李秋平 張春龍 楊 宏 王 拓 李 娟 金壽林 黃大軍 李丹丹,2, 文建成,

水稻半育突變體的生理特征分析及基因定位

李秋平1張春龍1楊 宏1王 拓1李 娟1金壽林1黃大軍1李丹丹1,2,*文建成1,*

1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)稻作研究所, 云南昆明 650201;2云南省作物生產(chǎn)與智慧農(nóng)業(yè)重點實驗室, 云南昆明 650201

以水稻花粉半育性突變體與秈稻93-11構(gòu)建的高世代回交導(dǎo)入系()為研究對象, 與野生型93-11相比, 突變體在在株高、葉長、葉寬、分蘗數(shù)、花粉數(shù)量等農(nóng)藝性狀上均未發(fā)現(xiàn)顯著差異, 但花粉育性卻顯著下降?；ǚ坨R檢及花粉發(fā)育后期的掃描電鏡觀察結(jié)果顯示,突變體部分花粉在發(fā)育后期淀粉積累減少并最終敗育?；ǚ郯l(fā)育相關(guān)生理指標(biāo)檢測結(jié)果表明, 突變體花藥中脯氨酸和淀粉的含量顯著下降; 蔗糖在突變體穗部上游組織(源葉、庫葉、莖)中積累量顯著增加, 但穗部含量卻明顯減少, 說明蔗糖到穗部的運輸過程受到影響。遺傳分析表明,突變體性狀受1對隱性核基因控制, 基因初定位將突變位點定位于水稻10號染色體RM25389和RM25404之間的398 kb區(qū)間內(nèi), 該區(qū)間包含3個與蔗糖轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因和1個與淀粉合成相關(guān)的基因。本研究為進一步開展花粉半育性調(diào)控基因的精細(xì)定位、基因功能及調(diào)控機制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

水稻; 半育性植株;; 基因定位; 淀粉積累

花粉發(fā)育是水稻生殖發(fā)育的重要過程, 其育性高低是水稻育種和衡量經(jīng)濟產(chǎn)量的關(guān)鍵[1]。水稻花粉發(fā)育調(diào)控是一個十分復(fù)雜的生物學(xué)過程, 從小孢子母細(xì)胞形成到花粉粒的最終成熟, 每個階段都需要特定基因的協(xié)同作用, 任何參與水稻花粉發(fā)育的基因發(fā)生突變, 都有可能導(dǎo)致花粉的異常發(fā)育[2]。

根據(jù)雄性細(xì)胞的發(fā)育特點及藥壁組織的形態(tài)變化, 馮九煥等[3]將水稻花粉發(fā)育的過程劃分為8個時期。孢子體和配子體的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明, 約有7200個基因在成熟的花粉中特異性地高量表達(dá), 參與水稻花粉發(fā)育后期的調(diào)控機制[4], 這些調(diào)節(jié)基因又被稱為“晚期”基因[5]。目前, 已有大量的“晚期”基因被克隆鑒定, 例如,基因通過影響花粉后期淀粉的合成導(dǎo)致花粉育性降低[6]; 將基因敲除后, 小孢子減數(shù)分裂受到抑制, 花粉中的淀粉粒減小甚至消失, 致使水稻花粉育性和結(jié)實率顯著降低[7];基因則通過影響己糖激酶的活性降低花粉中淀粉的利用效率, 最終導(dǎo)致花粉不能成熟和萌發(fā)[8]。因此, 水稻花粉后期發(fā)育過程中淀粉的快速合成、利用和積累對于花粉的育性及萌發(fā)有重要影響。

水稻花粉中大量積累的淀粉粒, 不僅是花粉成熟的標(biāo)志, 還是花粉萌發(fā)必須的能量儲藏[9], 然而目前對于調(diào)控水稻花粉中淀粉積累的相關(guān)基因及分子機制的研究還十分有限。但在另一個異養(yǎng)器官——種子, 淀粉的持續(xù)合成已經(jīng)基本被研究清楚[10], 即蔗糖通過篩管被運輸?shù)疆愷B(yǎng)組織(種子)附近, 再通過一些跨膜蛋白, 如蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白(SUTs)、糖轉(zhuǎn)運大蛋白(SWEET)等, 被卸載轉(zhuǎn)運到胚乳細(xì)胞[11-13], 隨后在蔗糖合酶(SUS)的作用下, UDP和蔗糖一起被水解成為UDP-Glc和果糖[14], UDP-Glc在UGP酶的作用下被磷酸化, 成為Glc-1-P[15], 后經(jīng)過AGP酶的催化,生成ADP-Glc[6], 成為淀粉的基本組成單元[16]。與種子類似, 花粉也屬于異養(yǎng)器官, 因此, 上述淀粉合成機制也可作為研究花粉中淀粉積累調(diào)控的重要參考, 同時水稻花粉后期發(fā)育不良突變體也是研究花粉淀粉合成機制的突破口。

