林瑩 戴晨逸 蘇婷卉 應(yīng)航 徐飛

噪聲暴露是聽力下降和聽覺外周受損的最常見原因之一[1]，有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)強(qiáng)噪聲短暫暴露引起暫時(shí)性閾移的發(fā)育早期動(dòng)物，雖然其成年后的聽閾正常，但在強(qiáng)度感知和時(shí)域處理等閾上聽覺處理方面表現(xiàn)異常[2]。這提示聽覺中樞的發(fā)育成熟是一個(gè)可塑性過程，在很大程度上依賴于外周為其提供的輸入性刺激，強(qiáng)噪聲暴露可能作為異常輸入導(dǎo)致了聽覺中樞的可塑性改變。這種影響不僅限于高強(qiáng)度噪聲，孫偉等[3]發(fā)現(xiàn)對(duì)發(fā)育期大鼠進(jìn)行70 dB SPL噪聲長(zhǎng)時(shí)暴露，會(huì)導(dǎo)致其聽覺皮層發(fā)育遲緩，并引起其成年后的時(shí)域處理敏銳度低下。

近幾年，陸續(xù)有學(xué)者開展長(zhǎng)時(shí)低、中等強(qiáng)度噪聲暴露對(duì)幼年動(dòng)物的危害研究，發(fā)現(xiàn)上述中等強(qiáng)度噪聲暴露會(huì)使內(nèi)側(cè)膝狀體和下丘等中樞部位出現(xiàn)適應(yīng)性變化[4,5]，但目前尚缺乏這類噪聲在幼年期長(zhǎng)時(shí)暴露對(duì)中樞影響的研究。由于聽覺中樞各級(jí)水平之間存在多重聯(lián)系，具有明顯的整體性，因此本研究采用聽性腦干反應(yīng)(ABR)和聽覺驚跳反射(ascoutic startle reflex，ASR)這兩項(xiàng)分別反映聽覺整體功能的電生理與反射性行為測(cè)試來探究聽覺中樞反應(yīng)與響度感知表現(xiàn)之間的關(guān)系；并通過噪聲間隙聽性腦干反應(yīng)(GIN-ABR)測(cè)試評(píng)估動(dòng)物聽覺時(shí)域處理能力，進(jìn)一步探討幼年期長(zhǎng)時(shí)、非損傷性噪聲暴露對(duì)聽覺中樞功能的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取健康幼年(3周齡)雄性白色紅目豚鼠10只，體重150～180 g，無(wú)外耳、中耳疾病，耳廓反射正常，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供，隨機(jī)分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組5只。

1.2噪聲暴露方法 對(duì)照組在正常安靜環(huán)境(<30 dB SPL)下飼養(yǎng)至7周齡，實(shí)驗(yàn)組給予85 dB SPL白噪聲(20 Hz～20 kHz)暴露，每日12小時(shí)，連續(xù)暴露4周，暴露時(shí)間為晚上9點(diǎn)至第2天上午9點(diǎn)，暴露期間豚鼠可在籠中自由活動(dòng)。揚(yáng)聲器置于鼠籠正上方，一個(gè)籠子有4格，每次可對(duì) 4只豚鼠進(jìn)行暴露。聲強(qiáng)校準(zhǔn)借助AWA6228+型多功能聲級(jí)計(jì)進(jìn)行，鼠籠內(nèi)各部位聲強(qiáng)變化不超過1 dB。暴露后豚鼠置于正常安靜環(huán)境下喂養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)。

1.3聽功能測(cè)試 實(shí)驗(yàn)組在噪聲暴露結(jié)束當(dāng)日和結(jié)束后2周進(jìn)行測(cè)試;對(duì)照組于7周齡進(jìn)行1次測(cè)試。

1.3.1聽覺電生理測(cè)試 測(cè)試在隔聲屏蔽箱中進(jìn)行，采用TDT System 3和BioSigRZ測(cè)聽軟件進(jìn)行閉合聲場(chǎng)給聲、記錄，測(cè)試前對(duì)豚鼠使用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，待麻醉狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試過程中維持動(dòng)物體溫(37℃)。

