陳維萍，蘇丹穎

0 引言

缺血性腦卒中(Ischemic stroke，IS)是腦動脈血液突然阻斷導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損性疾病。緊急恢復(fù)血流是目前最有效的治療措施，但是，全球范圍能接受靜脈溶栓的患者不到5%，能接受血管內(nèi)介入治療的患者人數(shù)不超過十萬[1]，絕大多數(shù)患者接受的治療方案為抗血小板、抗凝、調(diào)脂、神經(jīng)保護和康復(fù)訓(xùn)練等綜合治療[2]。IS復(fù)發(fā)率、致殘率、死亡率居高不下，因此迫切需要新的治療策略。黃連素又名小檗堿，是廣泛存在于黃連、黃柏、小檗等中草藥的天然生物堿，目前臨床上應(yīng)用其鹽酸鹽作為治療腸道感染的非處方藥，不良反應(yīng)小[3]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的藥理作用，并已經(jīng)開展大量治療疾病的臨床隨機對照試驗，如用于治療IS、2型糖尿病、多囊卵巢綜合征、高脂血癥、動脈粥樣硬化和癌癥等[4]。黃連素口服生物利用度低，這限制了其臨床應(yīng)用，但已經(jīng)出現(xiàn)許多提高其生物利用度的醫(yī)藥技術(shù)[5]。目前已有一些關(guān)于黃連素干預(yù)IS的研究發(fā)現(xiàn)其作用機制復(fù)雜，且各研究之間的作用機制存在重復(fù)性，因此，需要總結(jié)黃連素治療IS的作用機制。本文將從抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡、抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、促進(jìn)血管新生、表觀遺傳修飾、保護血腦屏障等方面對黃連素治療IS的作用機制進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步的機制研究和臨床應(yīng)用提供思路。

1 抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡

神經(jīng)細(xì)胞死亡是IS的重要病理機制，存在于腦血流阻斷和血流再灌注之后，是損傷直接破壞或啟動胞內(nèi)死亡程序的結(jié)果，存在著多種形式的細(xì)胞死亡方式，包括非程序性壞死和程序性細(xì)胞死亡，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡、鐵死亡、壞死性凋亡和自噬依賴性細(xì)胞死亡等[6]。壞死無法逆轉(zhuǎn)，而程序性細(xì)胞死亡在一定程度上可以逆轉(zhuǎn)，缺血半暗帶區(qū)主要出現(xiàn)程序性細(xì)胞死亡，抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡是挽救缺血半暗帶區(qū)的重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)，黃連素可以抑制IS過程中細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡，黃連素在腦缺血過程中與其他細(xì)胞死亡方式的聯(lián)系可以進(jìn)一步探究。已有研究發(fā)現(xiàn)，黃連素可以抑制小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞的鐵死亡[7]，推測在IS情況下，黃連素也有可能抑制鐵死亡。

1.1 抑制細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是最常見的程序性細(xì)胞死亡，可通過內(nèi)源性或外源性途徑觸發(fā)。腦缺血出現(xiàn)的谷氨酸興奮性毒性、乳酸酸中毒、氧化應(yīng)激等促進(jìn)鈣離子入胞，介導(dǎo)線粒體上抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)促進(jìn)凋亡小體形成，進(jìn)一步激活凋亡執(zhí)行體半胱氨酸的天冬氨酸特異蛋白水解酶(Cysteine-containing aspartate-specific protease，caspase)-3，最終導(dǎo)致核DNA降解，推動細(xì)胞凋亡[8]。Zhao等[9]用黃連素干預(yù)大腦中動脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠，發(fā)現(xiàn)黃連素可以改善神經(jīng)功能缺損程度、降低缺血半暗帶區(qū)caspase-3水平，即抑制細(xì)胞凋亡，可能與黃連素下調(diào)CNPY2調(diào)控的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。Xie等[10]用黃連素處理氧糖剝奪/復(fù)氧(Oxygen-glucose deprivation/re-oxygenation，OGD/R)模型PC12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)黃連素可以促進(jìn)細(xì)胞存活，降低Bax和cleaved-caspase3，下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和CHOP，下調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I比例，表明黃連素可以抑制細(xì)胞凋亡，且機制可能與黃連素抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬有關(guān)。一些研究發(fā)現(xiàn)，黃連素可以通過調(diào)控信號通路來上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax、caspase-3以抑制細(xì)胞凋亡，包括激活PI3K/Akt信號通路、激活A(yù)MP活化蛋白激酶(AMP-acitvated protein kinase，AMPK)信號通路、調(diào)控MAPK信號通路、激活沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirtuin type 1，SIRT1)和抑制缺氧誘導(dǎo)因子1(Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信號通路[11-15]。Chai等[16]進(jìn)行的小鼠體內(nèi)、體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，黃連素可以通過抑制調(diào)節(jié)G0/G1期的細(xì)胞周期蛋白D型和p53磷酸化，使得細(xì)胞維持在G0/G1，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡。

