朱曉彤 葉亞峰 郭均瑤 楊惠杰 王紫瑤 詹 玥 吳躍進 陶亮之 馬伯軍 陳析豐,* 劉斌美,*

水稻早衰基因的遺傳與定位

朱曉彤1,2葉亞峰2郭均瑤2楊惠杰2王紫瑤1詹 玥2吳躍進2陶亮之2馬伯軍1陳析豐1,*劉斌美2,*

1浙江師范大學化學與生命科學學院, 浙江金華 321004;2中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院, 安徽合肥 230031

早衰突變體是研究植物細胞凋亡分子機制的重要遺傳材料。從水稻“科輻粳7號”誘變庫中, 篩選到一個早衰突變體()。與野生型相比, 該突變體葉片在抽穗期表現(xiàn)出嚴重的早衰, 其株高、分蘗數(shù)、穂長、每穗粒數(shù)以及結(jié)實率, 在成熟期均極顯著降低, 但千粒重無顯著變化; 該突變體葉片的葉綠素含量顯著下降, 組織化學染色進一步檢測到細胞死亡、活性氧與丙二醛過量積累。遺傳分析發(fā)現(xiàn), 該突變體的早衰表型受單隱性核基因控制。采用圖位克隆技術將基因精細定位在12號染色體的FM12-14和FM12-15分子標記之間, 物理距離為359 kb。候選基因預測與PCR測序結(jié)果表明,基因是基因的一個新等位變異, 突變位點發(fā)生在該基因的保守區(qū)域。以上結(jié)果為進一步研究該基因編碼蛋白的功能及其早衰分子機制提供理論依據(jù)。

早衰; 水稻;; 細胞凋亡; 定位克隆

水稻作為我國重要的糧食作物之一, 其產(chǎn)量一直是育種家關注的重點。衰老(senescence)是植物生長發(fā)育進程中不可或缺的環(huán)節(jié)之一, 衰老過程伴隨著細胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)。過早的衰老會使植株的生理機能退化, 光合速率降低, 從而影響作物的產(chǎn)量[1-3]。水稻結(jié)實率常受到各種葉片早衰的影響而下降, 研究如何避免水稻發(fā)生早衰, 具有重要的研究意義。水稻早衰突變體根據(jù)其葉色表型的差異, 可分為葉片黃化早衰和葉片斑點早衰[4]; 根據(jù)對環(huán)境的敏感程度, 又可分為環(huán)境敏感型和環(huán)境鈍感型, 一般會受到黑暗環(huán)境等外界條件的誘導; 根據(jù)遺傳特征, 還可分為顯性突變和隱性突變, 通常是單個基因控制的, 但也有少數(shù)受雙基因控制[5-8]。不同早衰突變體的表型出現(xiàn)時期也有所不同, 在水稻各生育期中均有可能出現(xiàn)早衰[9-10]。

