郝冉，崔阿圓，王麗鑫，張旺旺，史紅

中國西北偏西地區(qū)常年降水量少，相對濕度偏低，植被稀疏，沙漠廣布，干旱、半干旱是其主要的自然特征。有中醫(yī)學者[1]將此自然特征總結為“燥氣偏盛，燥發(fā)無時，非獨秋有”，并指出此燥（干旱、半干旱）不同于“因時而至”之秋燥（四季中秋季相對濕度偏低）。當防護不當或稟性不耐時，干旱、半干旱區(qū)特有的氣候環(huán)境因素可導致人體罹患“西北燥證”，即以口鼻、眼睛、咽喉、肌膚干燥、干咳、煩躁等不適癥狀為特征的一組中醫(yī)綜合證候，因其發(fā)生于西北地區(qū)，且以干燥癥狀為主，故稱之為“西北燥證”[2]。本研究前期以整體觀念為指導，在探索“燥邪傷肺”微觀機制之時，不僅觀察到鼻黏膜、氣道和肺組織的病理變化[3]，還觀察到干旱環(huán)境中健康大鼠淚腺腺泡的萎縮融合，腺體組織中β-防御素-2（β-defensins-2）的表達發(fā)生異常變化[4]。為此，本文通過初步篩選和分析淚腺中的差異表達蛋白（以下簡稱差異蛋白），以期找到“燥傷清竅”分子機制的候選靶標，為今后從急性眼表損傷相關指標（包括結膜杯狀細胞和瞼板腺功能等）出發(fā)探索“燥傷清竅”的機理提供有價值的線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8周齡SPF級雌性SD大鼠20只，體質量140～160 g，購自新疆醫(yī)科大學動物實驗中心[許可證號為SCXK（新）2018-0002]。本研究實驗動物及條件符合國家科學技術委員會的《實驗動物管理條例》相關規(guī)定，由新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準（倫理審批號：IACUC-20150225-102）。

1.2 試劑與儀器

二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒（中國碧云天生物技術有限公司，P0011），串聯(lián)質譜標簽（tandem mass tag，TMT）試劑盒、乙腈（美國Thermo Fisher Scientific 公司，WD330302、F22M6E20 1），三氟乙酸、碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇、尿素（美國Sigma-Aldrich公司，BCCD4553、WXBC8963V、SLCD4701、WXBD4821V），胰酶（美國Promega 公司，SRT220102），甲酸（美國Fluka公司，0172192381）。

改造后的程控智能人工氣候箱（上海德洋意邦儀器有限公司，PRX-1250B），砂塵試驗箱（常州市金壇博科實驗設備研究所，DSC-1000），蛋白電泳儀（上海天能科技有限公司，EPS-300），高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，1260），1200 納升級液相色譜儀、質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司，EasynLC 1200、Q Exactive HF-X）。

1.3 實驗室模擬干旱環(huán)境

基于氣象數(shù)據(jù)分析結果[5]，項目組建立了實驗室人工模擬干旱環(huán)境的具體方案[6]，并在前期動物實驗研究[3-4]中證實方案可行。具體模擬方法是人工氣候箱按時段設置溫度，每個時段為2 h，每日共12 個時段，代表子時（23:00～次日0:59）～亥時（21:00～22:59）。

在動物實驗的第1～6 d和第25～30 d 溫度范圍為6～24 ℃，在第7～12 d 和第31～36 d 溫度范圍為16～34 ℃，在第13～18 d和第37～42 d溫度范圍為10～30 ℃，在第19～24 d 和第43～48 d 溫度范圍為-8～6 ℃，日均溫差不低于18 ℃；設定相對濕度5%～45%，日均相對濕度為（24.33±11.29）%，風速3 m/s，光照強度5～20 LUX，遞增或遞減日照總時數(shù)以模擬春夏和秋冬的日照特點（表1）。設置砂塵試驗箱風速6～8 m/s，浮塵（粒徑＜10 μm，300 g/m3/次），吹塵時長20 min/次，2次吹塵間隔10 min，干預強度1 h/d。

表1 人工氣候箱模擬干旱風沙環(huán)境時溫度、濕度與光照度的設定

1.4 分組與處理

采用隨機數(shù)字表法，按照體質量將20只雌鼠分為2 組，其中對照組（control group，CG）飼喂在常溫（20.5～21.5 ℃）常濕（相對濕度50%～55%）環(huán)境；干旱風沙組（dryness &sand dust group，DD）飼養(yǎng)在人工氣候箱和砂塵試驗箱模擬的干旱風沙環(huán)境中48 d（即人工燥邪的1 個氣候周期），實驗結束后大鼠禁食不禁水12 h，麻醉后腹主動脈采血，摘取大鼠左側淚腺組織，使用0.9%氯化鈉注射液清洗3 遍，裝于凍存管中，迅速放入液氮后轉移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.5 測試分析

