1 肺腺癌預(yù)后基因中的8 個(gè)關(guān)鍵ATGs 列表

2.4 自噬在肺腺癌是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo) 單因素和多因素預(yù)后分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是肺腺癌TCGA的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)（P＜0.05），見圖4A、4B。Kaplan-Meier 曲線分析顯示，高危評(píng)分患者的生存期短于低危評(píng)分患者，見圖4C。與年齡（AUC=0.567）、性別（AUC=0.617）、分期（AUC=0.708）、T 分期（AUC=0.664）、M 分期（AUC=0.506）和N 分期（AUC=0.632）因素相比，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（AUC=0.763）具有更好的預(yù)測(cè)性能，見圖4D。

圖4 ATGs 與肺腺癌患者的關(guān)系

3 討論

自噬是由一系列ATGs 介導(dǎo)的涉及自噬小體、溶酶體的形成以及細(xì)胞器或細(xì)胞質(zhì)的降解過程[7，8]。它可以由缺氧、饑餓、輻射、生長因子信號(hào)抑制劑、化療和靶向藥物誘導(dǎo)[9]。近年來，ATGs 在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)吞、胞吐、巨噬細(xì)胞吞噬和外泌體產(chǎn)生等方面的作用受到越來越多的關(guān)注[10-12]。研究表明[13，14]，自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著雙向作用。自噬不僅能有效地抑制腫瘤的凋亡、壞死和炎癥進(jìn)展，而且在抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展方面也起到了一定的作用。在這種情況下，自噬是對(duì)身體的一種保護(hù)作用。腫瘤細(xì)胞可以通過自噬途徑逃避外源抑制物的殺傷作用，從而使腫瘤繼續(xù)發(fā)展，而在這種情況下，自噬起到了促進(jìn)腫瘤生長的作用。

本研究分析了從肺腺癌TCGA 數(shù)據(jù)庫中獲得的200 個(gè)ATGs 的表達(dá)情況，同時(shí)通過GO 和KEGG 分析研究了分子和生物學(xué)途徑的富集，GO 富集發(fā)現(xiàn)細(xì)胞成分和生物學(xué)過程與自噬密切相關(guān)。從分子功能的角度看，蛋白磷酸酶結(jié)合與自噬密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[15]，通過蛋白磷酸酶2A 抑制脯氨酰寡肽酶可以激活自噬。此外，在KEGG 分析中，最重要的途徑被富集在自噬中?；谝陨辖Y(jié)果，特異性自噬可能是肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的一種腫瘤促進(jìn)劑。此外，單因素Cox 回歸分析顯示，21 個(gè)ATGs 與肺腺癌患者的生存有關(guān)。隨后，通過多因素Cox 回歸分析確定了8 個(gè)關(guān)鍵ATGs（ATG4A、CCR2、MBTPS2、APOL1、ERO1A、SPHK1、ST13、ITGA6）。研究發(fā)現(xiàn)[16]，ATG4A對(duì)肺癌的預(yù)后有重要影響。同時(shí)，有報(bào)道稱[17]，miRNA可以調(diào)節(jié)ATG4A 的表達(dá)參與自噬的調(diào)節(jié)。CCL2 可以與腫瘤細(xì)胞表面的CCR2 結(jié)合，通過CCL2/CCR2分子軸促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為[18]。ERO1A 在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移有關(guān)[19]。SPHK1 也與肺癌的惡性生物學(xué)行為有關(guān)[20]，參與了一些細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)。ST13在正常粘膜組織和相應(yīng)的腫瘤組織中均有不同程度的表達(dá)[21]，miRNA 可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控ITGA6 的表達(dá)。另有研究發(fā)現(xiàn)[11]，miR-126 和miR-143-3p 分別能抑制ITGA6 的表達(dá)，從而抑制非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究通過計(jì)算ATGs 的mRNA 表達(dá)值和風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)得到風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)患者進(jìn)行分層，結(jié)果顯示自噬基因可作為肺腺癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，且ROC 分析顯示，與年齡（AUC=0.567）、性別（AUC=0.617）、分期（AUC=0.708）、T 分期（AUC=0.664）、M 分期（AUC=0.506）和N 分期（AUC=0.632）因素相比，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（AUC=0.763）具有更好的預(yù)測(cè)性能。

綜上所述，本研究構(gòu)建了基于8 個(gè)ATGs（ATG4A、CCR2、MBTPS2、APOL1、ERO1A、SPHK1、ST13、ITGA6）的預(yù)后特征模型，為ATGs 在肺腺癌臨床中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。自噬基因和預(yù)后模型可能為改善肺腺癌患者的生存和預(yù)后提供新的分子生物標(biāo)志物及腫瘤驅(qū)動(dòng)基因，有助于制定個(gè)體化治療策略。