根據(jù)賀和初對水稻單株育性的定義, 花粉育性在35.0%～74.9%之間的水稻植株成為半育株[17]。由于水稻花粉在發(fā)育過程中受環(huán)境因素的影響較大, 半育株在水稻種植和生產(chǎn)中較為常見。然而, 也有一些半育株突變體不受環(huán)境的影響, 其花粉受核基因的調(diào)控育性一直偏低, 這將為水稻花粉發(fā)育機制的深入研究提供良好的材料。例如,基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制受到損害致使水稻花粉發(fā)育不良, 結(jié)實率顯著下降[18];基因則通過調(diào)控花粉管的生長影響水稻結(jié)實率[19]。但總體上, 有關(guān)水稻半育株突變體分子機制的研究還非常有限。

本課題組前期篩選到一個水稻半育株突變體。以該突變體為研究對象, 對花粉后期發(fā)育過程中蔗糖、淀粉、脯氨酸含量等生理指標(biāo)進行初步研究, 并對其花粉發(fā)育不良目標(biāo)基因進行了初定位, 以期為發(fā)現(xiàn)影響花粉后期發(fā)育的新基因、深入了解其分子調(diào)控機制及在雜交水稻育種中的應(yīng)用提供種質(zhì)資源和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料包括云南農(nóng)業(yè)大學(xué)稻作研究所提供的秈稻花粉半育性突變體, 及其構(gòu)建的突變體群體。該突變體發(fā)現(xiàn)于云南省紅河州元陽縣地方栽培品種冷水麻(Lengshuima, Lsm)中, 具體表現(xiàn)為花粉育性、結(jié)實率顯著降低, 經(jīng)多年栽培觀察性狀穩(wěn)定, 由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)稻作研究所種質(zhì)庫保存。定位群體構(gòu)建: 以突變體為母本與93-11為父本進行雜交產(chǎn)生雜種F1, F1自交產(chǎn)生F2定位群體。突變體的群體構(gòu)建: 以為母本, 野生型秈稻93-11為父本雜交獲得F1, 用親本93-11連續(xù)回交3代, 獲得回交BC3F1群體。所有材料均在4月至9月種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)稻作研究所昆明溫室中, 田間管理與大田生產(chǎn)相同。

1.2 性狀考察

在成熟期連續(xù)調(diào)查突變體和野生型93-11各20株的農(nóng)藝性狀, 包括株高、株有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重。

1.3 花粉育性檢測

在抽穗期選取和93-11各5個單株穗子, 置于75%酒精中保存。鏡檢時, 每株取即將開花的3朵穎花(花藥長達(dá)穎殼2/3), 每朵小花取3枚花藥放入1% I2-KI染液中, 夾碎花藥, 剔除藥壁組織, 置于普通光學(xué)顯微鏡下(80倍)觀察花粉染色情況。隨機選取3個不同的視野照相記錄, 并統(tǒng)計花粉粒。正常花粉粒為圓形深藍(lán)色, 敗育花粉粒為圓形淺染色或畸形不染色。

1.4 花粉電鏡掃描

選取花粉發(fā)育六、七、八期的和93-11植株, 剝?nèi)≈髑o幼穗置于2.5%戊二醛溶液中, 在冰上抽真空后置于4℃冰箱中過夜固定, 用0.1 mol L–1的磷酸緩沖液沖洗樣品3次, 每次10 min。之后, 分別用30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液對樣品進行梯度脫水處理各10 min, 再用無水乙醇處理30 min, 待穎花干燥后, 用鑷子挑出完整的6枚花藥, 輕夾碎花藥釋放花粉粒, 剔除殘余藥壁, 用導(dǎo)電膠固定樣品, 在日立FlexSEM-1000型掃描電子顯微鏡下觀察和照相。

1.5 花藥脯氨酸和淀粉含量測定

選取花粉發(fā)育八期的和93-11植株, 剝?nèi)∮姿胫糜诒兄? 用鑷子挑出完整花藥, 用液氮預(yù)冷處理的離心管, 收集1 g花藥, 置于-80℃冰箱保存。采用脯氨酸含量測定試劑盒(G0111F, 蘇州格銳斯生物科技有限公司)和淀粉含量測定試劑盒(G0507F)分別測定和93-11花藥中脯氨酸和淀粉含量, 測定方法參見說明書。

1.6 蔗糖含量測定

取不同生育時期(孕穗期、抽穗期、開花期、灌漿期)和93-11各5株的源葉、庫葉、穗和莖, 分裝于已作標(biāo)記的取樣袋中, 放于烘箱烘干(110℃殺青15 min, 70℃過夜)。將烘干材料放入研缽, 加入液氮研磨, 過100目篩, 取0.1 g樣品, 保存于-80℃冰箱備用。

參照蒽酮硫酸法[20]檢測不同時期各個組織中蔗糖含量。利用蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品配置不同梯度濃度溶液, 于620 nm波長測定吸光度, 獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取50 mg樣品, 通過提取蔗糖、脫色等一系列反應(yīng), 并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線最終獲得各組織中的蔗糖含量。

