丁 敏 段政勇 王宇卓 薛亞鵬 王海崗 陳 凌 王瑞云,,* 喬治軍,*

糜子基因功能標記的開發(fā)與驗證

丁 敏1段政勇1王宇卓1薛亞鵬1王海崗2陳 凌2王瑞云1,2,*喬治軍2,*

1山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院, 山西太谷030801;2山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)基因資源研究中心/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/ 雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室, 山西太原030031

根據(jù)糜子胚乳直鏈淀粉合成調(diào)控基因()上已知功能位點的核苷酸差異設計功能分子標記, 并對山西省270份糜子資源進行基因型檢測和基因分型。通過對粳糯性狀的鑒定, 將表型與基因型結(jié)合對分子標記進行驗證。對46份不同基因型糜子資源進行直鏈淀粉含量測定, 分析該基因的遺傳效應, 評估其育種利用價值?；蛟诿幼又幸?種形式(L和S)存在, 針對S型基因15 bp的InDel位點設計了一個功能標記(RYW214), 該標記能有效區(qū)分126 bp、141 bp和雜合(126/141 bp) 3種帶型, 粳糯性鑒定顯示該標記結(jié)果與表型鑒定結(jié)果吻合度高, 達93.30%, Pearson相關性指數(shù)為0.745。針對L型基因上的一個單核苷酸插入位點和一個SNP位點, 設計了2個CAPS標記(RYW215、RYW216), 該標記可對L基因準確分型。270份資源中, 共有11種基因型。其中, 基因型S-15/LF最多, 有84份(31.10%), 其次是S0/S-15/LF(22.96%), S-15/LY/LF最少(0.74%), 未發(fā)現(xiàn)S-15/LC。46份材料中, 直鏈淀粉含量較高的基因型為S0/LY/LF(15.50%), 最低為S-15/LF(0.58%)。突變基因型S-15會導致直鏈淀粉含量出現(xiàn)質(zhì)的下降, 雜合基因型S0S-15直鏈淀粉含量稍高于純合基因型S-15。

糜子;基因; 功能分子標記; 直鏈淀粉含量

糜子(L.)是禾本科黍?qū)僮魑? 異源四倍體, 具有耐旱、耐瘠、抗鹽堿等優(yōu)良特性。由于其抗逆性強、生育期短, 廣泛種植于干旱、半干旱地區(qū)[1-4]。糜子起源于中國黃河流域黃土高原, 種植歷史達10,300年[5-6], 山西是糜子的起源中心[7]。近年來, 土壤干旱、鹽漬等問題日益突出, 基于糜子耐旱、耐鹽堿等特性建立系統(tǒng)鑒選體系為鹽堿地修復提供了重要資源[8-9], Yuan等[10-11]從轉(zhuǎn)錄組和蛋白組層面揭示了糜子抗逆、耐鹽堿的生理機制。糜子又有粳糯糜子之分, 糯糜子稱為黍子, 籽粒脫殼產(chǎn)品為黃米, 因其口感軟糯, 風味較好, 常用來做棗糕、油糕等食品[12]; 粳性糜子籽粒脫殼后稱糜米, 用來制作炒米[13]。依據(jù)穎果胚乳中直鏈淀粉含量, 將直鏈淀粉含量<3.7%的劃歸糯性糜子[14]。