目前, 在水稻中已報道約200個早衰突變體, 這些控制早衰的基因分布于水稻12條染色體上[11]?；蚨ㄎ挥?1號染色體, 是由于淀粉積累和糖代謝異常導致早衰表型的出現(xiàn)[12];基因定位在4號染色體, 編碼糞卟啉原III氧化酶, 其葉片的早衰斑點出現(xiàn)是光依賴型的, 并伴隨著活性氧(reactive oxygen species, ROS)的積累[13];基因定位于10號染色體, 編碼原葉綠素酸酯氧化還原酶B, 產(chǎn)生淡綠葉的表型, 與其他突變體不同的是, 在固定或強光照條件下, 新出的葉片會迅速黃化并形成黃白斑和壞死病斑[14];基因與水稻葉片衰老有關, 其編碼一個含有AAA型ATP酶結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)運蛋白, 該基因的突變導致葉片衰老延遲[15];基因定位于1號染色體, 編碼一個網(wǎng)格蛋白復合體中間亞基μ1, 該蛋白的功能缺失導致了斑點的形成, 進而引發(fā)植株的早衰[16];(又稱)基因定位于12號染色體, 編碼細胞色素P450單加氧酶, 其功能的缺失會影響葉綠體的發(fā)育, 導致水稻葉片細胞死亡與早衰[17-18];基因定位于7號染色體, 編碼SF3b3型剪接因子, 該基因突變也導致葉片出現(xiàn)斑點及細胞死亡[19];基因定位于8號染色體, 編碼鋅指蛋白, 也會受到光的誘導, 參與細胞程序性死亡的過程[20]。因此, 獲得更多的早衰突變體以及克隆相應基因是研究水稻早衰分子機制的關鍵, 同時也為研究水稻葉片早衰帶來的產(chǎn)量影響提供理論依據(jù)。本研究采用重離子束輻射誘變技術對粳稻品種科輻粳7號進行處理, 篩選到了一個可穩(wěn)定遺傳的早衰突變體, 命名為()。通過對早衰突變體的表型鑒定、生理生化分析以及目的基因的定位克隆, 為進一步研究水稻早衰的分子機制及育種應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院技術生物與農(nóng)業(yè)工程研究所利用氮離子束輻射誘變粳稻(L. subsp.)品種科輻粳7號, 獲得早衰突變體, 在田間連續(xù)種植多代后穩(wěn)定遺傳。在抽穗期, 取突變體及其野生型對照科輻粳7號相同部位的葉片, 用于后續(xù)的組織染色與各類生理指標測定。待水稻成熟后,突變體及其野生型對照用于農(nóng)藝性狀分析。以突變體為母本, 與野生型秈稻品種華粳秈74雜交, 其F1代自交得到的F2代分離群體, 用于目的基因的遺傳分析與精細定位。

1.2 水稻農(nóng)藝性狀統(tǒng)計

隨機選取突變體及其野生型對照各15個單株, 統(tǒng)計其株高、有效分蘗數(shù)、穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重等農(nóng)藝性狀。利用SPSS軟件進行顯著性差異的統(tǒng)計分析。

1.3 葉片組織染色分析

臺盼藍(Trypan Blue)染色: 水稻葉片裁剪適當長度, 置于15 mL試管中, 添加15 mL臺盼藍染液, 完全浸沒葉片, 抽真空處理后, 在沸水浴中煮10 min;隨后, 將試管用錫箔紙包好, 于黑暗條件下保存12 h以上; 再將葉子轉(zhuǎn)移到裝有水合氯醛溶液的15 mL試管中, 完全浸沒葉片, 水合氯醛溶液脫色3 d, 每天更換溶液[21]。

二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)染色: 水稻葉片裁剪適當長度, 浸泡在1 mg mL–1DAB (pH 5.8)溶液中, 抽真空處理后, 用錫箔紙包好, 在黑暗條件下染色8 h以上; 取出葉片, 在95%乙醇沸水浴中脫色10 min, 直至葉片透明; 再次浸入裝有95%乙醇的15 mL試管中, 放置1～2 d[22]。

四唑氮藍(nitro blue tetrazolium chloride, NBT)染色: 在琥珀色瓶中, 將0.1 g NBT溶解在50 mmol L–1的磷酸鈉緩沖溶液(pH 7.5)中, 使得體積為50 mL, 得到0.2%的NBT染液。將水稻葉片裁剪適當長度, 直接浸入NBT溶液中, 抽真空處理后, 于28℃避光保存4 h以上; 將葉片置于裝有95%乙醇的試管中, 在沸水浴中脫色10 min, 至葉片透明; 再次浸入裝有95%乙醇的15 mL試管中, 放置1～2 d[23]。

1.4 葉綠素含量測量

突變體與野生型對照各取3個生物學重復。葉片去除中脈后剪碎, 每個樣品稱取約0.1 g于10 mL的離心管中, 每管中加入9 mL 80%丙酮, 避光抽提12 h以上; 以丙酮為空白對照, 通過分光光度計測量644、662 nm處的吸光值, 計算公式[24]為:

葉綠素濃度(mg L–1):C= 9.78×662–0.99×644;

葉綠素濃度(mg L–1):C= 21.43×644–4.65×662;