1.7 遺傳分析及基因定位

對F1代群體單株花粉育性進行調(diào)查和半育性性狀遺傳分析。并利用F2代群體對半育性性狀基因進行定位。采用改良的CTAB法[21]提取野生型93-11、突變體和F2群體單株的全基因組DNA?；蚨ㄎ徊捎眉w分離分析法(BSA法), 選取F2代群體中育性正常表型和半育性表型株各20株的DNA, 等量混合構(gòu)建正常表型和突變表型基因混池, 并用來自水稻的494對SSR標(biāo)記進行PCR檢測, 從中篩選到76對平均分布于水稻12條染色體上的多態(tài)性標(biāo)記(標(biāo)記信息見附表1, 以、93-11和2個DNA混池作為模板進行連鎖分析, 利用800個F2代單株進行初步定位。PCR反應(yīng)體系為: 模板DNA 2 μL、上下游引物(10 μmol L–1)各0.8 μL、2×PCR Mix 5 μL、ddH2O 3.4 μL。PCR程序: 94℃預(yù)變性4 min, 94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸45 s, 共30個循環(huán); 最后72℃下延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳, 0.1% AgNO3染色后在3‰的甲醛和NaOH中顯色, 照相并統(tǒng)計基因型。

1.8 定位區(qū)間基因的信息分析

根據(jù)水稻基因組注釋計劃數(shù)據(jù)庫(https://rapdb. dna.affrc.go.jp/viewer/gbrowse/irgsp1)中的基因注釋信息對定位區(qū)間的基因功能進行查閱分析, 并利用本課題組已有發(fā)育后期水稻花粉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(野生型93-11開花前2～3 d花粉組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù))對定位區(qū)間的基因進行GO富集分析和KEEG富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體sfp10的表型分析

突變體與野生型93-11相比, 在株高、葉長、葉寬、分蘗數(shù)4個性狀上無差異, 生物產(chǎn)量、經(jīng)濟產(chǎn)量、主穗著粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重5個經(jīng)濟性狀上存在明顯差異, 差異達(dá)到極顯著水平(圖1-A～C和表1)。突變體主穗的著粒數(shù)降低幅度最大, 僅為野生型的46.05%; 其次為結(jié)實率, 為野生型的63.92%; 經(jīng)濟產(chǎn)量和生物產(chǎn)量分別為野生型的64.51%和71.18%?；ǚ郯l(fā)育第八期的鏡檢結(jié)果顯示, 野生型花藥內(nèi)的花粉粒飽滿圓形, 被I2-KI染成深藍(lán)色, 育性正常; 突變體花藥內(nèi)的正?；ǚ蹟?shù)量明顯減少, 存在不被染色或染色淺的敗育花粉(圖1-B), 其花粉育性僅為野生型的68.44%, 育性顯著降低(圖1-C), 為半育株。

2.2 花粉掃描電鏡形態(tài)觀察

為進一步研究花粉后期的發(fā)育特點, 通過掃描電鏡對野生型93-11和突變體發(fā)育第六、七、八期的花粉形態(tài)及數(shù)量進行了觀察、比較和分析。結(jié)果顯示, 在花粉發(fā)育后期的整個過程中, 突變體異常花粉體積要明顯小于野生型(圖2), 而正?；ǚ墼谝吧秃屯蛔凅w中形態(tài)卻無明顯差異(附表2)。其中, 在發(fā)育六期觀察到野生型和突變體花粉的外壁都比較皺縮, 但突變體的皺縮程度更大(圖2-A, B); 在發(fā)育七期, 野生型花粉的皺縮程度相對降低, 而突變體花粉仍有明顯的皺縮(圖2-C, D); 在發(fā)育八期, 野生型花粉粒表現(xiàn)圓形飽滿, 突變體花粉粒則為干癟狀態(tài)(圖2-E, F)。通過對各個時期花粉粒的長寬進行比較, 在長度上僅七期存在差異, 野生型長于突變體(圖2-G); 在寬度上各個時期都存在差異, 突變體顯著短于野生型(圖2-H)。上述結(jié)果表明突變體中花粉后期發(fā)育受損, 花粉粒充實度和花粉壁干癟是導(dǎo)致突變體花粉育性下降的主要原因。

2.3 花粉發(fā)育相關(guān)生理特征分析

在花粉成熟期(八期), 與野生型93-11相比, 突變體花藥中脯氨酸和淀粉的含量明顯下降, 降幅分別為39.09% (圖3-A)和36.47% (圖3-B), 淀粉積累減少影響花粉后期的發(fā)育, 最終影響花粉育性。對野生型與突變體4個時期(孕穗期、抽穗期、開花期、灌漿期)的源葉、庫葉、莖稈和穗部4個器官中的蔗糖含量進行檢測分析, 結(jié)果表明, 源葉中, 野生型和突變體在孕穗期、抽穗期和開花期的蔗糖含量無差異, 在灌漿期突變體的含量顯著增加, 增加了82.73% (圖3-C); 庫葉中, 在孕穗期的含量無