粳糯性狀主要由基因控制,基因又名蠟質(zhì)基因, 在谷類作物中具有編碼直鏈淀粉合成過程中的關鍵酶-顆粒結(jié)合淀粉合成酶(GBSS)的作用[15]。目前, 編碼GBSS的基因已在水稻、小麥、玉米、薯類等多種作物中克隆[16-22]。禾谷類作物糯質(zhì)性狀多由基因變異導致, 研究發(fā)現(xiàn)玉米基因包含14個外顯子和13個內(nèi)含子, 其糯質(zhì)受到隱性基因控制[23]。徐春燕等[24]以玉米昌7-2、Mo17、B73為試驗材料, 克隆基因并測序, 對胚乳淀粉體進行純化, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)GBSSI蛋白第155位氨基酸的改變減弱了與淀粉的結(jié)合度; 并對第4外顯子的SNP位點和第7外顯子的缺失位點進行了分子標記開發(fā)。小麥基因啟動子區(qū)和5￠非翻譯區(qū)存在413 bp的InDel序列, 該序列的缺失與基因表達相關[25]。在水稻基因第一內(nèi)含子剪切位點上游55 bp處存在一個(CT)n重復序列, 以92份美國水稻為材料, 分析了基因相關SSR的多態(tài)性與直鏈淀粉含量的關系, 檢測了(CT)8到(CT)20等多個等位變異, 發(fā)現(xiàn)基因型(CT)18品種直鏈淀粉含量最低[26-27]。Kawase等[28]研究發(fā)現(xiàn)糯性/低直鏈淀粉含量谷子起源于東亞和東南亞, 由當?shù)厝讼埠眠x擇馴化而來。Fukunaga等[29]通過Southern雜交, 依據(jù)谷子基因插入序列的不同將其劃分為7種類型(I～VII), 其中III、IV、V和VII中插入序列較大。粳糯糜子胚乳中都含有編碼蛋白, 只是相對于粳性植株而言, 糯性品種中缺乏GBSSI活性。早在2009年, Graybosch等[30]對糯性糜子材料(隴糜16號和隴糜18號)的胚乳性質(zhì)進行研究發(fā)現(xiàn), 糯性性狀由2個隱性等位基因控制。Hunt等[31]對糜子基因進行測序發(fā)現(xiàn),基因以L和S (-L和-S) 2種形式存在, 在-S基因外顯子10附近存在15 bp的缺失(野生型為S0, 突變型為S-15), 該缺失與GBSSI失活效應間存在對應關系, 即與糯性胚乳相對應; 在-L基因上觀察到2個多態(tài)性位點, 位于外顯子9處的移碼突變(腺嘌呤殘基的插入/缺失), 以及位于外顯子7處的SNP位點突變(A替換G), 將不存在移碼突變和SNP位點突變的野生型記為LC。2013年, Hunt等[32]利用I2-KI顯色反應發(fā)現(xiàn), S-15/LC基因型的糜子品種胚乳細胞淀粉粒外部被染成紅色, 內(nèi)部被染成藍色, 說明該基因型具有中間表型, LC等位基因可以催化合成直鏈淀粉蛋白, 因此, L和S等位基因?qū)γ幼优呷榻Y(jié)構(gòu)均具有調(diào)控作用。Wang等[33]對中國132份糜子材料基因的多態(tài)性位點進行PCR擴增, 基于測序結(jié)果進行材料的基因型分型, 證實了S-15基因型的突變對糜子胚乳質(zhì)地的改變是必須的, 該研究未發(fā)現(xiàn)S-15/LC的部分糯性材料。

分子標記輔助育種可對基因型直接進行準確穩(wěn)定選擇, 避免環(huán)境因素干擾[34], 大幅度縮短育種年限[35]。隨機的分子標記與目的基因連鎖不緊密, 常見的SSR、RFLP等多位于非表達序列, 難以揭示目標性狀差異的內(nèi)在原因[24,36]。功能標記是位于基因內(nèi)、具有控制性狀表型的標記, 開發(fā)功能標記可有效解決上述問題[20]。本研究在Hunt等[31-32]的研究基礎上進行基因功能標記開發(fā), 包括-S基因的一個InDel位點和-L基因的移碼突變以及單堿基突變位點, 利用開發(fā)的標記對山西省糜子資源進行基因分型, 通過粳糯性檢測驗證標記準確率, 以期為糜子糯性品質(zhì)育種提供分子檢測工具。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以來源于山西省的270份糜子資源為試驗材料, 包括育成品種11份、地方品種178份和農(nóng)家種81份(附表1)。除農(nóng)家種外, 材料均由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所提供。

1.2 DNA提取

剪取糜子三葉期葉片于超低溫冰箱保存, 采用CTAB法提取基因組DNA, 用微量核酸分析儀檢測DNA的濃度/純度, 用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。