總?cè)~綠素濃度(mg L–1):總=C+C= 5.13×662– 20.44×644。

1.5 生理生化指標測定

采用MDA含量檢測試劑盒(Solarbio公司)測定丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量, 采用SOD活性檢測試劑盒(Solarbio公司)測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性, 操作方法均參照產(chǎn)品說明。

1.6 目的基因遺傳分析

利用突變體與華粳秈74雜交, 其F1自交獲得的F2分離群體, 在早衰突變表型最明顯的時候, 統(tǒng)計F2群體中早衰型植株與野生型植株的個數(shù), 計算群體的表型分離比, 并進行卡方檢驗[25]。

1.7 目的基因連鎖分析與定位

取F2群體中早衰突變單株的葉片, 采用CTAB法提取DNA[26]。選取均勻分布12條染色體的SSR多態(tài)分子標記對單株DNA進行PCR擴增, 對目的基因進行遺傳連鎖分析與定位。PCR擴增的體系為20 μL, 包括10 μL 2× PCR Mix, 2.0 μL 10 μmol L–1引物, 2.0 μL DNA模板, 6 μL ddH2O。PCR反應程序為: 94℃預變性5 min; 94℃ 20 s、56℃ 20 s、72℃ 20 s, 36個循環(huán); 72℃延伸5 min。精細定位分子標記引物如表1所示。

1.8 ESL8基因的PCR擴增與測序

設計PCR引物(表2), 采用高成功率PCR酶KOD FX試劑盒(TOYOBO公司)對基因進行PCR擴增。PCR體系為50 μL, 包括25 μL 2× PCR buffer for KOD FX, 10 μL dNTP, 3.0 μL 10 μmol L–1引物, 2.0 μL DNA模板, 1 μL KOD FX, 9 μL ddH2O。PCR程序為: 94℃預變性5 min; 98℃ 10 s、56℃ 30 s、68℃ 1 min, 30個循環(huán); 68℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送公司測序。

表1 水稻ESl8基因精細定位分子標記的引物序列

表2 水稻ESL8基因PCR擴增的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻esl8突變體的早衰特征

水稻科輻粳7號經(jīng)輻射誘變后, 獲得了一個類典型的葉片斑點型早衰突變體。在苗期,突變體上就開始出現(xiàn)斑點(圖1-A); 在抽穗時, 斑點已擴散至整個葉片, 導致葉片出現(xiàn)嚴重的早衰表型(圖1-B); 此時突變體的倒四葉和倒五葉全部枯死, 其余葉片也出現(xiàn)早衰表型, 而野生型對照科輻粳7號的所有葉片幾乎還是正常狀態(tài)(圖1-C)。通過比較突變體與野生型對照的農(nóng)藝性狀差異, 發(fā)現(xiàn)該突變體的株高、穂長、有效分蘗數(shù)、結(jié)實率和每穗粒數(shù)均顯著性下降, 但是千粒重沒有明顯變化(表3)。

A: 苗期的植株表型; B: 抽穗期的植株表型; C: 抽穗期的單個分蘗表型; D: 臺盼藍染色; E: DAB染色; F: NBT染色; G: SOD酶活檢測; H: MDA含量測定; I: 葉綠素含量測定。WT: 野生型對照科輻粳7號;: 早衰突變體; 標尺為10 cm; **表示突變體與野生型對照之間存在顯著性差異(< 0.01)。

A: plant phenotype at seedling stage; B: plant phenotype at heading stage; C: single tiller phenotype at heading stage; D: Trypan blue staining; E: DAB staining; F: NBT staining; G: the measurement of SOD enzyme activity; H: the measurement of MDA content; I: the measurement of chlorophyll content. WT refers to the wide-type control Kefujing 7, andrefers to the early-senescence mutant. Bar: 10 cm; ** represents the significance between the mutant and wild-type control at< 0.01.

表3 水稻突變體esl8與野生型對照的農(nóng)藝性狀統(tǒng)計

WT為野生型對照科輻粳7號;為早衰突變體;**表示突變體與野生型對照之間存在顯著性差異(< 0.01)。

WT refers to the wild-type control Kefujing 7 andrefers to the early-senescence mutant.**represents significance between the mutant and wild-type control at< 0.01.