提取淚腺組織蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。胰酶將蛋白酶分解成肽段，TMT 標記肽段。高效液相色譜法對標記的肽段分級。EASY-nLC 1200超高效液相系統(tǒng)流動相A（0.1%甲酸和2%乙腈水溶液）和流動相B（0.1%甲酸和90%乙腈水溶液）對分級后的肽段分離，分離后的肽段被注入電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）中進行電離，Q Exactive HF-X 質譜進行分析。高分辨的軌道離子阱（Orbitrap）檢測和分析肽段母離子及其二級碎片。用數(shù)據(jù)依賴型掃描（data-dependent acquisition，DDA）程序采集數(shù)據(jù)。Maxquant（v1.5.2.8）檢索二級質譜數(shù)據(jù)。

1.6 差異蛋白的篩選和統(tǒng)計學方法

每個樣本重復3 次全蛋白定量測試，分別采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、相對標準差（relative standard deviation，RSD）和Pearson 相關性分析評估蛋白定量重復性。計算出每個樣本在多次全蛋白定量重復實驗中定量值的平均值，再計算2個樣本之間平均值的比值，該比值是比較組最終的差異表達量（即相對定量）。將各樣本中某蛋白的相對定量值進行l(wèi)og2 對數(shù)轉換，以使數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，用組間雙尾t檢驗的方法計算P值。當P＜0.05 時，以差異倍數(shù)≥1.2 作為顯著上調的變化閾值，差異倍數(shù)＜1/1.2 作為顯著下調的變化閾值。

1.7 差異蛋白的生物信息分析

UniProt-GOA 和InterProScan數(shù)據(jù)庫對鑒定出的差異蛋白進行基因本論（gene ontology，GO）分析，從細胞組成、分子功能及生物過程3個方面對差異蛋白進行GO 功能注釋和富集。京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進行通路富集分析：使用KEGG在線服務工具（KEGG Automatic Annotation Server，KAAS）對差異蛋白進行注釋后，通過KEGG mapper將注釋后的蛋白與數(shù)據(jù)庫中相應的通路匹配。

2 結果

2.1 DD組大鼠淚腺中的差異蛋白

經(jīng)技術重復后樣本的蛋白定量結果符合統(tǒng)計學上的一致性。篩選出DD組差異蛋白共計505個，表達上調和下調的蛋白分別有210 個和295 個（圖1）。本研究DD 組淚腺中的部分差異蛋白如表所示（表2）。

表2 干旱風沙組大鼠淚腺中的差異蛋白

圖1 干旱風沙組大鼠淚腺中的差異蛋白定量重復性檢驗的統(tǒng)計圖

2.2 DD組大鼠淚腺中差異蛋白GO功能注釋結果

DD 組大鼠淚腺中上調和下調差異蛋白數(shù)位居前2 位的生物進程均是細胞過程和單生物過程，其主要上調差異蛋白是S100 鈣結合蛋白A9（S100 calbindin A9，S100A9）和免疫球蛋白γ-2A 鏈C 區(qū)（Ig gamma-2A chain C region,IgG2a）。上調和下調蛋白數(shù)位居前2 位的細胞組成是細胞和細胞器，主要上調差異蛋白均有S100A9。此外，細胞中還有IgG2a，細胞器中有三磷腺苷合酶抑制因子1。上調和下調蛋白數(shù)位居前2位的分子功能是結合和催化活性，其中結合功能中主要上調差異蛋白是S100A9和免疫球蛋白γ-2A鏈C區(qū)，催化活性功能中主要上調差異蛋白有E3 泛素蛋白連接酶和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）（圖2）。

圖2 差異蛋白GO二級分類統(tǒng)計圖

2.3 DD組大鼠淚腺中差異蛋白GO功能富集結果

DD 組大鼠淚腺中上調差異蛋白在生物進程方面主要富集在其他生物體的防御反應（IgG2a）、質膜內陷（IgG2a）、對細菌的防御反應、吞噬作用（IgG2a）和B 細胞介導免疫（IgG2a）。在分子功能方面則是免疫球蛋白受體結合和蛋白質二硫鍵異構酶活性。在細胞組成方面為細胞外間隙、循環(huán)免疫球蛋白復合物和免疫球蛋白復合物。在生物進程方面下調差異表達蛋白主要富集在橫紋肌收縮、氫傳輸、膠原原纖維組織和單價無機陽離子轉運。分子功能方面則富集在肌動蛋白絲結合、細胞外基質結構成分和肌動蛋白結合方面。細胞組成方面富集在收縮纖維、收縮纖維部分、橫紋肌細絲和肌絲方面（圖3）。

