周時(shí)均，鄧珊珊，梅 偉，劉 芳

（清鎮(zhèn)市養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，貴州貴陽(yáng) 551400）

巴氏桿菌屬于巴氏桿菌科、巴氏桿菌屬，是一種革蘭氏陰性球桿菌，有莢膜，不形成芽孢、無(wú)鞭毛，可引起包括雞、火雞、鴨、鵝等在內(nèi)的禽類(lèi)的一種出血性、敗血性傳染病，稱(chēng)為禽巴氏桿菌病，又稱(chēng)禽霍亂[1]。該菌是重要的畜禽病原菌，宿主范圍廣泛，致病性強(qiáng)，病型多樣[2]。禽類(lèi)感染該菌具有較高的死亡率，并導(dǎo)致禽類(lèi)生產(chǎn)性能低下，嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

巴氏桿菌的血清型主要以莢膜抗原和脂多糖抗原來(lái)進(jìn)行區(qū)分，根據(jù)莢膜抗原可分為A、B、D、E 和F 5 個(gè)血清型。常用的分型方法有血清學(xué)分型方法和分子分型方法。血清學(xué)方法是在傳統(tǒng)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的，其缺點(diǎn)是操作過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)比較長(zhǎng)，工作量大，對(duì)抗血清的特異性要求較高，不適合于臨床上進(jìn)行大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。分子分型方法包括莢膜多重PCR 方法、脂多糖多重PCR 方法、多位點(diǎn)序列分型、全基因組測(cè)序和脈沖凝膠電泳。分子分型方法具有快速、簡(jiǎn)單、靈敏等特點(diǎn)，其缺點(diǎn)是儀器設(shè)備比較昂貴，檢測(cè)費(fèi)用相對(duì)較貴，技術(shù)難度大，在基層推廣難度比較大。在實(shí)際的檢測(cè)和分型過(guò)程中常常將傳統(tǒng)的血清學(xué)分型方法和分子分型方法相結(jié)合，兩種方法相互補(bǔ)充。

貴州省清鎮(zhèn)市某發(fā)病肉雞養(yǎng)殖戶(hù)肉雞存欄5000只，60 日齡時(shí)開(kāi)始發(fā)病死亡，病雞臨床癥狀表現(xiàn)為精神萎靡，采食量下降、消瘦，兩翅下垂，呼吸不暢，鼻腔有黏液等。剖檢病雞可見(jiàn)肝臟有灰白色壞死點(diǎn)，腎臟腫大，肌胃出血，腺胃乳頭出血，十二指腸彌漫性出血等病變。初步懷疑為禽霍亂，為進(jìn)一步確診該肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)肉雞異常死亡的病因，采用肝臟組織觸片鏡檢、細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、PCR 檢測(cè)、藥敏試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)室診斷方法，為后期防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 病料

選擇患病雞3 只，無(wú)菌采集心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦組織病料。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

2×TaqPCR MasterMix、DNA Marker DL2000、細(xì)菌基因組提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技有限公司；禽流感病毒通用型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒、新城疫病毒通用型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京森康生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；試驗(yàn)所用的抗菌藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，試驗(yàn)所用的鮮血瓊脂平板由實(shí)驗(yàn)室自行制備。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

采集病死雞肝臟組織進(jìn)行觸片，火焰固定后瑞氏染色，光學(xué)顯微鏡下油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

分別無(wú)菌接種3 只受檢雞的脾臟、肝臟組織于新鮮血瓊脂平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)24h 后觀察菌落生長(zhǎng)情況。菌落純化后進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.4 細(xì)菌鑒定

1.4.1 細(xì)菌生化試驗(yàn)

按照巴氏桿菌生化鑒定圖譜選擇微量生化鑒定管，取分離菌純培養(yǎng)物，接種于微量生化鑒定管，37℃恒溫培養(yǎng)24～48h，觀察并參照對(duì)照手冊(cè)判定反應(yīng)結(jié)果。

1.4.2 細(xì)菌PCR 檢測(cè)

挑取適量的細(xì)菌純培養(yǎng)物，參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌總DNA。根據(jù)針對(duì)多殺性巴氏桿菌KMT 基因，應(yīng)用引物KMT1/KMT2 進(jìn)行PCR鑒定，引物序列為：上游引物KMT1：5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′；下游引物KMT2：5′-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為457bp。采用25μL 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)入95℃變性45s、60℃退火45s 和72℃延伸45s 的35 次循環(huán)，最后72℃再延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，觀察是否有特異性目的條帶。

1.5 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)按NCCLS2010 年標(biāo)準(zhǔn)，作出結(jié)果判斷。

1.6 相關(guān)病毒核酸檢測(cè)

分別取3 只病死雞的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦組織病料各1g 于滅菌研缽中加入生理鹽水1mL 快速研磨勻漿后轉(zhuǎn)入1.5mL 無(wú)菌離心管中8000r/min 離心2min，分別移取上清液100μL 于另1 支1.5mL 無(wú)菌離心管中按照DNA/RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取樣品的總核酸，-20℃保存?zhèn)溆谩７謩e對(duì)提取的核酸進(jìn)行禽流感、新城疫病毒熒光定量PCR 核酸檢測(cè)，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)