2.2 水稻esl8突變體的遺傳分析

將突變體與野生型華粳秈74進行雜交, 其F1代植株表型正常。F1代自交后, 獲得的F2代群體中出現(xiàn)了早衰的表型分離。對495個F2單株的調(diào)查后, 發(fā)現(xiàn)正常表型植株有382株, 早衰表型植株有113株, 2類表型的分離比經(jīng)卡方檢驗(c2)符合3∶1。遺傳分析表明突變性狀受單隱性核基因控制。因此, 可以利用該群體對目的基因進行圖位克隆。

2.3 水稻esl8基因的精細定位

在基因的圖位克隆過程中, 首先利用課題組自行開發(fā)的覆蓋水稻12條染色體的64個SSR多態(tài)分子標記, 對21個F2代突變單株進行分析, 將基因初定位在12號染色體的LSR6與LSR14兩個標記之間(圖2-A)。進一步利用387個F2代突變單株對基因進行精細定位, 最終將基因鎖定在FM12-14和FM12-15兩個標記之間, 物理距離為359 kb (圖2-B)。通過生物信息學分析, 目的基因的定位區(qū)域包含一個已報道的調(diào)控早衰的基因()[17-18], 而且突變表型與突變體的早衰表型相近。因此, 對突變體及其野生型對照的基因進行了PCR擴增與測序, 結(jié)果顯示在突變體中該基因的第2個外顯子上發(fā)現(xiàn)序列突變, 造成6個堿基(TGCCCC)缺失和3個堿基(GCG)插入(圖2-C), 導致了其編碼蛋白序列中1個氨基酸丟失和1個氨基酸替換。因此, 推斷突變體中的基因發(fā)生了基因的等位變異。

2.4 目的基因編碼蛋白序列的比對與進化分析

基因編碼一個細胞色素P450單加氧酶, 能催化色胺轉(zhuǎn)變成血清素, 血清素在調(diào)控防御基因表達、細胞死亡以及增強抗稻瘟病的抗性等方面發(fā)揮著重要作用, 同時其還影響了水稻葉綠體的發(fā)育和功能[18]。通過突變基因與其野生型基因的各自編碼蛋白序列比對, 結(jié)果顯示基因突變導致了ESL8蛋白在第452與453位缺失2個氨基酸(半胱氨酸、脯氨酸), 同時在第452位又插入了1個丙氨酸, 其余序列與野生型完全一致(圖3-A)。

為研究突變體中該蛋白突變位點對其功能的影響, 首先在擬南芥和水稻中對ESL8及其同源蛋白進行了系統(tǒng)發(fā)育樹分析, 結(jié)果表明基因編碼的細胞色素P450單加氧酶與ESL8親緣關系最近(圖3-B)。此外, 進一步對ESL8及其同源蛋白進行序列比對, 發(fā)現(xiàn)突變位點位于亞鐵血紅素結(jié)合(heme-binding motif)的保守結(jié)構(gòu)域(圖3-C), 對細胞色素P450單加氧酶的活性有重要意義。推測該區(qū)域的半胱氨酸和脯氨酸在維持此類蛋白的功能上具有關鍵作用。

圖2 水稻ESL8基因定位與測序分析

A:基因初定位的物理圖譜; B:基因精細定位的遺傳圖譜;為定位分析所用到F2突變單株數(shù), 標記下的數(shù)字為該標記檢測到的交換事件數(shù); C:基因突變位點的測序結(jié)果, WT為野生型對照科輻粳7號,為早衰突變體, 紅框標出了TGCCCC堿基缺失與GCG堿基插入的位置。

A: the physical map of thegene by preliminary mapping; B: the genetic map ofthegene by fine mapping; ‘’ refers to the number of F2mutants used for mapping; the number under each marker represents the recombinant number detected by the corresponding marker. C: the sequencing results ofgene in the mutation site. WT refers to the wild-type control Kefujing 7 andrefers to the early-senescence mutant. The red box indicates the location of ‘TGCCCC’ deletion and ‘GCG’ insertion.