1.2 抑制細(xì)胞焦亡 細(xì)胞焦亡的經(jīng)典途徑由caspase-1介導(dǎo)。腦缺血可啟動小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)并促使炎癥小體的形成，炎癥小體招募并激活caspase-1，進(jìn)而促使白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-1β等促炎因子生成，并切割成孔蛋白胃泌素D(Gasdermin D，GSDMD)，從而使得細(xì)胞膜上出現(xiàn)孔隙、促炎因子釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17]。Zhao等[18]用黃連素干預(yù)OGD/R條件下的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)黃連素可下調(diào)cleaved-caspase-1、GSDMD、IL-1β和上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)-γ，且黃連素抗細(xì)胞焦亡作用可以被PPAR-γ抑制劑抑制，即黃連素通過上調(diào)PPAR-γ表達(dá)抑制細(xì)胞焦亡。

2 抗炎癥反應(yīng)

抗炎癥反應(yīng)是新的卒中療法的重要方向[19]。IS后炎癥反應(yīng)表現(xiàn)為血腦屏障破壞、腦水腫、外周血白細(xì)胞浸潤、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，釋放大量腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)、IL、炎癥趨化因子和潛在的細(xì)胞毒性因子，無菌炎癥級聯(lián)啟動，加重腦損傷[19]。Zhu等[20]在黃連素干預(yù)MCAO小鼠的實驗中發(fā)現(xiàn)，黃連素可以降低腦水含量、降低血清炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，可能與降低高遷移率族蛋白1、Toll樣受體4和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear transcription factor-κB，NF-κB)含量有關(guān)。在MCAO大鼠實驗中，王博等[11]研究發(fā)現(xiàn)，黃連素可以減輕腦組織損傷、降低血清和腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和細(xì)胞間黏附分子1水平，這些作用可以被SIRT1抑制劑逆轉(zhuǎn)，表明黃連素可通過激活SIRT1發(fā)揮抗炎癥作用。在黃連素用于急性缺血性腦卒中(Acute ischemic stroke，AIS)患者的隨機對照試驗中，也發(fā)現(xiàn)黃連素可以改善患者神經(jīng)功能缺損癥狀，降低患者血清炎性因子IL-6、C反應(yīng)蛋白和巨噬細(xì)胞移動抑制因子水平[21]。

3 抗氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是機體產(chǎn)生自由基和抗氧化機制消除自由基之間的不平衡狀態(tài)。自由基主要包括活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、活性氮和脂質(zhì)過氧化物，如過氧化氫、一氧化氮(Nitric oxide，NO)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)。重要的抗氧化機制包括抗氧化劑和抗氧化酶，如抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、抗氧化劑谷胱甘肽(Glutathione，GSH)[22]。在IS過程中會出現(xiàn)氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡、炎癥反應(yīng)、血腦屏障破壞、腦水腫、自噬等病理生理事件，進(jìn)而加重腦損傷[22]?？寡趸瘧?yīng)激可以通過抑制氧化系統(tǒng)和增強抗氧化系統(tǒng)實現(xiàn)，如激活核因子E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件信號通路。Shou等[23]進(jìn)行的體內(nèi)和體外實驗發(fā)現(xiàn)黃連素可以降低氧化損傷神經(jīng)干細(xì)胞和MCAO小鼠腦組織的ROS水平，減輕腦梗死體積，使用PPARδ抑制劑可減弱黃連素以上作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，黃連素通過激活PPARδ，促進(jìn)Nrf1、Nrf2和醌氧化還原酶1的表達(dá)來清除ROS，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。楊魯杰等[24]用黃連素干預(yù)MCAO大鼠，發(fā)現(xiàn)黃連素可以提高大鼠認(rèn)知功能、減小梗死體積、增加腦組織SOD含量，減少腦組織NO、eNOS含量，同時p-AMPK/AMPK比值增加，提示黃連素可以通過減輕氧化應(yīng)激發(fā)揮神經(jīng)保護作用，分子機制可能與提高AMPK磷酸化水平有關(guān)。Zhang等[25]同樣發(fā)現(xiàn)黃連素可以減小MCAO大鼠腦梗死體積，改善神經(jīng)功能缺損，可能與黃連素降低腦組織氧化劑NO、MDA水平和提高腦組織抗氧化劑SOD、GSH水平有關(guān)。柴美靜等[26]在黃連素治療AIS患者的臨床試驗中，發(fā)現(xiàn)常規(guī)治療加用黃連素能更有效地改善神經(jīng)功能缺損癥狀、降低血清MDA水平和提高血清谷胱甘肽過氧化物酶水平。

