沙巴海提·吾斯曼，楊銀銀，劉志琴，楊嘯，李卉，劉玲

1 新疆醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，烏魯木齊 830017；2 新疆地方病分子生物學重點實驗室；3 新疆醫(yī)科大學中心實驗室

食管癌是全球第八大常見癌癥、第六大癌癥相關(guān)死亡原因［1］。近十余年來，盡管我國食管癌的發(fā)病率總體呈下降趨勢，但仍高于全球平均水平，依舊是威脅我國居民健康的主要惡性腫瘤之一［2］。目前，食管癌的病因和發(fā)病機制尚不完全清楚。存活蛋白（Survivin）是凋亡抑制蛋白家族中相對分子質(zhì)量最小的成員，由142個氨基酸組成，在胞質(zhì)內(nèi)通常以二聚體形式存在，具有抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)細胞周期雙重功能［3］。轉(zhuǎn)化生長因子β 激活激酶1（Tak1）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶家族，可通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子κB（NF-κB）信號通路誘導炎癥反應(yīng)［4-5］。有研究報道，哈薩克族食管癌患者腫瘤組織Survivin 高表達，其高表達可促進腫瘤細胞增殖并抑制其凋亡［6］，而Tak1 缺失會抑制MAPK、NF-κB 信號通路［7］。但Survivin 是否通過調(diào)控Tak1、NF-κB 表達，進而影響食管癌細胞周期和凋亡尚不清楚。2020年8月—2022年5月，本研究探討了Survivin對食管癌細胞Tak1、NF-κB表達調(diào)控以及細胞周期和凋亡的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌細胞Eca109，購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所。Survivin 過表達載體及其空載體、Survivin siRNA 載體及其空載體由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司構(gòu)建。Survivin 抑制劑YM155，購自美國Selleck 公司。全波長酶標儀，購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；凝膠成像分析系統(tǒng)、凝膠電泳儀及其配套組件，購自美國Bio-Rad 公司；倒置顯微鏡，購自日本Nikon 公司；全自動流式細胞儀，購自美國BD公司。LipofectamineTM3000，購自美國Invitrogen 公司。細胞周期、細胞凋亡檢測試劑盒，購自美國BD公司。Survivin一抗，購自美國Proteintech 公司；磷酸化Tak1（p-Tak1）、NF-κB p65、β-actin 一抗及山羊抗兔或鼠IgG 二抗，購自美國CST公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 取凍存的Eca109細胞置于37 ℃水浴中快速解凍，然后接種于含10% FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待貼壁細胞生長融合80%～90%時，胰蛋白酶消化，按1∶2傳代。取傳3代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞分組及干預 取傳3代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的Eca109 細胞，接種于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至細胞貼壁。當貼壁細胞生長融合50%～60%時，隨機分為空白對照組、Survivin-siRNA 組、Survivin-siRNA 空載體組、Survivin 過表達組、Survivin 過表達空載體組、YM155 組。按LipofectamineTM3000 說明，SurvivinsiRNA 組與Survivin-siRNA 空載體組分別轉(zhuǎn)染Survivin siRNA 載體、Survivin siRNA 空載體，Survivin過表達組與Survivin 過表達空載體組分別轉(zhuǎn)染Survivin 過表達載體、Survivin 過表達空載體。空白對照組不予轉(zhuǎn)染，YM155 組加入Survivin 抑制劑YM155。