(圖3)

A:及其野生型基因的編碼蛋白序列比對; B: ESL8及其擬南芥與水稻同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹; C: ESL8及其同源蛋白的保守序列比對。

A: the sequence alignment of the proteins coding by theand its wild-type gene; B: phylogenetic tree of ESL8 and its homologous proteins inand rice; C: the comparison of conserved sequences of ESL8 and its homologous proteins.

3 討論

雖然目前已經(jīng)克隆了大量的水稻早衰基因[27],但是發(fā)現(xiàn)更多的早衰突變體和克隆更多的早衰基因?qū)ρ芯克救~片早衰的分子機制有著重要的意義。研究表明, 早衰突變的發(fā)生機制通常涉及自身和外界等眾多因素, 包括葉齡、細胞程序性死亡失控、相關蛋白酶功能失活、再生植物激素的參與調(diào)控以及非生物脅迫的溫度、光照、濕度以及損傷等影響[28]?；蛲蛔兪沟盟局兴畻钏岷可咭约癛OS的積累, 導致水稻出現(xiàn)早衰[29]; 根與病原體相互作用也會對水稻早衰產(chǎn)生影響,-突變體和野生型之間鑒定出根部土壤的赤霉素含量有所差異并且分泌的糖也不同, 突變體中赤霉素含量的顯著增加導致活性氧的積累, 而利用拮抗細菌抑制特定的病原體, 能夠延緩早衰[30]; 水稻編碼細胞分裂素氧化酶基因的突變體表現(xiàn)出葉片適度延緩衰老表型, 且分蘗數(shù)和穗粒數(shù)均顯著增加[31];水稻早衰突變體中編碼鈣依賴性蛋白激酶的基因發(fā)生突變, 使水稻早衰, 過表達會延遲植株衰老[32];突變體對強光更加敏感, 細胞加快衰老, 葉綠體發(fā)育受影響[33];基因編碼具有AAA+結(jié)構(gòu)域的蛋白, 突變后表現(xiàn)出葉綠體迅速降解、葉片衰老[34]。我們通過重離子誘變篩選獲得的早衰突變體中SOD酶活性明顯降低, 且ROS與MDA過量積累, 很可能導致了嚴重的脂質(zhì)過氧化, 從而觸發(fā)細胞死亡, 最終出現(xiàn)早衰表型。光合色素是植株進行光合作用的關鍵因素,突變體中光合色素含量明顯低于野生型, 可能影響了光合作用及其生物量的合成, 前人報道也表明在葉綠體發(fā)育中也發(fā)揮重要的作用[17]。

同一基因不同的等位變異對植物的生長發(fā)育有著明顯的差異, 主要是因為不同的等位變異對該基因的表達或者該基因編碼蛋白的功能有著明顯差異, 因此獲得基因的不同等位變異對研究該基因以及其編碼的蛋白功能有著重要的意義[17-18]。基因與前人報道的/屬于等位基因, 該基因編碼細胞色素P450單加氧酶家族的CYP71P1蛋白, 具有亞鐵血紅素結(jié)合結(jié)構(gòu)域[17-18]。的突變位點在第452位氨基酸后缺失1個半胱氨酸和1個脯氨酸, 且插入1個丙氨酸, 該突變位點剛好在CYP71P1的非常保守的亞鐵血紅素結(jié)合結(jié)構(gòu)域中, 很可能是導致其功能缺失的關鍵原因, 進一步表明了該保守結(jié)構(gòu)域中這2個氨基酸的重要作用。突變體的千粒重與野生型沒有明顯差異, 說明該突變位點對千粒重沒有影響, 而已報道的突變體其籽粒明顯變小, 千粒重顯著性低于野生型對照。突變位點位于氨基酸序列的第92位, 由丙氨酸突變成了天冬氨酸, 同樣該位點在CYP71蛋白家族中非常保守, 該位點的突變體除了影響葉片葉綠體的發(fā)育以及植物先天免疫外, 還影響水稻籽粒的發(fā)育[17]。另一種可能的解釋是2個突變體的遺傳背景不同導致最終表型的差異。突變體是由氮離子束輻射誘變科輻粳7號得到的, 而已報道的突變體是由武運粳7號經(jīng)甲烷磺酸乙酯誘變處理獲得的[17], 雖然2個品種都是粳稻品種, 但也在遺傳背景上還是有一定的差異。由此可見,基因不同位點的突變對水稻的生長發(fā)育有著不同的作用, 不同等位突變也對其編碼蛋白的功能研究提供了更多的遺傳資源。