差異, 但在抽穗期、開花期和灌漿期均發(fā)現(xiàn)突變體的含量顯著增加, 分別增加了476.02%、100.71%和147.62% (圖3-D); 莖稈中, 在孕穗期和抽穗期的含量無差異, 在開花期和灌漿期突變體的含量顯著增加, 分別為37.90%和19.14% (圖3-E); 穗中4個時期都存在差異, 突變體的含量均顯著低于野生型, 在孕穗期、抽穗期、開花期和灌漿期分別降低了85.04%、70.87%、62.84%和19.86% (圖3-F)。

圖1 野生型93-11和突變體sfp10的表型分析

A: 93-11和灌漿期的植株; B: 93-11和的花粉鏡檢形態(tài); C: 93-11和的花粉數(shù)量、花粉育性比較,**表示在0.01水平差異顯著; D: 93-11和成熟期的小穗和單穗籽粒(上: 實粒; 下: 空癟粒)。

A: single plant of 93-11 andat filling stage; B: I2-KI staining of pollen grains of 93-11 andC: comparison of pollen number and pollen fertility between 93-11 and,**:< 0.01. D: spikelet and grains of single panicle of 93-11 andat mature stage (above: solid grains; below: empty grains).

表1 野生型93-11和突變體sfp10主要農(nóng)藝性狀的比較

**表示在0.01水平差異顯著。**:< 0.01.

圖2 野生型93-11和突變體sfp10花粉發(fā)育后期的掃描電鏡觀察

A, B: 分別為93-11和花粉發(fā)育六期的花粉粒; C, D: 分別為93-11和花粉發(fā)育七期的花粉粒; E, F: 分別為93-11和花粉發(fā)育八期的花粉粒; G: 93-11和的花粉粒長; H: 93-11和的花粉粒寬。S6、S7、S8分別表示花粉發(fā)育六、七、八期,**表示在0.01水平差異顯著。

A, B: pollen grains at the stage 6 of pollen development in 93-11 and, respectively; C, D: pollen grains at the stage 7 of pollen development in 93-11 and, respectively; E, F: pollen grains at the stage 8 of pollen development in 93-11 and, respectively; G: pollen grain lengthsof 93-11 and; H: pollen grain widths of 93-11 and. S6 and S7, S8 respectively pollen development stage 6, 7, 8.**:< 0.01.

圖3 野生型93-11和突變體sfp10花粉發(fā)育相關(guān)生理指標(biāo)

A: 93-11和花藥中脯氨酸含量; B: 93-11和花藥中淀粉含量; C～F: 93-11和源葉(C)、庫葉(D)、莖部(E)、穗部(F)蔗糖含量。1: 孕穗期; 2: 抽穗期; 3: 開花期; 4: 灌漿期;**表示在0.01水平差異顯著。

A: proline content in anthers of 93-11 and the; B: starch content in anthers of 93-11 and the; C–F: sucrose content of source-leaves (C), sink-leaves (D), stem (E), panicle (F) of 93-11 and1: booting stage; 2: heading stage; 3: flowering stage; 4: filling period;**:< 0.01.

2.4 遺傳分析

對突變體和野生型93-11正反交F1代花粉育性考察, 都表現(xiàn)正常。對其F2代分離群體單株的花粉育性考察, 有736株表現(xiàn)花粉育性正常, 有257株表現(xiàn)半育性, 經(jīng)過卡方檢驗, 正常和半育的遺傳分離比符合3∶1 (表2), 表明突變體的半育性狀是受1對隱性核基因控制。但正交和反交的分離比相差甚遠(yuǎn), 分別為1.5∶1和9∶1, 都嚴(yán)重偏離3∶1, 說明決定半育性狀的候選等位基因在其配子中的比例并不符合1∶1。

2.5 花粉半育性性狀的基因定位

選用/93-11的F2群體作為定位群體, 用花粉育性正常和半育性2個基因池進行連鎖篩選, 并用100個單株進行連鎖驗證, 發(fā)現(xiàn)位點與水稻10號染色體的6個SSR標(biāo)記緊密連鎖, 將目的基因定位于RM25164與RM25741之間, 物理距離為11.91 Mb (圖4-A)。隨后, 擴大分析群體, 將目的基因定位在一個1.79 Mb區(qū)間內(nèi)(圖4-B)。進一步將群體擴大到800個單株, 最終將目的基因定位在RM25389和RM25404之間(圖4-C)。根據(jù)水稻注釋數(shù)據(jù)庫(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)顯示, 該區(qū)間共有31個預(yù)測基因(圖4-D)。

表2 sfp10突變位點的遺傳分析

圖4 sfp10突變表型的基因初定位

A:定位在10號染色體上11.91 Mb范圍內(nèi); B:定位在1.79 Mb范圍內(nèi); C:定位在398 kb范圍內(nèi); D: 定位區(qū)間有31個預(yù)測基因。

A:was located in the interval of 11.91 Mb on chromosome 10; B:was located in the interval of 1.79 Mb; C:was located in the interval of 398 kb; D: 31 genes was predicted in the localization interval.