1.3 糜子表型鑒定

對糜子資源進行粳糯性鑒定, 取種子5粒, 浸泡24 h后將種子研磨成粉末, I2-KI染色, 光學顯微鏡下觀察。淀粉顆粒若為小球形且呈藍黑色/黑色, 材料為粳性, 若為六邊形且呈橙紅色/黃色, 則為糯性。

1.4 功能標記開發(fā)

從NCBI上下載糜子-S基因(GU199261)和-L基因序列(GU199253), 利用Primer 5.0設計引物(表1), 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。-S基因存在一個InDel位點;-L基因上存在2個SNP位點, 包括一個單堿基替換位點和一個移碼突變位點[26], 對上述位點進行功能標記開發(fā)。

1.4.1 InDel標記開發(fā) 選用上引物M5、下引物R11擴增S基因的exon 9-intron 10, 擴增片段包括InDel位點。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序, 基于測序設計2對嵌套引物(M5QT1/R11QT1和M5QT2/R11QT2)。采用巢式PCR法進行擴增, 擴增產(chǎn)物用3.5%瓊脂糖凝膠檢測, 電源電壓60 V。

1.4.2 SNP-CAPS標記的開發(fā) 用前引物int5Lf、后引物R3對-L基因進行擴增, 擴增片段包括SNP位點(A替換G), 用前引物M12、后引物R12對-L基因上的移碼突變位點進行擴增。對擴增產(chǎn)物進行測序, 利用在線軟件dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcps.html)開發(fā)CAPS標記。

1.4.3 PCR擴增程序及酶切體系構(gòu)建 PCR擴增體系同石甜甜等[37]。擴增程序為94℃預變性5 min; 94℃變性40 s, 退火40 s, 72℃延伸1 min, 34個循環(huán); 72℃延伸5 min。酶切總反應體系為50 μL, 包括PCR產(chǎn)物10 μL、限制性內(nèi)切酶1 μL (10,000 U mL–1)、10× CutSmart buffer 5 μL、無酶水34 μL, 37℃恒溫水浴1～2 h。酶切產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠檢測, 電源電壓110 V。

1.5 直鏈淀粉含量測定

采用直鏈淀粉含量檢測試劑盒法(Boxbio- AKSU016C)提取糜子材料的直鏈淀粉, 直鏈淀粉可與碘形成藍色絡合物, 測定待測樣本在550 nm和485 nm處吸光值的變化可定量檢測直鏈淀粉的含量。

式中,為待測樣本總體積(5 mL);為樣本質(zhì)量(g);為標準曲線方程的值(mg mL–1)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用SPSS 23.0分析表型相關數(shù)據(jù), 用DNAMAN 6.0軟件進行測序比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 糜子Waxy基因區(qū)域引物設計

本試驗所用引物(表1)部分來源于Hunt等[31]。根據(jù)糜子基因序列(GU199261)和M5/R11的測序結(jié)果設計了2對嵌套引物(M5QT1/R11QT1、M5QT2/R11QT2), 均能擴增出目的條帶, 特異性好, 可用于后期功能標記的開發(fā)。

2.2 InDel標記的開發(fā)

采用引物M5/R11擴增S基因的exon 9-intron 10區(qū)域, 擴增片段包括InDel位點, 擴增長度約為330 bp, 2對嵌套引物: M5QT1/R11QT1 (擴增片段126 bp)和M5QT2/R11QT2 (擴增片段160 bp), 將該標記命名為RYW214。采用巢式PCR法擴增270份糜子, 結(jié)果見圖1。從圖1可以看出, 共擴增出3種帶型, 含有15 bp的基因型S0、缺失15 bp的基因型S-15及雜合基因型S0S-15。270份糜子資源中, 基因型S0、S-15和S0S-15分別為89份、93份和88份。

2.3 CAPS標記的開發(fā)

利用引物Int5Lf/R3和M12/R12分別擴增-L的intron 5-exon 7和intron 8-intron 9區(qū)域, 擴增片段包括2個SNP位點, 分別為第7外顯子153位點處堿基替換位點(A替換G)和第9外顯子224位移碼突變位點(插入A)。利用在線軟件dCAPS Finder 2.0對SNP酶切位點進行預測發(fā)現(xiàn), 這2個位點均能被限制性內(nèi)切酶切開, Int5Lf/R3擴增片段為223 bp, 當該SNP位點存在A替換G時可被I (GT↓MKAG)酶切產(chǎn)生171 bp和52 bp兩個片段(圖2)。M12/R12擴增片段為645 bp, 當存在插入A導致移碼突變時可被NI (CCTNN↓NNNAGG)酶切產(chǎn)生359 bp和286 bp兩個片段(圖3), 將2個CAPS標記分別命名為RYW215和RYW216。