1.4 Survivin、p-Tak1、NF-κ B p65 表達檢測Survivin-siRNA 組、Survivin-siRNA 空載體組、Survivin 過表達組、Survivin 過表達空載體組轉(zhuǎn)染6 h，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h 收集細胞，YM155 組和空白對照組同期收集細胞，消化計數(shù)，制成細胞懸液并調(diào)整細胞密度至5×106個/mL。取各組細胞懸液5 mL，加入含PMSF 和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，經(jīng)BCA 法蛋白定量合格。加入蛋白上樣緩沖液混勻，95 ℃加熱變性10 min。取變性蛋白，SDS-PAGE 分離。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5% BSA 或脫脂奶粉封閉，然后分別加Survivin、p-Tak1、NF-κB p65、β-actin 一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入山羊抗兔或鼠IgG 二抗，室溫孵育2 h。ECL 發(fā)光，暗室內(nèi)顯影、曝光，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin 為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.5 細胞周期檢測 收集各組細胞約1×106個，1 000 r/min離心10 min、離心半徑21 cm，棄上清，留取沉淀。向沉淀中加入預冷75%乙醇，4 ℃固定4 h。然后加入RNase 200 μL，37 ℃水浴30 min。再加入PI 染液400 μL，室溫避光染色30 min，上流式細胞儀檢測。

1.6 細胞凋亡檢測 收集各組細胞約1×106個，1 000 r/min 離心10 min、離心半徑21 cm，棄上清，留取沉淀。向沉淀中加入1×Binding Buffer 300 μL 重懸，然后依次加入Annexin V-FITC 5 μL、PI染液5 μL，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測。1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Survivin、p-Tak1、NF-κB p65表達比較 見表1。

表1 各組Survivin、p-Tak1、NF-κB p65相對表達量比較（±s）

表1 各組Survivin、p-Tak1、NF-κB p65相對表達量比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05。

組別空白對照組Survivin-siRNA組Survivin-siRNA空載體組Survivin過表達組Suvivin過表達空載體組YM155組NF-κB p65 0.73 ± 0.40 0.54 ± 0.40 0.69 ± 0.41 0.75 ± 0.40 0.63 ± 0.44 0.45 ± 0.28 Survivin 0.76 ± 0.03 0.13 ± 0.03*0.75 ± 0.02 4.05 ± 0.27*0.61 ± 0.24 0.39 ± 0.04*p-Tak1 0.55 ± 0.16 0.68 ± 0.16 0.67 ± 0.58 0.68 ± 0.42 0.75 ± 0.40 0.77 ± 0.45

2.2 各組細胞周期分布比較 見表2。

表2 各組細胞周期分布比較（%，±s）

表2 各組細胞周期分布比較（%，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05。

組別細胞周期S期34.28 ± 1.56 33.05 ± 0.11 33.39 ± 0.91 33.30 ± 2.70 33.55 ± 0.55 31.18 ± 1.08*G1期54.11 ± 1.65 54.54 ± 0.20 51.29 ± 0.92 55.72 ± 4.52 51.22 ± 0.83 53.10 ± 0.71 G2期空白對照組Survivin-siRNA組Survivin-siRNA空載體組Survivin過表達組Suvivin過表達空載體組YM155組11.61 ± 0.42 12.41 ± 0.22 15.33 ± 0.02 10.98 ± 1.93 15.23 ± 0.62 15.72 ± 1.03*

2.3 各組細胞凋亡率比較 見表3。

表3 各組細胞凋亡率比較（%，±s）

表3 各組細胞凋亡率比較（%，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05。

組別空白對照組Survivin-siRNA組Survivin-siRNA空載體組Survivin過表達組Suvivin過表達空載體組YM155組總凋亡率19.67 ± 1.66 51.70 ± 2.16*21.23 ± 3.41 20.80 ± 2.48 20.90 ± 3.52 29.80 ± 4.01晚期凋亡率8.67 ± 0.55 22.33 ± 4.50 10.83 ± 1.93 12.43 ± 1.50 10.63 ± 2.12 18.10 ± 2.43早期凋亡率11.00 ± 2.02 29.37 ± 2.43*10.40 ± 1.73 8.37 ± 1.80 10.27 ± 1.54 11.70 ± 1.59