圖3 差異蛋白GO功能富集

2.4 DD 組大鼠淚腺中差異蛋白的KEGG 通路富集結果

DD 組大鼠淚腺中上調差異蛋白主要富集在抗原加工呈遞、哮喘等相關通路（圖4A、圖5）；下調差異蛋白主要富集在氧化磷酸化、帕金森病、蛋白質消化和吸收等通路（圖4B）。

圖4 差異蛋白的KEGG通路富集

圖5 上調差異蛋白富集的主要信號通路

3 討論

《素問·陰陽應象大論》[7]曰：“燥勝則干”，指出燥邪易傷津液，導致機體出現(xiàn)干澀、堅斂之變。燥易傷肺，肺失宣肅，清竅失養(yǎng)則可癥見目、口鼻、咽喉干燥，干咳，大便干燥，小便短赤等“外燥”之象。干旱、半干旱區(qū)“燥氣偏盛”，防護不當或體質異稟時，特有的環(huán)境因素可作為危險因素導致機體處于亞健康狀態(tài)[2]，抑或誘發(fā)疾病的發(fā)生。如趙孝國等[8]的研究證實，干旱風沙環(huán)境作為誘因可致口舌、目鼻、咽喉等暴露性器官“干澀”不適，甚則病發(fā)急慢性結膜炎等。周銘心等[2]將“眼干”“眼癢”“目眵多”等眼部癥狀作為辨識西北燥證主證（又稱肺衛(wèi)孔竅皮膚燥證）的主要依據(jù)之一，故本文從“外燥”影響“眼部外候”探索“燥傷清竅”的機理。

淚膜覆蓋于眼前表面，從表到里依次為脂質層、水液層（由淚腺和副淚腺分泌）、黏液層，是眼表的保護層，其穩(wěn)態(tài)與眼表健康密切相關[9]。淚液屬人體津液[10]，也是淚膜的重要組分。結合干旱環(huán)境中健康大鼠外周血CD4+/CD8+值異常升高[11]，淚腺腺體萎縮[4]等研究結果，本研究著眼于炎癥反應、變態(tài)反應和細胞凋分析差異蛋白，并初步選定探索外燥證“燥傷清竅”機制的候選靶標。

S100A9 常與S100 鈣結合蛋白A8 形成異源二聚體，激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）通路，誘導炎癥反應[12]，也能刺激白細胞募集和細胞因子分泌而調節(jié)炎癥反應。α-1-酸性糖蛋白（alpha-1-acid glycoprotein，AGP1）在炎癥或感染時，可通過調節(jié)細胞因子白細胞介素-1和白細胞介素-6 參與免疫調節(jié)。S100A9 和AGP1 均被證實為干眼淚液中的生物標志物[13]，故S100A9 和AGP1 是較為理想的眼表炎癥反應相關的候選靶標。

其次，趨化因子C-X3-C 基元配體1（chemokine C-X3-C motif ligand 1，CX3CL1）可誘導白細胞黏附與遷徙，趨化B 細胞和T 細胞，調控炎癥進程并引發(fā)免疫損傷，其表達與干眼癥狀的嚴重程度正相關[14]。而存在于中性粒細胞和單核細胞中的MPO 則可利用過氧化氫形成具有氧化能力的自由基，進而參與機體的氧化應激[15]，導致眼表組織損傷。下調蛋白泛醇-細胞色素C 還原酶鉸鏈蛋白（ubiquinolcytochrome c reductase hinge protein，UQCRH）則能通過減少氧化損傷調節(jié)線粒體功能，從而對抗慢性疾病中的氧化應激反應[16]。在本研究中UQCRH 表達水平降低，UQCRH 抗氧化損傷的功能減弱，可能會減輕對抗眼表的氧化應激反應的作用，從而產(chǎn)生干眼癥狀。MPO 和UQCRH 均參與機體氧化應激反應，而氧化應激反應對眼表上皮有直接的促炎作用，能引發(fā)二次免疫反應，從而加劇眼表損傷[17]。因此，CX3CL1、MPO 和UQCRH 蛋白也可作為眼表炎癥反應相關的候選靶標。