表1 試驗所用引物明細

圖1 部分材料在InDel位點的擴增產(chǎn)物電泳圖

M為marker 500; 168: 二紅黍; 169: 大紅黍; 170: 小黑黍; 175: 硬地黃; 176: 黃黍子; 177: 老來紅; 178: 邊梅黍; 183: 成熟紅; 180: 狗尾蛋; 181: 白骷髏; 182: 小紅軟糜; 184: 軟白糜。

M: marker 500; 168: Erhongshu; 169: Dahongshu; 170: Xiaoheishu; 175: Yingdihuang; 176: Huangshuzi; 177: Laolaihong; 178: Bianmeishu; 183: Chengshuhong; 180: Gouweidan; 181: Baikulou; 182: Xiaohongruanmi; 184: Ruanbaimi.

圖2 部分材料在SNP (A/G替換)位點擴增產(chǎn)物電泳圖

M為marker 2000; 197: 峪雜1號; 198: 大黃糜子; 199: 小青糜子; 200: 大白硬糜; 203: 大黃芽。

M: marker 2000; 197: Yuza 1; 198: Dahuangmizi; 199: Xiaoqingmizi; 200: Dabaiyingmi; 203: Dahuangya.

圖3 部分材料在移碼突變位點的擴增產(chǎn)物電泳圖

M為marker 2000; 179: 雞爪紅; 180: 狗尾蛋; 181: 白骷髏; 182: 小紅軟糜; 183: 成熟紅; 184: 軟白糜; 185: 千斤黍; 186: 珍珠連軟糜; 187: 白軟黍; 188: 紅黍子; 189: 金紅黍; 191: 糜子。

M: marker 2000; 179: Jizhuahong; 180: Gouweidan; 181: Baikulou; 182: Xiaohongruanmi; 183: Chengshuhong; 184: Ruanbaimi; 185: Qianjinshu; 186: Zhenzhulianruanmi; 187: Bairuanmi; 188: Hongshuzi; 189: Jinhongshu; 191: Mizi.

2.4 InDel標記和CAPS標記驗證

為了進一步驗證開發(fā)標記與基因型的一致性, 選取條帶中顯示不同基因型的7份材料(序號分別為41、49、60、73、80、87和89)進行PCR擴增并測序。DNAMAN序列比對結(jié)果(圖4)顯示, InDel位點及SNP位點的多態(tài)性與電泳顯示結(jié)果一致。

2.5 糜子粳糯性驗證

-S基因InDel位點若存在15 bp缺失, 引起GBSS酶活性喪失, 糜子資源呈糯性。利用上述開發(fā)的分子標記擴增270份糜子資源, 檢測其遺傳差異, 發(fā)現(xiàn)在InDel位點處, 除S0、S-15基因型的材料外, 還出現(xiàn)了S0S-15雜合基因型材料, 為探究雜合基因型是否會影響糜子表型, 檢測了糜子粳糯表型(圖5)。

對于-L基因上存在的2個SNP位點, 當存在A替換G時, 基因型用LY表示; 存在A插入時, 用LF表示; A替換G和A插入均不存在, 用LC表示, 均存在則表示為LY/LF, 基于此對270份資源進行基因分型, 結(jié)果見表2。從表2可以看出, 全部材料中, 基因型最多的是S-15/LF, 為84份(31.11%); 其次是S0/S-15/LF, 為62份(22.96%); S-15/LY/LF最少, 為2份(0.74%); 不存在S-15/LC。

圖4 3對引物擴增7份材料的DNAMAN序列比對結(jié)果圖

A、B和C分別代表引物M5/R11、M12/R12和int5Lf/R3。41: 白黍子; 49: 黍子; 60: 黑糜子; 73: 白糜子; 80: 六十天小紅黍; 87: 大白黍; 89: 大白黍。

A, B, and C indicate primer M5/R11, M12/R12, and int5Lf/R3, respectively. 41: Baishuzi; 49: Shuzi; 60: Heimizi; 73: Baimizi; 80: Liushitianxiaohongshu; 87: Dabaishu; 89: Dabaishu.