2.6 定位基因的信息分析

為了解定位區(qū)間基因的生物學(xué)功能, 按照錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)對這些基因進行基因本體論(gene ontology, GO)富集分析。對31個基因進行GO功能注釋和分析發(fā)現(xiàn), 在3類注釋生物學(xué)過程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)中所占的比例分別為32.11%、44.04%和23.85% (圖5-A)。在生物學(xué)過程中, 以細(xì)胞過程(cellular process)和代謝過程(metabolic process)的基因數(shù)最多, 其次為單一有機體過程(metabolic process)。細(xì)胞組分注釋的基因大部分集中在細(xì)胞(cell)、細(xì)胞組分(cell part)、細(xì)胞器(organelle)、膜脂(membrane)以及膜組分(membrane part)等。在分子功能中, 結(jié)合(binding)和催化活性(catalytic activity)組擁有的基因數(shù)最多。此外, 結(jié)合突變體與野生型的生理檢測結(jié)果, 分析定位區(qū)間的基因功能注釋, 發(fā)現(xiàn)有4個基因參與氨基酸的合成和代謝, 3個基因參與蔗糖的轉(zhuǎn)運, 1個基因參與淀粉的合成(表3)。

通過KEGG對定位區(qū)間基因進行富集分析, 發(fā)現(xiàn)這些基因主要集中在新陳代謝(metabolism)途徑, 所占比例為77.78% (圖5-B)。其中, 氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、其他多糖降解(other glycan degradation)以及硒-化合物代謝(selenocompound metabolism)途徑達(dá)到顯著富集水平, 說明這些代謝途徑在花粉后期發(fā)育中非常重要。

圖5 sfp10定位區(qū)間基因的信息分析

A:定位區(qū)間基因的GO富集分析; B:定位區(qū)間基因的KEGG富集分析。

A: GO enrichment of genes in the localization interval of mutant; B: KEEG enrichment of genes in positioning interval of mutant.

表3 主要候選基因及功能注釋

3 討論

屬于花粉不完全敗育, 育性在35.0%～ 74.9%的半育性突變體。遺傳分析發(fā)現(xiàn), 突變體與野生型雜交F1代花粉育性與野生型相當(dāng), 表明突變性狀受隱性基因控制; F2代的花粉育性分離比經(jīng)卡方檢驗符合3∶1 (表2), 說明的雄性不育性狀是受單基因控制的隱性遺傳。然而, 正反交組合的F2代花粉育性分離比卻嚴(yán)重偏離3∶1, 說明在將突變體的細(xì)胞質(zhì)換成野生型的細(xì)胞質(zhì)時, 能顯著提高花粉的育性, 推測花粉育性受核質(zhì)互作的影響或隱性純合半致死。

花粉的鏡檢表明, 與野生型相比, 突變體中花粉數(shù)量無明顯差異, 但花粉育性卻顯著下降, 說明花粉前期的形態(tài)、數(shù)量發(fā)育沒有受到顯著影響, 但在后期發(fā)育過程中, 花粉積累淀粉量明顯降低, 致使敗育率增加(圖1)。掃描電鏡也進一步證實, 在花粉后期的發(fā)育中, 野生型隨著淀粉粒的填充, 花粉逐漸趨于飽滿成熟, 而突變體中淀粉填充明顯受阻, 進而使部分花粉體積減小、外壁皺縮、呈干癟狀態(tài), 極大影響了花粉的育性(圖2)。

淀粉積累是花粉后期發(fā)育和成熟的關(guān)鍵階段, 然而此階段的具體調(diào)控機制還不十分清楚。根據(jù)之前轉(zhuǎn)錄組和蛋白組報道的數(shù)據(jù), 有大量基因和蛋白參與水稻花粉后期發(fā)育的淀粉合成和蔗糖代謝, 其調(diào)控機制異常復(fù)雜[22-24]。目前, 已從部分水稻雄性不育突變體中鑒定并克隆出參與花粉中淀粉積累過程的幾個重要基因, 例如()基因通過編碼L型凝集素類受體蛋白激酶影響花粉中蔗糖、淀粉代謝關(guān)鍵酶的活性, 調(diào)控花粉中淀粉的積累, 最終影響育性[25]。此外, 還有的其他等位基因[26]、[27]和[28]都對花粉中淀粉的積累有不同程度的影響。