4 促進(jìn)血管新生

血管新生即為新生血管的形成，由內(nèi)皮細(xì)胞從先前存在的血管中發(fā)芽誘導(dǎo)而成，可發(fā)生在各種生理和病理條件下[27]。IS發(fā)生后，新生血管從正常腦組織延伸至缺血半暗帶區(qū)，可改善周圍缺血區(qū)血液灌注，減少腦梗死體積，重塑神經(jīng)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)。因此，增強血管生成是促進(jìn)IS后功能恢復(fù)的重要策略之一[27]。Zhu等[28]用黃連素干預(yù)MCAO小鼠，發(fā)現(xiàn)術(shù)后第14天，黃連素組血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD31和細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67雙陽性細(xì)胞明顯增多、68Ga-NODAGA-RGD PET/CT掃描檢測顯示黃連素組68Ga-NODAGA-RGD攝取更高，即黃連素組比模型組微血管數(shù)量更多，表明黃連素可以促進(jìn)腦缺血再灌注后腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成重構(gòu)；進(jìn)一步機制研究發(fā)現(xiàn)，黃連素促進(jìn)血管生成可能與通過激活A(yù)MPK信號通路促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化有關(guān)。Liu等[29]給MCAO大鼠腹腔注射黃連素7 d，發(fā)現(xiàn)黃連素組的神經(jīng)系統(tǒng)評分明顯低于MCAO組，微血管密度明顯高于模型組，HIF-1和血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)明顯高于模型組，這提示黃連素可以促進(jìn)腦缺血再灌注損傷大鼠血管生成，機制可能與激活HIF-1/VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

5 表觀遺傳修飾

表觀遺傳學(xué)是指對基因表達(dá)的改變而不是遺傳密碼本身的改變所導(dǎo)致的可遺傳的生物體變化的研究，存在多種表觀遺傳修飾，如DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾和非編碼RNA干擾等[30]。研究發(fā)現(xiàn)，IS后腦內(nèi)整體DNA甲基化上調(diào)與預(yù)后不良相關(guān)，DNA甲基化下調(diào)對腦缺血具有神經(jīng)保護作用[31]。Pang等[32]研究發(fā)現(xiàn)，氧糖剝奪(Oxygen-glucose deprivation，OGD)處理后的細(xì)胞檢測到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平和DNA甲基化水平增加，經(jīng)過黃連素處理后，OGD條件下DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平和DNA甲基化水平降低；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，黃連素可以抑制PPARγ DNA甲基化，上調(diào)PPARγ表達(dá)，從而發(fā)揮腦缺血再灌注損傷保護作用。Chai等[33]在黃連素干預(yù)腦缺血再灌注損傷的體內(nèi)、體外實驗中發(fā)現(xiàn)，黃連素可以結(jié)合視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤1(Retinoblastoma 1，Rb1)mRNA上的poly(A)尾，以拮抗RB1 mRNA的降解，進(jìn)而穩(wěn)定Rb蛋白水平，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞在腦缺血損傷中存活。

6 保護血腦屏障

血腦屏障在調(diào)節(jié)血腦界面液體、溶質(zhì)、細(xì)胞的運輸和維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)微環(huán)境中起著重要作用，其結(jié)構(gòu)成分包括內(nèi)皮細(xì)胞、緊密連接、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞終足和細(xì)胞外基質(zhì)[34]。IS發(fā)生后，血腦屏障被破壞，血源性細(xì)胞、化學(xué)物質(zhì)和液體通過受損的血腦屏障外滲到腦實質(zhì)，大腦的水、離子穩(wěn)態(tài)失衡會導(dǎo)致腦水腫，白細(xì)胞浸潤會促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重腦損傷[34]。崔洪雨等[35]在黃連素治療MCAO大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，黃連素可以改善大鼠神經(jīng)行為障礙、降低腦組織水腫程度、降低腦組織水通道蛋白4(Aquaporin-4，AQP4)表達(dá)，這提示黃連素可以改善腦缺血后腦水腫，機制與降低AQP4水平有關(guān)。王美華等[36]用黃連素干預(yù)OGD/R條件下培養(yǎng)的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)黃連素可以提高細(xì)胞存活率、增加細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1、occludin表達(dá)量，降低TNF-α和IL-1β含量并抑制NF-κB入核，表明黃連素對缺氧缺血損傷下的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護作用，機制可能與抗炎有關(guān)。