鮮血瓊脂平板生長(zhǎng)出表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、半透明、灰白色呈露滴狀菌落，見(jiàn)圖1。感染動(dòng)物肝臟組織觸片瑞氏染色可見(jiàn)兩極濃染的短小桿菌，呈藍(lán)色，見(jiàn)圖2。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢顯示分離菌為革蘭氏陰性短小桿菌，呈單個(gè)存在或成雙排列，見(jiàn)圖3。

圖1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

圖2 瑞氏染色結(jié)果

圖3 革蘭氏染色結(jié)果

2.2 細(xì)菌鑒定結(jié)果

2.2.1 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

生化鑒定結(jié)果顯示，該分離菌能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和甘露醇，不發(fā)酵乳糖和麥芽糖，硫化氫、氧化酶和吲哚等試驗(yàn)均為陽(yáng)性，苯丙氨酸、硝酸鹽還原、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶和賴(lài)氨酸試驗(yàn)等均為陰性，符合巴氏桿菌生化特征。結(jié)合細(xì)菌形態(tài)觀察和生化鑒定結(jié)果可初步判定該分離菌為巴氏桿菌。

2.2.2 細(xì)菌PCR 檢測(cè)結(jié)果

取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物8μL，于1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，結(jié)果顯示巴氏桿菌陽(yáng)性對(duì)照和分離菌樣本在457bp 處均出現(xiàn)特異性條帶，結(jié)果見(jiàn)圖4，可得該次分離得到的細(xì)菌為雞巴氏桿菌。

圖4 分離菌PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.3 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)

選取分離得到的巴氏桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果為分離菌對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素、頭孢拉定、諾氟沙星等抗菌藥物呈現(xiàn)良好的敏感性，對(duì)氨芐西林、青霉素等藥物耐藥。

2.4 相關(guān)病毒檢測(cè)結(jié)果

分別對(duì)提取的核酸進(jìn)行禽流感、新城疫病毒熒光定量PCR 核酸檢測(cè)，檢測(cè)均無(wú)明顯的擴(kuò)增曲線且無(wú)CT 值，說(shuō)明各組織樣品不存在禽流感病毒和新城疫病毒感染。

3 診斷結(jié)論

采用過(guò)肝臟組織觸片鏡檢、細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、PCR 檢測(cè)、藥敏試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)室診斷方法，確診該肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)雞異常死亡的病因?yàn)殡u巴氏桿菌感染。藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離菌對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素、頭孢拉定、諾氟沙星等抗菌藥物呈現(xiàn)良好的敏感性。

4 小結(jié)

巴氏桿菌實(shí)驗(yàn)室診斷的方法有病原學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)。病原學(xué)檢測(cè)包括傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等。血清學(xué)診斷方法主要是ELISA 方法?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)包括普通PCR 方法、熒光定量PCR 方法、多重PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、基因芯片等。在臨床診斷過(guò)程中常將細(xì)菌分離培養(yǎng)和PCR 技術(shù)相結(jié)合，更準(zhǔn)確、更快速地進(jìn)行病例確診。

巴氏桿菌不同血清型之間無(wú)交叉免疫保護(hù)[3]，這給疫苗免疫預(yù)防帶來(lái)了困難。在臨床上主要采用抗生素藥物進(jìn)行治療，但是由于大量抗生素藥物的濫用，造成不同程度的耐藥。因此選擇合適的敏感藥物，對(duì)治療和預(yù)防雞巴氏桿菌病至關(guān)重要。巴氏桿菌為條件性致病菌，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降時(shí)常引起發(fā)病[4]，因此加強(qiáng)飼養(yǎng)管理對(duì)預(yù)防巴氏桿菌至關(guān)重要。

清鎮(zhèn)市屬于亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)性氣候，全年空氣濕度較大，光照條件較差，降雨較多，容易引起細(xì)菌滋生。在飼養(yǎng)家禽的過(guò)程當(dāng)中，要科學(xué)配比投喂飼料，保證營(yíng)養(yǎng)攝入。加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生清潔，及時(shí)清掃雞舍環(huán)境糞便，保持環(huán)境通風(fēng)、干燥、清潔。注意防止飼料霉變，雞群還要注意保暖，較少應(yīng)激。提高雞群抵抗力，按照全進(jìn)全出的養(yǎng)殖模式。制定嚴(yán)格的生物安全防護(hù)措施，定期開(kāi)展清洗和消毒，尤其是墻面、地面、進(jìn)出入車(chē)輛以及槽具，應(yīng)進(jìn)行徹底的消毒，同時(shí)注意交替使用消毒藥物，避免產(chǎn)生耐藥性。定期對(duì)常發(fā)疾病進(jìn)行監(jiān)測(cè)，及時(shí)預(yù)警預(yù)報(bào)，淘汰隱性感染雞群。在飼料中適量添加預(yù)防性藥物，及時(shí)殺滅有害病菌。針對(duì)病禽要及時(shí)做好隔離治療，病死禽及時(shí)進(jìn)行無(wú)害化處理。雞群做好高致病性禽流感和新城疫等疫病的免疫工作，加強(qiáng)免疫抗體監(jiān)測(cè)，做好免疫評(píng)估。