表2 270份糜子基因型分型

S-15和S0分別代表InDel位點15 bp缺失的有和無。LC: SNP位點無A替換G和插入堿基A; LY: SNP位點A替換G; LF: SNP位點插入堿基A。

S-15and S0indicate with and without 15 bp deletion at InDel site, respectively. LC: nucleotide base A substitution for G and no nucleotide base A insertion at SNP site; LY: a substitution for G at SNP site; LF: nucleotide base A insertion at SNP site.

鑒定的InDel位點為S0基因型的材料中, 粳性表型占91%, S-15基因型和S0S-15基因型材料中94.5%表現(xiàn)為糯性表型, 將基因型是否存在S-15突變與粳糯性表型結(jié)合進行R×C卡方檢驗, 皮爾遜卡方值為195.133,<0.001, 相關系數(shù)為0.924, 差異顯著, 表明無論雜合與否, 是否存在S-15突變基因型, 將成為導致材料胚乳淀粉質(zhì)地改變的重要條件。將-S基因上的InDel標記(RYW214)檢測的270份糜子基因型與粳糯表型數(shù)據(jù)結(jié)合, 發(fā)現(xiàn)標記結(jié)果與表型鑒定結(jié)果吻合度高達93.3%, 相關分析表明Pearson相關系數(shù)為0.745, 為極顯著水平, 說明該標記與淀粉粳糯性表型密切相關, 采用該標記可以很好的區(qū)分糜子粳糯表型, 特別是對于純合基因型的檢測準確率更高。

2.6 直鏈淀粉含量測定

現(xiàn)已知-S的突變型基因?qū)τ诿幼泳葱誀畹母淖兪谴_定的, 為研究S和L基因?qū)χ辨湹矸酆康呢暙I程度, 對46份不同基因型的糜子材料進行直鏈淀粉含量測定。各基因型糜子直鏈淀粉含量見表3。從表3可以看出, 46份糜子胚乳直鏈淀粉含量均值變化范圍為0.48%～16.28%, 直鏈淀粉含量均值最高的基因型為S0/LF, 最低的基因型為S-15/LF。就變異系數(shù)而言, S0S-15/LF的變異系數(shù)最高為70.87%。對各基因型直鏈淀粉含量均值多重比較結(jié)果見圖6。從圖6可以看出,-L基因上的不同等位基因?qū)χ辨湹矸塾绊懖淮? 由于試驗中不存在S-15/LC基因型, 不能在S-15的突變型背景下研究LC的功能。野生型S0直鏈淀粉含量較高, 存在突變基因型S-15的直鏈淀粉含量較低, 且純合的S-15基因型較雜合的S0S-15基因型直鏈淀粉含量更低。對基因型和直鏈淀粉含量進行相關性分析, 相關系數(shù)為0.873, 相關性顯著。

圖5 糜子粳糯性表型鑒定

A: 粳性; B: 糯性。

A:type; B:type.

表3 各基因型糜子直鏈淀粉含量

S-15和S0分別代表InDel位點15 bp缺失的有和無。LC: SNP位點無A替換G和插入堿基A; LY: SNP位點A替換G; LF: SNP位點插入堿基A。

S-15and S0indicate with and without 15 bp deletion at InDel site, respectively. LC: nucleotide base A substitution for G and no nucleotide base A insertion at SNP Site; LY: a substitution for G at SNP site; LF: nucleotide base A insertion at SNP site.

圖6 不同基因型糜子直鏈淀粉含量多重比較

不同小寫字母表示差異顯著性(< 0.05)。

Different lowercase letters indicate significant differences at< 0.05.