蔗糖作為碳水化合物的物質(zhì)基礎(chǔ), 與花粉中淀粉的合成和積累密切相關(guān)[9]。通過沉默水稻的基因, 阻止UDP-葡萄糖降解, 不能產(chǎn)生淀粉合成的碳骨架Glc-1-P, 使花粉中淀粉合成中斷, 最終導(dǎo)致花粉不育[29]。本研究通過檢測水稻各個組織中蔗糖的含量, 發(fā)現(xiàn)在源葉、庫葉、莖等穗部上游部位, 突變體中蔗糖含量要普遍高于野生型, 而穗部的蔗糖含量卻顯著降低(圖3), 說明蔗糖到穗部的轉(zhuǎn)運機制可能受到阻礙, 致使蔗糖在穗部上游部位積累, 而穗部蔗糖含量明顯不足。另外, 脯氨酸作為α-酮戊二酸的上游轉(zhuǎn)化氨基酸, 參與植物中糖類的代謝[30-31], 而突變體穗部脯氨酸含量的降低, 也可能是導(dǎo)致花粉中淀粉積累減少、育性降低的重要原因。

綜上, 造成水稻半育性狀的因素很多, 大多與花粉的育性和萌發(fā)相關(guān)。本研究中半育突變體主要表現(xiàn)為花粉育性顯著下降, 最終導(dǎo)致結(jié)實率降低。通過對突變體位點基因定位, 將候選基因定位于在10號染色體398 kb區(qū)間內(nèi), 在31個候選基因中共發(fā)現(xiàn)4個與蔗糖、淀粉合成的相關(guān)基因(、、和), 這些基因主要參與水稻植株中蔗糖的轉(zhuǎn)運[32]和發(fā)育種子中淀粉的合成[33]; 4個與氨基酸合成相關(guān)的基因(、、和), 這些基因主要參與各種氨基酸的合成[34-35], 影響蛋白激酶的活性[36-37]。這與之前水稻半育株突變體在8號染色體上的候選基因位點相差甚遠(yuǎn), 說明水稻半育性狀可能受多種分子調(diào)控機制的影響。通過對的基因定位和候選基因區(qū)間的信息分析, 為后期此突變體的精細(xì)定位、候選基因克隆以及水稻花粉后期發(fā)育過程中淀粉積累調(diào)控機制的深入研究奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過對花粉半育性突變體花粉形態(tài)、育性及相關(guān)生理指標(biāo)的檢測分析, 表明是一個花粉發(fā)育后期淀粉合成、積累受阻, 導(dǎo)致部分花粉不育的半育性突變體, 其突變表型受1個隱性單基因控制。通過遺傳連鎖分析和染色體步移技術(shù)將控制花粉半育性的基因定位于398 kb區(qū)間內(nèi)。本研究結(jié)果將為進一步開展花粉半育性調(diào)控基因的精細(xì)定位、基因功能及調(diào)控機制的深入研究和育種利用奠定基礎(chǔ)。

附表1 用于sfp10基因定位的分子標(biāo)記

(續(xù)附表1)

附表2 93-11與sfp10正?；ǚ哿Ｐ螒B(tài)分析

[1] Ren D Y, Li Y F, He G H, Qian Q. Multifloret spikelet improves rice yield., 2020, 225: 2301–2306.

[2] Lin H, Yu J, Pearce S P, Zhang D B. Rice anther net: a gene co-expression network for identifying anther and pollen deve-lopment genes., 2017, 92: 1076–1091.

[3] 馮九煥, 盧永根, 劉向東, 徐雪賓. 水稻花粉發(fā)育過程及其分期. 中國水稻科學(xué), 2001, 15: 21–28.

Feng J H, Lu Y G, Liu X D, Xu X B. Pollen development and its stages in rice (L.)., 2001, 15: 21–28 (in Chinese with English abstract).

[4] Borg M, Brownfield L, Twell D. Male gametophyte development: a molecular perspective., 2009, 60: 1465–1478.

[5] Hamilton D A, Mascarenhas J P. Gene expression during pollen development. In: Shivanna K R, Shivanna K R, Sawhney V K, eds. Pollen Biotechnology for Crop Production and Improvement. Cambridge: Cambridge UP, 1997. pp 40–58.

[6] Lee S K, Eom J S, Hwang S K, Shin D, An G, Okita T W, Jeon J S. Plastidic phosphoglucomutase and ADP-glucose pyrophosphorylase mutants impair starch synthesis in rice pollen grains and cause male sterility.,2016, 67: 5557–5569.

[7] Li T, Gong C Y, Wang T.is required for postmeiotic pollen development in., 2010, 72: 265–277.

[8] Cho J I, Ryoo N, Eom J S, Lee D W, Kim H B, Jeong S W, Lee Y H, Kwon Y K, Cho M H, Bhoo S H, Hahn T R, Park Y I, Hwang I, Sheen J, Jeon J S. Role of the rice hexokinasesandas glucose sensors., 2009, 149: 745–759.

[9] Datta R, Chamusco K C, Chourey P S. Starch biosynthesis during pollen maturation is associated with altered patterns of gene expression in maize., 2002, 130: 1645–1656.