7 其他

有研究發(fā)現(xiàn)，黃連素抗IS的機制與抑制興奮性毒性和抑制自噬有關(guān)。興奮性毒性是由谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性，腦缺血導(dǎo)致谷氨酸大量釋放，從而刺激谷氨酸受體，誘導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，受體下游鈣依賴性激活的死亡信號蛋白觸發(fā)大量的信號級聯(lián)，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡[37]。Nadjafi等[38]用OLN-93細(xì)胞建立OGD/R模型，發(fā)現(xiàn)黃連素和谷氨酸受體拮抗均能提高細(xì)胞活性，降低胞內(nèi)鈣離子水平，這表明黃連素可以抑制胞內(nèi)鈣離子超載，降低興奮性毒性，發(fā)揮缺血條件下神經(jīng)保護作用。自噬是一種自我吞噬的細(xì)胞分解代謝途徑，對維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和正常的細(xì)胞功能具有重要作用[39]。自噬在IS中起著雙刃劍作用，一方面，減輕細(xì)胞器損傷的影響，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，另一方面，過度或長時間的自噬會導(dǎo)致自噬溶酶體積累，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞死亡[39]。丁實等[40]通過建立大鼠MCAO模型，研究黃連素在腦缺血再灌注損傷中的作用機制，發(fā)現(xiàn)黃連素干預(yù)組可以降低Beclin-1蛋白表達(dá)和LC3-II/LC3-I比值、增加p62蛋白表達(dá)，這種作用可以被Bcl-2抑制劑削弱；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，機制可能是黃連素增強Bcl-2與Beclin-1結(jié)合。

8 總結(jié)與展望

綜上所述，黃連素對IS的治療作用被大量動物、細(xì)胞實驗和臨床試驗所證實，且其作用機制呈現(xiàn)多靶點、多通路、多方位的特點。目前，基于腦缺血動物細(xì)胞模型研究，發(fā)現(xiàn)黃連素抗IS作用機制集中在抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡、抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、促進(jìn)血管新生、表觀遺傳修飾、保護血腦屏障等方面，臨床研究也證實黃連素可通過抗炎癥反應(yīng)和抗氧化應(yīng)激改善IS患者神經(jīng)功能缺損癥狀。盡管黃連素治療IS作用機制研究較多，但其存在一些不足之處：首先，研究涉及的觀察指標(biāo)及信號通路較單一，各研究范圍較局限，針對多靶點、多信號通路之間關(guān)聯(lián)性的研究甚少；其次，IS的發(fā)病機制復(fù)雜多樣,且新的機制也在不斷被發(fā)現(xiàn)，目前的作用機制研究僅涉及到部分IS病理機制過程，還有其他更多的潛在作用機制尚需探索；此外，黃連素治療IS的臨床研究多屬小樣本、單中心、未實施盲法，且實驗設(shè)計缺乏科學(xué)性，導(dǎo)致臨床研究質(zhì)量不高，研究結(jié)論可重復(fù)性和可靠性差。針對以上問題，未來的研究可以增加黃連素抗IS作用靶點或信號通路上下游關(guān)系探索，增加設(shè)計黃連素對多條信號通路之間串?dāng)_的研究，更深入地探討作用機制之間的相互關(guān)系。此外，還可利用數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、代謝組學(xué)等新興學(xué)科探討黃連素治療IS多靶點、多通路、多環(huán)節(jié)協(xié)同作用關(guān)系。此外，重視藥理研究的臨床轉(zhuǎn)化，不僅需要進(jìn)行黃連素治療IS患者的研究，而且需要開展大樣本、雙盲、多中心的臨床隨機對照試驗研究，進(jìn)而為明確黃連素治療IS臨床療效和安全性提供可靠的證據(jù)。未來可以進(jìn)一步探索黃連素抗IS潛在的機制，如腦-腸軸調(diào)節(jié)、細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)和抗血小板凝集等。黃連素除了靶向IS的病理生理機制，對IS發(fā)病危險因素，如高血壓、糖尿病、高脂血癥、動脈粥樣硬化和肥胖均有藥理活性，未來可以進(jìn)一步研究黃連素對IS的預(yù)防作用及機制。總之，黃連素是一種治療IS極具潛力的藥物，其抗IS藥理作用機制和臨床療效值得進(jìn)一步研究。