通過DPOAE測(cè)試評(píng)估外毛細(xì)胞功能，測(cè)試頻率為6、8、12、16 kHz，兩個(gè)刺激原始音頻率關(guān)系為f2/f1=1.2，固定強(qiáng)度關(guān)系為L(zhǎng)1=L2=65 dB SPL，記錄DPOAE幅值，2f1-f2幅值高于本底噪聲6 dB時(shí)即為引出DPOAE。

通過ABR測(cè)試評(píng)估聽覺中樞(聽神經(jīng)到丘腦水平聽覺神經(jīng)系統(tǒng))的聽反應(yīng)[6]，記錄電極置于豚鼠兩側(cè)耳廓前緣連線中點(diǎn)皮下，參考、接地電極置于測(cè)試耳、非測(cè)試耳耳后皮下，極間電阻小于1 kΩ。刺激聲為6、8、12、16 kHz短純音(時(shí)程10 ms，上升/下降時(shí)間0.5 ms)，刺激速率為11.1次/秒，掃描時(shí)間10 ms，疊加512次，帶通濾波500～3 000 Hz，50 Hz陷波防止交流電干擾，以能分辨出可重復(fù)的ABR波Ⅲ的最低刺激聲強(qiáng)度為閾值，并記錄刺激聲強(qiáng)度為80 dB SPL時(shí)ABR波Ⅰ潛伏期、幅值及波Ⅳ的幅值。

通過GIN-ABR測(cè)試評(píng)估時(shí)域處理能力[7]，電極放置同ABR測(cè)試，刺激聲為80 dB SPL寬帶噪聲(WBN)和無(wú)聲間隙(Gap)組成的脈沖串，兩個(gè)WBN(NB1、NB2)間嵌入一個(gè)Gap，共7種脈沖串(Gap為0、1、2、4、8、16、32 ms)，WBN持續(xù)時(shí)間為25 ms，上升、下降時(shí)間為0.5 ms，刺激速率為3.3次/秒，記錄疊加200次，掃描時(shí)間為200 ms，記錄由NB2觸發(fā)的ABR波Ⅰ、波Ⅳ幅值。

1.3.2聽覺行為測(cè)試 通過ASR測(cè)試評(píng)估動(dòng)物的響度感知，ASR指動(dòng)物對(duì)突然的高強(qiáng)度聲刺激產(chǎn)生的防御性行為反射(面、頸部和肢體骨骼肌的運(yùn)動(dòng))[8]，可通過重力傳感器記錄反射運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度來評(píng)估。采用行為測(cè)試系統(tǒng)Panlab和軟件Packwin2.0進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試方法：開始前豚鼠在測(cè)試箱中安靜習(xí)服3分鐘，測(cè)試共5種路徑，分別為不含驚跳刺激聲的基線路徑和4種強(qiáng)度(70、80、90、100 dB SPL)的驚跳刺激(白噪聲，時(shí)程40 ms)試驗(yàn)路徑(圖1)，每種路徑重復(fù)10次(共50次)，以偽隨機(jī)順序出現(xiàn)，相鄰兩次刺激之間的間隔在7～15 s之間隨機(jī)變化，以防動(dòng)物對(duì)刺激產(chǎn)生適應(yīng)。每種路徑10次驚跳反射的平均值，即為對(duì)應(yīng)強(qiáng)度下的ASR幅值(儀器默認(rèn)單位為%)。

圖1 ASR測(cè)試信號(hào)模式圖

2 結(jié)果

2.1DPOAE測(cè)試結(jié)果 如表1所示，噪聲暴露結(jié)束當(dāng)日，實(shí)驗(yàn)組豚鼠6、8 kHz的DPOAE幅值與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，12 kHz的DPOAE幅值小于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.068)，16 kHz的DPOAE幅值顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，于暴露結(jié)束后2周恢復(fù)至與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2ABR測(cè)試結(jié)果 噪聲暴露結(jié)束當(dāng)日，實(shí)驗(yàn)組豚鼠在6、8 kHz的ABR閾值與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，12(P<0.05)、16 kHz(P<0.01)的ABR閾值顯著高于對(duì)照組，但于暴露結(jié)束后2周恢復(fù)，與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。暴露結(jié)束當(dāng)日實(shí)驗(yàn)組豚鼠各頻率80 dB SPL刺激聲的ABR波Ⅰ潛伏期、幅值與對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3、4)；暴露結(jié)束當(dāng)日，實(shí)驗(yàn)組豚鼠在6(P<0.05)、8 kHz(P<0.01)(強(qiáng)度為80 dB SPL)的ABR波Ⅳ幅值顯著降低，暴露結(jié)束后2周仍與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表5)。