3 討論

作為異源四倍體作物, 糜子基因組中存在2個不同的位點。2018年, Wang等[33]對糜子基因片段進行擴增測序和序列比對, 將132份糜子材料進行分型, 發(fā)現(xiàn)了5種基因型, 其中基因型與表型對應的材料有125份, 未檢測到基因型為S-15/LC的中間表型材料。本試驗在Hunt等[31]的研究基礎上對基因的3個功能位點進行功能標記開發(fā), 并利用這些功能標記對270份山西省糜子種質(zhì)資源進行基因分型, 在S和L等位基因處鑒定了S0S-15、LY/LF等11種基因型, 也未檢測到S-15/LC材料, 與上述研究結(jié)果一致。自然狀態(tài)下, 基因型為S-15/LC的中間表型糜子材料缺乏, 究其原因, 一方面為地理隔離引起的相關基因重組概率減小導致, 另一方面可能為糜子自身不選擇該表型。微衛(wèi)星檢測結(jié)果表明糜子不同群體間存在基因流[27], 所以由地理因素導致部分糯性品種出現(xiàn)的可能性不大。就基因分型而言, Wang等[33]采用傳統(tǒng)測序方法進行, 操作繁瑣、費用高, 且雜合基因型難以區(qū)分, 而本研究基于功能標記檢測, 僅需一次巢式PCR和兩次常規(guī)PCR酶切反應即可準確分型, 操作簡便, 反應靈敏, 準確度高, 可明顯鑒定出雜合基因型(S0S-15、LY/LF)。Araki等[15]對來自歐亞大陸的178個糜子單株進行基因分型發(fā)現(xiàn), 在韓國和日本, 完全糯性表型大多是由S-15與LY結(jié)合所產(chǎn)生的(95.7%), 2015年, 劉曉歡[38]研究發(fā)現(xiàn)中國的完全糯性表型也可由S-15/LF基因型產(chǎn)生, 本研究發(fā)現(xiàn)S-15/LF基因型材料直鏈淀粉含量較其他基因型普遍偏低(0.48%), 進一步推測中國的完全糯性材料大多為S-15與LF結(jié)合產(chǎn)生。Hunt等[32]通過遺傳聚類分析發(fā)現(xiàn)LY在中國材料中低頻率存在, 本研究也發(fā)現(xiàn)270份山西糜子資源中, 純合LY基因型僅占14.4%, 與上述研究結(jié)果類似。

對不同基因型的46份材料進行直鏈淀粉含量測定, 通過對比不同基因型直鏈淀粉含量均值發(fā)現(xiàn), 不管基因-L是否具有活性, 基因型S0足以保證籽粒胚乳具有高的直鏈淀粉含量, 而一旦S0突變?yōu)镾-15, 直鏈淀粉含量大幅下降, 乃至不含直鏈淀粉,該變化在純合的基因型S-15材料中表現(xiàn)更明顯, 雜合基因型材料較純合S-15基因型直鏈淀粉含量稍高, 可能雜合基因型中S0仍具有功能, 負責合成少許直鏈淀粉。雖然粳糯性鑒定中絕大多數(shù)雜合基因型糜子均為糯性, 但是由于直鏈淀粉含量所占比例會影響到糯性口感, 因此S0S-15雜合體植株自交產(chǎn)生的純合S-15基因型完全糯性表型材料被強烈選擇下來。本試驗中未發(fā)現(xiàn)S-15/LC基因型, 不能在S基因失活背景下對野生型LC基因進行功能檢測, 從圖6可知, 無論在S0還是S-15背景下, L基因的突變等位基因?qū)χ辨湹矸鄣挠绊懚疾淮蟆?/p>

分子標記輔助育種目前已在水稻、小麥、玉米等大宗糧食作物中得到廣泛應用[39-43], 不同標記的開發(fā)技術(shù)不同?；诠δ芪稽c開發(fā)標記的方法包括3種, 基于大片段缺失或者部分序列插入/缺失導致的基因失活, 可以采用InDel位點常規(guī)PCR方法檢測片段長度差異[44-45]; 基于SNP位點開發(fā)的檢測技術(shù)主要有內(nèi)切酶酶切技術(shù)(SNP-CAPS)和等位基因特異性PCR (AS-PCR)技術(shù)[46-47]。毛艇等[40]基于水稻復等位基因上2個SNP位點, 利用tetra-primer ARMS-PCR的原理開發(fā)了PCR功能標記, 發(fā)現(xiàn)了PCR非特異延伸及凝膠電泳條帶差異難以區(qū)分等問題, 用引入錯配位點的方法解決了PCR過程中引物擴增效率低和非特異性延伸問題。本試驗在針對InDel位點設計功能標記時, 也發(fā)現(xiàn)上述類似問題, 我們通過使用嵌套引物、采用巢式PCR的方法解決非特異性延伸問題, 縮短了目標片段長度, 配合增加膠濃度、降低電源電壓方法將15 bp的片段差異區(qū)分開來。