4 結(jié)論

通過對水稻突變體的表型觀察與生理生化分析, 發(fā)現(xiàn)基因會導致植株的倒四葉和倒五葉在抽穗期出現(xiàn)嚴重早衰; 使水稻葉片細胞死亡數(shù)目的大幅度增加, 同時ROS和MDA含量也大量積累; 導致了水稻葉片葉綠素含量下降, 很可能影響了植株的光合作用, 從而使產(chǎn)量性狀下降?；蛭挥谒?2號染色體上, 是編碼細胞色素P450單加氧酶基因的新等位變異, 其突變位于CYP71蛋白家族的亞鐵血紅素結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域中, 缺失2個氨基酸(半胱氨酸、脯氨酸)且插入1個丙氨酸, 導致其功能性缺失突變, 造成了水稻早衰表型, 進一步證明了該位點中半胱氨酸和脯氨酸的關鍵作用, 也為下一步研究該蛋白的功能提供新的思路。

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Heredity and fine mapping of an early-senescence leaf genein rice

ZHU Xiao-Tong1,2,YE Ya-Feng2, GUO Jun-Yao2, YANG Hui-Jie2, WANG Zi-Yao1, ZHAN Yue2, WU Yue-Jin2, TAO Liang-Zhi2, MA Bo-Jun1, CHEN Xi-Feng1,*, and LIU Bin-Mei2,*

1College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, Zhejiang, China;2Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Science, Hefei 230031, Anhui, China

Early-senescence mutants are genetic materials important for the researches on the molecular mechanism of cell apoptosis in plants. An early-senescence mutant named(arly enescence eaf 8) has been screened from the mutagenesis library of rice variety Kefujing 7. Compared with the wild-type control, the leaves of themutant displays a severe of early-senescence phenotype at heading stage in rice, and its agronomic traits, including plant height, tiller number, grain length, grains per panicle, and seed setting rate, were obviously impaired except for the 1000-grain weight. In leaves of themutant, the chlorophyll content was abnormally decreased, and the programmed cell death accompanied by excessive accumulation of the reactive oxygen species and the malondialdehyde were detected by histochemical staining. Genetic analysis indicated that the early-senescence phenotype of themutant was controlled by a recessive nuclear gene. Based on the strategy of map-based cloning, thegene was finely mapped into a 359-kb region flanking by two molecular markers (FM12-14 and FM12-15) on chromosome 12. The prediction and verification of candidate genes by PCR sequencing confirmed thatwas a new variational allele of thegene. The sequence of mutationoccurred in the conserved region of the corresponding wild-type gene. Our results provide a theoretical basis for further study on the biofunction and molecular mechanism of the protein encoding byin early-senescence process.

early senescence; rice;; cell apoptosis; mapping and cloning

10.3724/SP.J.1006.2023.22012

本研究由安徽省自然科學基金項目(2108085MC99), 合肥市“借轉(zhuǎn)補”科技專項(J2020G45), 安徽省科技重大專項(202003c08020006)和浙江省自然科學基金重大項目(LD19C130001)資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Anhui Province (2108085MC99), the Hefei Science and Technology Project (J2020G45), the Anhui Science Technology Major Project (202003c08020006), and the Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LD19C130001).

通信作者(Corresponding authors):陳析豐, E-mail: xfchen@zjnu.cn; 劉斌美, E-mail: liubm@ipp.ac.cn

E-mail: 1634453295@qq.com

2022-03-03;

2022-07-21;

2022-08-19.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220819.1451.010.html

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