2.3GIN-ABR測(cè)試結(jié)果 兩組在Gap為0、1 ms脈沖串刺激下均未引出ABR波形。噪聲暴露結(jié)束當(dāng)日與對(duì)照組的比較，t2值為實(shí)驗(yàn)組暴露結(jié)束后2周與對(duì)照組的比較; *P<0.05，**P<0.01; 余表相同當(dāng)日，實(shí)驗(yàn)組豚鼠在8、32 ms間隙的GIN-ABR波Ⅰ幅值顯著降低(P<0.05)，暴露結(jié)束后2周恢復(fù)，與對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表6)；暴露結(jié)束當(dāng)日，實(shí)驗(yàn)組豚鼠各間隙的GIN-ABR波Ⅳ幅值均顯著降低(2 ms，P<0.05；4、8、16、32 ms,P<0.01)，暴露結(jié)束后2周，4 ms間隙的波Ⅳ幅值仍顯著小于對(duì)照組(P<0.05)(表7)。

表1 各組各頻率DPOAE幅值

表2 各組各頻率tb-ABR閾值

表3 各組各頻率tb-ABR波Ⅰ潛伏期

表4 各組各頻率tb-ABR波Ⅰ幅值

表5 各組各頻率tb-ABR波Ⅳ幅值

表6 各組各時(shí)程間隙GIN-ABR波Ⅰ幅值

表7 各組各時(shí)程間隙GIN-ABR波Ⅳ幅值

2.4聽覺行為測(cè)試結(jié)果 表8為ASR測(cè)試結(jié)果，噪聲暴露結(jié)束當(dāng)日，實(shí)驗(yàn)組豚鼠在各強(qiáng)度刺激聲的驚跳程度和對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；暴露結(jié)束后2周，實(shí)驗(yàn)組豚鼠的驚跳程度與對(duì)照組相比仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但對(duì)于100 dB SPL刺激聲，實(shí)驗(yàn)組豚鼠的驚跳反射有減弱趨勢(shì)。

表8 各組各強(qiáng)度驚跳刺激聲ASR幅值

3 討論

聽敏度通常借助DPOAE、ABR等電生理測(cè)試進(jìn)行評(píng)估，相較于可損傷耳蝸毛細(xì)胞導(dǎo)致永久性聽力損失的高強(qiáng)度噪聲暴露，較低劑量的噪聲暴露僅引起暫時(shí)性閾移(無(wú)毛細(xì)胞丟失)[9]，因此,在聽敏度評(píng)估時(shí)極具隱匿性。本實(shí)驗(yàn)中，暴露結(jié)束后2周，實(shí)驗(yàn)組12、16 kHz的DPOAE幅值及ABR閾值顯著恢復(fù)，很好地驗(yàn)證了非損傷性噪聲暴露的后果——暫時(shí)性閾移，說明85 dB SPL白噪聲暴露對(duì)該頻段外毛細(xì)胞功能的損害是可恢復(fù)的。有研究表明可引起暫時(shí)性閾移的中等強(qiáng)度噪聲暴露雖不會(huì)損傷外毛細(xì)胞，但是會(huì)導(dǎo)致耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的不可逆減少，并伴有波Ⅰ振幅下降[10]。本研究實(shí)驗(yàn)組的暫時(shí)性閾移僅發(fā)生在12、16 kHz，可能與耳蝸的聲音傳遞部位編碼機(jī)制有關(guān),即：雖然白噪聲(20 Hz～20 kHz)會(huì)造成基底膜各部位的振動(dòng)，但由于行波在基底膜上的傳播都經(jīng)過耳蝸底部，這里是耳蝸內(nèi)液體脈沖波的集中作用點(diǎn)，承受著較大而頻繁的聲負(fù)荷，因此,蝸底(感受高頻區(qū))比蝸頂(感受低頻區(qū))更易受到聲創(chuàng)傷。文中實(shí)驗(yàn)組各頻段(強(qiáng)度為80 dB SPL)的ABR波Ⅰ幅值僅略低于對(duì)照組，且波Ⅰ潛伏期與對(duì)照組無(wú)顯著差異，表明外周聽功能未受到顯著傷害，但也不排除暴露頻寬外頻段的ABR波Ⅰ幅值降低的可能[11]。