T-激肽原1（T-kininogen 1，KNT1）在激肽釋放酶作用下可以生成激肽，激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)所有成分都存在于眼中并參與調節(jié)眼部血流量，炎癥急性期時KNT1 表達增加表達增加。蛋白酶體亞基β-8（proteasome subunit β type-8，PSMB8）為免疫蛋白酶體，是炎癥反應的重要成分和調節(jié)劑，在內源性抗原加工呈遞中起關鍵作用，抗原加工呈遞對適應性免疫至關重要。下調蛋白血清轉鐵蛋白（serotransferrin，TF）在細胞內外鐵離子代謝平衡中發(fā)揮重要作用，具有抗微生物的功能，與細胞的生長分化和細胞保護功能有關，是眼表天然的免疫系統(tǒng)。TF在干眼初期水平降低，其對眼表的保護作用減弱，同時導致淚液中鐵離子失平衡而損傷細胞[18]，因此TF 的下調提示DD 組大鼠可能出現(xiàn)干眼癥狀。故KNT1、PSMB8、TF 可作為眼表炎癥反應相關的候選靶標。

差異蛋白前列腺素D 合酶（prostaglandin D synthase，PGDS）可催化前列腺素H2（prostaglandin H2，PGH2）使其轉化為前列腺素D2（prostaglandin D2，PGD2），后者是誘導過敏反應和炎癥反應的重要介質。IgG2a 是免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）的一個亞型，與IgG Fc 段受體（Fc gamma R，F(xiàn)cγR）結合可誘導全身性過敏反應。研究[2]證實，罹患西北燥證（尤指肺衛(wèi)孔竅皮膚燥證）者過敏性鼻炎發(fā)病率高于未罹患西北燥證者。過敏性鼻炎表現(xiàn)為鼻癢、噴嚏、鼻分泌亢進、鼻黏膜腫脹等癥狀，常伴眼癢或眼干，故推測PGDS和IgG可作為與眼表過敏反應相關的主要候選靶標。

差異蛋白熱休克蛋白27（heat shock protein 27，HSP27）、酪蛋白激酶Ⅱα'亞基（casein kinase 2 alpha 2，CSNK2A2）、泛素羧基末端水解酶L3（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L3，UCHL3）和S100A9均是與眼表細胞凋亡相關的候選靶標。HSP27為在應激反應中被高度誘導的蛋白之一，可通過與含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）和細胞色素C（cytochrome C，Cytc）結合，使Caspase級聯(lián)失活，從而阻止細胞凋亡，HSP27 的上調提示淚腺細胞凋亡可能存在異常增強的趨勢。下調蛋白CSNK2A2是酪蛋白激酶Ⅱ（casein kinase II，CK2）的催化亞基，可磷酸化多種底物，調節(jié)細胞周期進程、細胞凋亡和轉錄等細胞過程。CSNK2A2 能促進細胞增殖和抑制細胞凋亡。CSNK2A2 在許多腫瘤細胞中呈高表達，抑制腫瘤細胞凋亡[19]。下調蛋白UCHL3 屬于去泛素化酶（deubiquitinases，DUBs）中泛素羧基末端水解酶（ubiquitin terminal hydrolase，UCHs）家族，從蛋白質底物中去除泛素，保護蛋白質免于降解，并且釋放游離泛素參與循環(huán)泛素化反應，能夠調節(jié)細胞過程，例如細胞生長、分化、發(fā)育和凋亡等。泛素化是調節(jié)細胞凋亡的途徑，許多凋亡因子通過泛素化調節(jié)細胞凋亡。有研究[20]表明，UCHL3水平降低導致細胞中的促凋亡因子P53 蛋白、B 淋巴細胞瘤-2 相關X 蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、Caspase-3 增加，從而促進細胞凋亡。在本研究中，CSNK2A2 和UCHL3 呈低表達，可以促進淚腺細胞凋亡，與DD 組大鼠淚腺組織病理表現(xiàn)淚腺細胞萎縮相印證。此外，S100A8/S100A9 可改變促凋亡和抗凋亡蛋白間的平衡誘導細胞凋亡。故HSP27、S100A9、CSNK2A2 和UCHL3 和可以作為淚腺凋亡的候選靶標。

綜上所述，S100A9、AGP1、CX3CL1、MPO、UQCRH、KNT1、PSMB8、PGDS、IgG、HSP27、TF、CSNK2A2 和UCHL3 等候選靶標的驗證結果可用于從炎癥反應、過敏反應和細胞凋亡的角度，選擇有價值的信號通路從眼部癥狀探索“燥傷清竅”的機理。此外，本研究基于蛋白表達對“燥傷清竅”的機制進行了初步探索，目的在于挖掘燥邪損傷機體的微觀機制，故目前研究尚未涉及動物模型的建立與評價，也未能就燥邪干預下眼表急性損傷機制、共患疾病對眼表微環(huán)境中炎性因子或凋亡因子水平，及雌激素水平與淚腺分泌及蛋白表達的相關性等進行更深入研究，故所獲研究結論僅具導向性價值。