高雪閩，鄒巧根

(南京工業(yè)大學 藥學院，江蘇 南京 211800)

基因毒性雜質(zhì)是指對DNA有潛在破壞性的，以及一些結(jié)構上類似基因毒性的物質(zhì)，但尚未經(jīng)實驗證明[1]?；蚨拘噪s質(zhì)存在于藥物生產(chǎn)的各個階段。原料藥合成中的起始物料、中間體、副產(chǎn)物、催化劑和殘留溶劑由于儲存不當?shù)仍颍蓪е禄蚨拘噪s質(zhì)的產(chǎn)生[2]。基因毒性雜質(zhì)會對人體產(chǎn)生極大的危害，目前各國藥監(jiān)部門對它們的質(zhì)量控制越來越嚴格。

舒必利(sulpiride)是一種苯甲酰胺類藥物，在臨床上常作為聯(lián)合用藥來治療精神類疾病，如：精神分裂、抑郁癥等；也可用于胃病的治療，如：消化不良和胃潰瘍等；其化學結(jié)構見圖1。王福蘭等[3]發(fā)明了一種合成成本較低、純度高且操作簡便的生產(chǎn)路線，是用2-甲氧基-5-氨磺酰基苯甲酸甲酯(1)和N-乙基-2氨甲基四氫吡咯烷(2)縮合反應生成舒必利(圖2)。物質(zhì)2是以N-乙基吡咯烷酮(3)為原料，經(jīng)Henry反應、加氫還原制得[3]，合成路線見圖3。圖3中生成的中間體N-乙基-2-硝亞甲基吡咯烷(4)為芳香硝基類化合物，具有典型的基因毒性警示類結(jié)構[4]。在后續(xù)反應中，會通過混合溶劑進行提純，以去除雜質(zhì)，但由于舒必利的合成路線較短，所以4仍然有殘留的可能。為保證舒必利的質(zhì)量和用藥安全，需對殘留的4的反式異構體(E)-1-乙基-2-(硝基亞甲基)吡咯烷(5)進行嚴格控制，其中5的結(jié)構式見圖4。

圖1 舒必利的結(jié)構式Fig.1 The structure of sulpiride

圖2 舒必利的合成路線[3]Fig.2 The synthetic route of sulpiride[3]

圖3 2的合成路線[3-4]Fig.3 The synthetic route of 2[3-4]

圖4 5的結(jié)構式Fig.4 The structure of 5

根據(jù)朱靜等[5]的報道，5無誘變數(shù)據(jù)。對于已知具有致突變性但致癌性未知的雜質(zhì)，一般采用毒理學關注閾(TTC)來評估其毒性[5-8]，即通常認為：人體每日攝入量低于1.5 μg，可誘發(fā)癌變的物質(zhì)是可以接受的。舒必利原料的最大日攝入劑量為1.2 g，按照TTC不高于1.5 μg進行控制，則雜質(zhì)限度應控制在1.25 μg/g[9]。

基因毒性雜質(zhì)都是以痕量的形式存在于藥物中，因此選擇合適的分離及檢測方法尤為重要。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)由于具有高選擇性和高靈敏度，是近年來檢測基因毒性雜質(zhì)常用的技術[10-13]。目前尚無文獻對5的測定方法進行報道。本文首次建立了一種快速靈敏的測定舒必利原料藥中5的LC-MS/MS分析方法，且對此方法進行了全方位的驗證，以期將其成功應用于舒必利原料藥中基因毒性雜質(zhì)5的分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1100-API4000Q型LC-MS/MS，美國Agilent-Applied Biosystems Sciex公司；XS105型十萬分之一天平、XP6型百萬分之一天平，瑞士Mettled Toledo公司；Direct-Q3UV型純水儀，上海市密理博有限公司。

5對照品(批號：PAS-120-14)，含量99.15%，美國AOCS公司；舒必利原料藥(批號：S2003002、S2003003和S2003004)，自制；甲醇、乙腈為色譜純，美國Merck公司；甲酸為市售色譜純，上海市Aladdia公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl型(4.60 mm×150 mm，5.0 μm)；柱溫為30 ℃；流動相A為甲醇；流動相B為0.01%(體積分數(shù)，下同)甲酸水溶液；流速為0.8 mL/min；分析時間為11 min；進樣量為5 μL。

梯度洗脫程序為0～0.1 min，70% B；0.1～5 min，70% B；5～8 min，70%～60% B；8～9.5 min，60% B；9.5～9.7 min，60%～70% B；9.7～11 min，70% B。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)；正離子模式，多重反應檢測模式；離子源溫度為550 ℃，離子源電壓為5 500 V，檢測離子對為97.4～157.4 質(zhì)荷比(m/z)，去簇電壓和碰撞能量分別為40 和27 V；二級質(zhì)譜見圖5。

圖5 5在正離子模式下的離子源掃描Fig.5 The product ion scans chromatogram of 5 in the positive mode

1.2.3 對照品一級儲備液的制備

精密稱定5對照品5 mg至10 mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)溶解，并定容至刻度線，搖勻。

1.2.4 對照品二級儲備液的制備

精密量取對照品一級儲備液1 mL，用50%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)稀釋，得到質(zhì)量濃度為50 ng/mL的對照品二級儲備液。

1.2.5 對照品溶液的制備

精密量取對照品二級儲備液適量，用50%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)稀釋，得到質(zhì)量濃度為25 ng/mL的對照品溶液。

1.2.6 供試品溶液的制備

精密稱取原料藥100 mg，加入50%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)5 mL，得到終質(zhì)量濃度為20 mg/mL的供試品溶液。