[10] Tetlow I J, Morell M K, Emes M J. Recent developments in understanding the regulation of starch metabolism in higher plants., 2004, 55: 2131–2145.

[11] Hu Z, Tang Z, Zhang Y, Niu L, Yang F, Zhang D, Hu Y. Rice SUT and SWEET Transporters., 2021, 22: 11198.

[12] Wu Y, Fang W, Peng W, Jiang M, Chen G, Xiong F. Sucrose transporter in rice., 2021, 16: 1952373.

[13] David M B. SWEET! The pathway is complete., 2012, 335: 173–174.

[14] Karrer E E, Rodriguez R L. Metabolic regulation of rice α-amylase and sucrose synthase genes in planta., 1992, 2: 517–523.

[15] Long W, Dong B, Wang Y, Pan P, Wang Y, Liu L, Chen X, Liu X, Liu S, Tian Y, Chen L, Wan J. FLOURY ENDOSPERM8 encoding the UDP-glucose pyrophosphorylase 1, affects the synthesis and structure of starch in rice endosper., 2017, 60: 513–522.

[16] Tang X J, Peng C, Zhang J, Cai Y, You X M, Kong F, Yan H G, Wang G X, Wang L, Jin J, Chen W W, Chen X G, Ma J, Wang P, Jiang L, Zhang W W, Wan J M. ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit 2 is essential for storage substance accumulation and subunit interactions in rice endosperm., 2016, 249: 70–83.

[17] 賀和初. 滇1型和BT型雜交稻育性遺傳和不育機理研究. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1988, (1): 54–68.

He H C. A preliminary study on the fertility inheritance and male sterile mechanism of hybrid rice of Dian 1 type and BT type., 1988, (1): 54–68 (in Chinese with English abstract).

[18] Li W, Jiang L, Zhou S, Wang C, Liu L, Chen L, Ikehashi H, Wan J M. Fine mapping of, a pollen semi-sterile gene in rice (L.)., 2007, 114: 939–946.

[19] Li S C, Li W, Huang B, Cao X, Zhou X, Ye S, Li C, Gao F, Zou T, Xie K, Ren Y, Ai P, Tang Y, Li X, Deng Q, Wang S, Zheng A, Zhu J, Liu H, Wang L, Li P. Natural variation in PTB1 regulates rice seed setting rate by controlling pollen tube growth., 2013, 4: 1–13.

[20] 李利軍, 孔紅星, 陸丹梅. 蒽酮-硫酸法快速測定蔗糖的研究及應(yīng)用. 食品工業(yè)科技, 2003, (10): 145–149.

Li L J, Kong H X, Lu D M. Study and application of rapid determination of sucrose by anthrone colorimetric method., 2003, (10): 145–149 (in Chinese).

[21] Rogers S O, Bendich A J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues., 1985, 5: 69–76.

[22] 汪結(jié)明, 張建, 江海洋, 朱蘇文, 范軍, 程備久. RNA干擾水稻基因的表達(dá)對籽粒淀粉合成及其關(guān)鍵酶活性的影響. 作物學(xué)報, 2010, 36: 313–320.

Wang J M, Zhang J, Jiang H Y, Zhu S W, Fan J, Cheng B J. Effects of RNA interference ofgene expression on starch accumulation and key enzymes activities involved in starch synthesis in transgenic rice grain., 2010, 36: 313–320 (in Chinese with English abstract).

[23] Tappiban P, Ying Y, Xu F, Bao J. Proteomics and post- translational modifications of starch biosynthesis-related proteins in developing seeds of rice., 2021, 22: 1–25.

[24] Hirose T, Zhang Z, Miyao A, Hirochika H, Ohsugi R, Terao T. Disruption of a gene for rice sucrose transporter,, impairs pollen function but pollen maturation is unaffected., 2010, 61: 3639–2646.

[25] He Z Y, Zou T, Xiao Q, Yuan G Q, Liu M M, Tao Y, Zhou D, Zhang X, Deng Q, Wang S Q, Zheng A, Zhu J, Liang Y, Yu X, Wang A, Liu H, Wang L X, Li P, Li S C. An L-type lectin receptor-like kinase promotes starch accumulation during rice pollen maturation., 2021, 148: 1–16.

[26] Peng X, Wang M, Li Y, Yan W, Chang Z, Chen Z, Xu C, Yang C, Deng X W, Wu J, Tang X. Lectin receptor kinaseis required for pollen development and male fertility., 2020, 62: 1227–1245.

[27] Wang B, Fang R, Zhang J, Han J, Chen F, He F, Liu Y G, Chen L. Ricephosphorylates a UGPase to regulate callose biosynthesis during pollen development., 2020, 71: 4033–4041.

[28] Zhang X, Zhao G C, Tan Q, Yuan H, Betts N, Zhu L, Zhang D, Liang W Q. Rice pollen aperture formation is regulated by the interplay betweenand., 2020, 6: 394–403.