關(guān)于長(zhǎng)時(shí)中等強(qiáng)度噪聲暴露對(duì)聽覺中樞的可塑性影響，在明確沒有聽力損失的基礎(chǔ)上，需要對(duì)聽覺中樞功能進(jìn)行評(píng)估。ABR能反映聽覺上行傳導(dǎo)通路不同水平神經(jīng)元的同步放電，是衡量整體聽覺中樞系統(tǒng)不同水平輸入輸出增益變化的重要工具。在嚙齒動(dòng)物模型中，ABR波Ⅳ等同于人類的波Ⅴ，通常認(rèn)為波Ⅳ來源于外側(cè)丘系/下丘附近。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組6、8 kHz的DPOAE幅值、ABR閾值及波Ⅰ幅值與對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明噪聲暴露未損害實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物該頻段的外周聽覺功能，而實(shí)驗(yàn)組在6、8 kHz(強(qiáng)度為80 dB SPL)的ABR波Ⅳ幅值顯著降低，與Sheppard等[12]的發(fā)現(xiàn)一致，該現(xiàn)象被稱為負(fù)向中樞增益，指在中、低強(qiáng)度噪聲暴露未改變外周聽覺功能的前提下，外側(cè)丘系/下丘的聽反應(yīng)活動(dòng)在特定頻率出現(xiàn)減弱。這與高強(qiáng)度噪聲暴露的中樞可塑性后果相悖，如100 dB SPL噪聲暴露會(huì)起引動(dòng)物外周聽覺的損傷，從而聽覺中樞會(huì)因外周輸入的減少而代償性增強(qiáng)神經(jīng)活動(dòng)，即中樞代償增益彌補(bǔ)外周損失以恢復(fù)部分聽功能[13,14]，可見，無(wú)論噪聲暴露是否引起損傷都會(huì)導(dǎo)致一定的中樞可塑性后果。本實(shí)驗(yàn)中的較低強(qiáng)度噪聲刺激的持續(xù)輸入導(dǎo)致動(dòng)物聽覺中樞對(duì)噪聲環(huán)境產(chǎn)生了適應(yīng)，這種可塑性變化可能與治療聽覺過敏的低級(jí)聲療法有關(guān)。

聽覺驚跳反射通路由聽神經(jīng)、耳蝸腹側(cè)核、外側(cè)丘系、腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元等組成[15]，有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)強(qiáng)噪聲短時(shí)暴露的幼年大鼠成年后聽覺反應(yīng)正常，但對(duì)高強(qiáng)度白噪聲的ASR幅度顯著降低，因未成熟的聽覺系統(tǒng)通常表現(xiàn)出較低的興奮性，提示了噪聲誘發(fā)的聽覺發(fā)育不良后果[16]。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組噪聲暴露結(jié)束當(dāng)日的聽覺驚跳程度與對(duì)照組無(wú)差異，暴露結(jié)束后2周ABR反應(yīng)閾恢復(fù)，同時(shí)其對(duì)100 dB SPL刺激聲的驚跳程度有減弱趨勢(shì)，表明85 dB SPL白噪聲暴露對(duì)發(fā)育期聽覺中樞的影響是一個(gè)漸進(jìn)過程，可能提示了中等強(qiáng)度噪聲長(zhǎng)期暴露對(duì)中樞可塑性的影響。Rybalko等[17]發(fā)現(xiàn)經(jīng)噪聲暴露處理的幼年動(dòng)物聽覺驚跳程度異常增加，雖然驚跳程度的變化具有年齡依賴性和頻率依賴性，但其成年后的驚跳程度顯著低于對(duì)照組，表明噪聲暴露導(dǎo)致的發(fā)育障礙包括了復(fù)雜的適應(yīng)性和代償性變化，與成年動(dòng)物的暴露后果不同。