1.2.7 加標供試品溶液的制備

精密稱取原料藥100 mg，加入對照品二級儲備液2.5 mL，用50%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)溶解，得到含質(zhì)量濃度為25 ng/mL的對照品溶液和舒必利質(zhì)量濃度為20 mg/mL的加標供試品溶液。

1.2.8 線性系列標準溶液的制備

分別取對照品二級儲備液適量，用50%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)稀釋成相當于限度水平30%、50%、80%、100%與120%的系列濃度溶液。

1.2.9 回收率試驗溶液的制備

精密稱取原料藥100 mg，分別加入對照品二級儲備液0.75、2.5、3 mL，用50%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)溶解，每個濃度分別制備3份，分別得到30%、100%、120%限度水平的回收率試驗溶液。

1.2.10 定量限與檢測限溶液的制備

取對照品溶液逐級稀釋，分別以信噪比(S/N)為10和3時的溶液作為定量限溶液與檢測限溶液。

1.2.11 試劑空白溶液的制備

配制50%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)。

1.2.12 分析方法的驗證

參考文獻[14-15]的方法，對所建立的分析方法進行驗證，驗證項目包括專屬性、線性范圍、檢測限、定量限、準確度、精密度(包括重復性、進樣精密度和中間精密度)、穩(wěn)定性和耐用性。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性試驗結(jié)果

取空白溶液、供試品溶液、對照品溶液及加標供試品溶液分別進樣測定，其專屬性樣品色譜流出曲線的結(jié)果見圖6。由圖6可知：雜質(zhì)的保留時間為6.87 min，空白溶液及供試品溶液都不會干擾雜質(zhì)的檢測，雜質(zhì)與主成分之間也互不干擾，因此表明本方法的專屬性良好。

圖6 專屬性樣品色譜流出曲線Fig.6 Chromatographic elution curves of specific samples

2.2 線性試驗結(jié)果

以進樣質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸分析，得到的線性方程為Y=8 580X+3 950，R2=0.998 4。表明5在7.5～30 ng/mL范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出良好線性水平，由此說明：濃度范圍包含雜質(zhì)限度所要求的30%～120%，可以滿足分析要求。

2.3 定量限與檢測限試驗結(jié)果

取定量限與檢測限溶液進樣測定。將定量限溶液重復測定6次，得到峰面積的相對標準偏差(RSD)為3.8%，定量限質(zhì)量濃度為3.00 ng/mL，檢測限質(zhì)量濃度為1.50 ng/mL。結(jié)果表明本方法的靈敏度高。

2.4 回收率試驗結(jié)果

取空白溶液和回收率試驗溶液進樣分析。計算5測定值與理論值的比值，以獲得回收率,結(jié)果見表1。由表1可知：檢測物的平均回收率分別為98.09%、94.27%和97.78%，總體回收率為96.71%，RSD為2.40%。以上結(jié)果表明本方法的準確度良好。

表1 回收率試驗結(jié)果

2.5 精密度試驗結(jié)果

2.5.1 進樣精密度的試驗結(jié)果

取對照品溶液連續(xù)進樣6針，考察進樣的精密度，結(jié)果見表2。由表2可知：對照品溶液中5的批間保留時間RSD為0.20%，批內(nèi)保留時間RSD為2.20%，均符合驗證要求。表明本方法的進樣精密度良好。

表2 精密度試驗結(jié)果

2.5.2 重復性的試驗結(jié)果

取加標供試品溶液，平行配制6份進行進樣分析，結(jié)果見表2。由表2可知：檢測物5的批間RSD為1.80%，表明本方法重復性良好。

2.5.3 中間精密度的試驗結(jié)果

取加標供試品溶液，由不同分析人員在不同時間再次制備6份加標供試品溶液進樣測定，結(jié)果見表2。由表2可知：檢測物5的批間中間精密度RSD為11.00%。表明本方法的中間精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

取對照品溶液和供試品溶液，分別在室溫條件下放置0、2.0、4.8、7.7、11.0、14.4、17.7和21.0 h之后進樣測定，檢測結(jié)果見表3。由表3可知：對照品溶液室溫放置21.0 h后，5的峰面積RSD為5.80%，無明顯變化；供試品溶液室溫放置21.0 h后，均未有5檢出。表明對照品溶液和供試品溶液于室溫放置21.0 h后均能保持穩(wěn)定。

表3 溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.7 耐用性試驗結(jié)果

取加標供試品溶液進樣分析，考察其在柱溫為(30±5) ℃、流速為(800±50) μL/min以及同品牌不同批號的色譜柱條件下的耐用性，結(jié)果見表4。由表4可知：當柱溫為(30±5) ℃，流速為(800±50)μL/min，色譜柱發(fā)生微小變動時，RSD分別為0.7%、3.2%和2.1%，均符合驗證要求。表明本方法在發(fā)生微小變動時，耐用性仍保持良好。

表4 耐用性試驗結(jié)果

2.8 樣品測定結(jié)果

采用經(jīng)過驗證的方法，測定3個批次原料藥樣品中5的含量，每批次分別進行2次重復試驗。按供試品溶液進行處理后的進樣分析，測定結(jié)果見表5。由表5可知：3個批次中均未檢出5。

表5 3批舒必利原料藥中5的檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了舒必利原料藥中(E)-1-乙基-2-(硝基亞甲基)吡咯烷的LC-MS/MS檢測方法。該方法的專屬性強、靈敏度高、溶液穩(wěn)定性好，可以滿足雜質(zhì)定量檢測要求，可作為舒必利原料藥中檢測(E)-1-乙基-2-(硝基亞甲基)吡咯烷的研究方法。該方法不僅完善了舒必利的質(zhì)量控制體系，并為其他類藥物中涉及到N-乙基-2-硝亞甲基吡咯烷類基因毒性雜質(zhì)的質(zhì)量控制提供了理論基礎和技術手段。