[29] Mu H, Ke J H, Liu W, Zhuang C X, Yip W K. UDP-glucose pyrophosphorylase2(), a pollen-preferential gene in rice, plays a critical role in starch accumulation during pollen maturation., 2009, 54: 234–243.

[30] 陶龍興, 王熹, 俞美玉, 黃效林. CM268誘導(dǎo)水稻雄性不育的效果及作用機理研究. 作物學(xué)報, 2001, 27: 178–184.

Tao L X, Wang X, Yu M Y, Huang X L. Bio-effects and mechanism of CM268on inducing rice male sterility., 2001, 27: 178–184 (in Chinese with English abstract).

[31] Lehmann S, Funck D, Szabados L, Rentsch D. Proline metabolism and transport in plant development., 2010, 39: 949–962.

[32] Chen P F, Chen L, Jiang Z R, Wang G P, Wang S H, Ding Y F. Sucrose is involved in the regulation of iron deficiency responses in rice (L.)., 2018, 37: 789–798.

[33] Yang J, Kim S R, Lee S K, Choi H, Jeon J S, An G. Alanine aminotransferase 1 () plays an essential role in the regulation of starch storage in rice endosperm., 2015, 240: 79–89.

[34] Khan I, Khan S, Zhang Y, Zhou J. Genome-wide analysis and functional characterization of the Dof transcription factor family in rice (L.)., 2021, 253: 101.

[35] Hu Y, Li S L, Fan X, Song S, Zhou X, Weng X Y, Xiao J H, Li X H, Xiong L Z, You A Q, Xing Y Z.andredundantly shape rice tiller angle by reducing HSFA2D expression and auxin content., 2020, 184: 1424–1437.

[36] Li Z, Ao Y, Feng D, Liu J, Wang J, Wang H B, Liu B.,andpositively regulate chitin- and PGN-induced immunity in rice., 2017, 10: 6–10.

[37] Vij S, Giri J, Dansana P K, Kapoor S, Tyagi A K. The receptor-like cytoplasmic kinase () gene family in rice: organization, phylogenetic relationship, and expression during development and stress., 2008, 1: 732–750.

Physiological characteristics analysis and gene mapping of a semi-sterility plantmutantin rice (L)

LI Qiu-Ping1, ZHANG Chun-Long1, YANG Hong1, WANG Tuo1, LI Juan1, JIN Shou-Lin1, HUANG Da-Jun1, LI Dan-Dan1,2,*, and WEN Jian-Cheng1,*

1Rice Research Institute of Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, Yunnan, China;2Key Laboratory of Crop Production and Intelligent Agriculture of Yunnan Province, Kunming 650201, Yunnan, China

In this study, the advanced backcross population of() mutation constructed by rice pollen semi-fertile mutantandrice cultivar 93-11 (wild-type, WT) was used as the research subjects. Compared to the WT, there were no significant differences in plant height, leaf length, leaf width, tiller number, pollen number and other agronomic traits, but pollen fertility reduced significantly. Pollen microscopy and scanning electron microscopy (SEM) at the late stage of pollen development showed that starch accumulation in some pollen ofdecreased observably, eventually led to pollen abortion. Physiological indexes related pollen development revealed that the contents of proline and starch in pollen of themutant decreased significantly. Sucrose accumulation generally increased in the upstream tissues (source leaf, sink leaf, and stem) of panicle, but sucrose content decreased significantly in panicle, indicating that transport from sucrose to panicle was affected. Genetic analysis indicated that thephenotype was controlled by a pair of recessive nuclear genes. Gene preliminary mapping located the mutant site into a 398 kb interval between RM25389 and RM25404 on rice chromosome 10, which contained 3 genes related to sucrose transport and 1 gene related to starch synthesis. This study laid a foundation for further research on fine mapping, gene function, and regulation mechanism of pollen semi-fertility regulation genes.

rice; semi-plant;; gene mapping; starch accumulation

10.3724/SP.J.1006.2023.22005

本研究由云南省重大科技專項(202102AE090017), 云南省基礎(chǔ)研究計劃面上項目(202201AT070263), 云南省教育廳科學(xué)研究基金項目(2022J0280)和云南省作物生產(chǎn)與智慧農(nóng)業(yè)重點實驗室開放基金課題(20210101)資助。

This study was supported by the Major Science and Technology Project of Yunnan Province (202102AE090017), the Basic Research General Program of Yunnan Province (202201AT070263), the Science Research Fund Project of Yunnan Education Department (2022J0280), and the Open Fund Project of Key Laboratory of Crop Production and Intelligent Agriculture of Yunnan Province (20210101).

通信作者(Corresponding authors):李丹丹, E-mail: lidanzaizhe@163.com; 文建成, E-mail: jcwen1117@163.com

E-mail: qiupingyouxiang@163.com

2022-01-21;

2022-06-07;

2022-07-05.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220704.1718.004.html

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