Amanipour等[7]曾將GIN-ABR測(cè)試應(yīng)用于強(qiáng)噪聲暴露動(dòng)物的聽覺評(píng)估中，發(fā)現(xiàn)噪聲暴露會(huì)損害動(dòng)物的時(shí)域處理能力。GIN-ABR刺激聲由兩個(gè)WBN(NB1、NB2)間嵌入一個(gè)無(wú)聲間隙(Gap)組成，每次給聲聽覺系統(tǒng)需要從NB1恢復(fù)以便有效地處理NB2，因此NB2觸發(fā)的ABR波形分化可反映聽覺腦干處理無(wú)聲間隙的能力。本研究發(fā)現(xiàn)Gap的時(shí)程越長(zhǎng)，總體上NB2觸發(fā)的ABR波幅越高，能引出NB2完整ABR波形的間隙均大于2 ms。動(dòng)物因聽覺中樞退化引起的聽覺時(shí)域處理異?？赏ㄟ^NB2波Ⅰ、Ⅳ幅值來評(píng)估，本研究分析了NB2觸發(fā)的ABR波Ⅰ、Ⅳ幅值，暴露結(jié)束后2周，實(shí)驗(yàn)組在各頻段反應(yīng)閾恢復(fù)的基礎(chǔ)上，4 ms間隙的ABR波Ⅳ幅值并未恢復(fù)，ABR反應(yīng)幅值降低正是腦干神經(jīng)回路興奮性降低的表現(xiàn)，推測(cè)是噪聲暴露干擾了中樞的自然可塑性發(fā)育過程。Williamson等[18]曾提出，機(jī)體老化帶來的聽覺時(shí)間編碼困難，除了耳蝸、蝸神經(jīng)損傷等外周處理問題外，還與聽覺中樞的神經(jīng)缺陷有關(guān)，因此,推測(cè)中等強(qiáng)度噪聲暴露對(duì)聽覺中樞的影響與機(jī)體老化機(jī)制類似，但因?yàn)橛啄陚€(gè)體的聽覺中樞仍處于發(fā)育階段，導(dǎo)致聽覺中樞的神經(jīng)編碼能力發(fā)生了復(fù)雜的漸進(jìn)性變化。這也提示閾上聽功能測(cè)試更有助于發(fā)現(xiàn)噪聲暴露的隱匿性危害?？梢?閾上聽功能測(cè)試對(duì)噪聲性隱匿性聽力損失的評(píng)估至關(guān)重要，希望將來可以結(jié)合形態(tài)學(xué)分析和更多行為學(xué)分析，來探究中、低強(qiáng)度噪聲暴露對(duì)聽覺通路的系統(tǒng)性影響。

綜上所述，本研究中實(shí)驗(yàn)組幼年豚鼠的高頻聽力產(chǎn)生暫時(shí)性閾移(于暴露結(jié)束后2周恢復(fù))，但ABR的波I幅值未發(fā)生顯著變化，根據(jù)Kujawa等[11]的研究，這不符合突觸損傷的隱性聽力損失表現(xiàn)，因此推測(cè)本研究實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的耳蝸毛細(xì)胞及其突觸形態(tài)可能無(wú)顯著改變，并在此基礎(chǔ)上對(duì)聽覺中樞的可塑性變化展開探究。當(dāng)然，也不完全排除ABR波I振幅與毛細(xì)胞突觸損失不一致的結(jié)果。希望今后能專門針對(duì)這一問題進(jìn)行研究，為綜合評(píng)估中、低強(qiáng)度噪聲暴露對(duì)聽覺中樞可塑性的隱匿影響提供參考。