4 結(jié)論

針對糜子基因設計了3個功能標記, 包括1個InDel標記(RYW214)和2個CAPS (RYW215、RYW216)標記, 其中RYW214標記分析基因型結(jié)果與表型鑒定結(jié)果吻合度高, 達93.3%, 可為糜子粳糯性鑒定提供有效的分子檢測工具。

致謝: 感謝美國內(nèi)布拉斯加大學林肯分校小宗糧豆研究與推廣中心(Panhandle Research & Extension Center, University of Nebraska-Lincoln) Dipak K. Santra 博士在論文修改中提供的幫助。

附表1 糜子材料來源

(續(xù)附表1)

*: 參與直鏈淀粉測定材料。*: the materials involved in amylose determination.

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Development and validation of functional markers ofgene in proso millet

DING Min1, DUAN Zheng-Yong1, WANG Yu-Zhuo1, XUE Ya-Peng1, WANG Hai-Gang2, CHEN Ling2, WANG Rui-Yun1,2,*, and QIAO Zhi-Jun2,*

1College of Agronomy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China;2Center for Agricultural Genetic Resources Research, Shanxi Agricultural University / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Genetic Improvement of Minor Crops, Taiyuan 030031, Shanxi, China

Functional molecular markers were designed based on nucleotide differences of known functional loci on(), a regulation gene for amylose synthesis in proso millet. Genotypes and phenotypes of 270 proso millet accessions from Shanxi province were tested and verified by combining phenotypes and genotypes. The amylose content of 46 proso millet accessions with different genotypes was determined to explore the genetic effect of this gene and evaluate its breeding value.gene of proso millet existed in two forms (L and S), targeting 15 bp on S type gene. A functional marker was designed for InDel (RYW214), which could effectively distinguish 126 bp, 141 bp, and heterozygous (126/141 bp) types. The consistency between the marker and phenotypic identification was 93.30%, and the Pearson correlation index () was 0.745. Two CAPS markers (RYW215, RYW216) were designed for a single nucleotide insertion site and a SNP site in the L-type gene. Among 270 accessions, genotype S-15/LFaccounted for the most (31.10%), S0/S-15/LFwas the second (22.96%),and S-15/LY/LFwas the least (0.74%). Genotype S-15/LCwas absent. Among 46 proso millet accessions, the genotypes with the highest mean amylose content were S0/LY/LF(15.50%) and S-15/LF(0.58%). The mutant alleles of L type gene had little effect on amylose content, and the existence of wild type S0was enough to guarantee amylose content in endosperm. The existence of mutant S-15would lead to a qualitative decline in amylose content, and the amylose content of heterozygous genotype S0S-15was slightly higher than that of homozygous genotype S-15.

proso millet;gene; functional molecular marker; amylose content

10.3724/SP.J.1006.2023.24028

本研究由財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項(CARS-06-14.5-A16), 山西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(雜糧)項目(2022-03), 國家自然科學基金項目(31271791)和山西省自然科學基金項目(201901D11126)資助。

This study was supported by the China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-06-14.5-A16), the Shanxi Agriculture Research System (Minor Grain Crop) (2022-03), the National Natural Science Foundation of China (31271791), and the Natural Science Foundation of Shanxi Province (201901D11126).

通信作者(Corresponding authors):王瑞云, E-mail: wry925@126.com; 喬治軍, E-mail: nkypzs@126.com

E-mail: yksin646@163.com

2022-01-22;

2022-06-07;

2022-07-07.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220706.1850.014.html

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