3 討論

食管癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，主要病理類型包括鱗癌、腺癌及其他少見類型。在我國90%以上食管癌為鱗癌。目前，食管癌的發(fā)病機制仍未完全闡明。近年研究主要集中于食管癌發(fā)病的分子機制以及早期預防［8-10］。本課題組前期篩選了食管癌細胞的差異表達基因，并進一步探究了表觀遺傳學中DNA 甲基化對基因表達調(diào)控的影響［11］。Survivin 即是本課題組篩選出來的哈薩克族食管癌患者腫瘤細胞中的高表達基因，但其是否通過調(diào)控Tak1、NF-κB表達，進而調(diào)控腫瘤細胞周期分布及凋亡尚不清楚。

在惡性腫瘤中凋亡調(diào)控系統(tǒng)的分子改變分為三類：第一類為核心抗凋亡基因的上調(diào)，第二類為核心促凋亡基因的下調(diào)，第三類為參與核心凋亡調(diào)控系統(tǒng)的上游信號通路紊亂［12］。Survivin 是凋亡抑制蛋白家族的成員之一，兼有第一、三類凋亡調(diào)控系統(tǒng)分子的特征［13］。Survivin在正常組織中幾乎不表達，但在腫瘤組織中高表達，并且其高表達與腫瘤惡性程度密切相關(guān)。Survivin 有可能是惡性腫瘤早期診斷和預后評估的生物標志物［14］。Tak1 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可被許多細胞因子、生長因子和微生物及其產(chǎn)物所激活［15］。有研究表明，在腫瘤中條件性敲除Tak1 基因，在某些情況下具有抑制腫瘤作用，Tak1 抑制劑能夠抑制NF-κB、p38 MAPK、ERK、STAT3 激活，從而抑制骨髓瘤生長［16］。有研究還發(fā)現(xiàn)，敲除Tak1后，食管癌細胞增殖能力增強［17］。結(jié)果表明，Tak1 在不同腫瘤中所起的作用不同。NF-κB是一個高度保守的多功能轉(zhuǎn)錄因子家族，能夠參與機體免疫、炎癥反應(yīng)、細胞分化等相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB 還可參與腫瘤發(fā)生和DNA 修復過程。在許多惡性腫瘤中，NF-κB 以細胞類型特異的方式發(fā)揮作用，即激活腫瘤細胞內(nèi)生存基因和腫瘤微環(huán)境中炎癥促進基因的表達，可作為腫瘤治療和預后評估的生物標志物［18］。在許多惡性腫瘤中已檢測到NF-κB的異常激活，如結(jié)直腸癌、肝細胞癌。在乳腺癌中激活NF-κB 可抵抗細胞凋亡，并與化療耐藥有關(guān)，提示NF-κB 有可能是惡性腫瘤治療的一個潛在靶點。有研究發(fā)現(xiàn)，TAB3 通過Tak1-TAB3-TRAF6 復合物的形成激活NF-κB 通路，從而調(diào)節(jié)Survivin 表達［19］。也有研究報道，靶向Cripto-1/Tak1/NF-κB/Survivin 信號通路可能是對抗惡性腫瘤細胞凋亡抵抗的有效途徑［20］。這些研究無疑為探索食管癌的發(fā)病機制提供了新的方向。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，哈薩克族食管癌患者腫瘤組織Survivin 高表達，其高表達可促進腫瘤細胞增殖并抑制其凋亡［6］。但Survivin 是否通過調(diào)控Tak1、NF-κB表達，進而影響食管癌細胞周期和凋亡尚不清楚。為進一步探討食管癌細胞Survivin、Tak1、NF-κB表達的關(guān)系，本研究通過過表達Survivin、沉默表達Survivin 以及加入Survivin 抑制劑來觀察Eca109 細胞Survivin 表達變化，成功構(gòu)建了Eca109細胞Survivin 高表達與低表達模型。在此基礎(chǔ)上進一步觀察了Tak1、NF-κB表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Survivin表達變化并未引起Tak1、NF-κB 表達變化，提示Survivin可能不直接調(diào)控Tak1、NF-κB表達。但Survivin表達變化卻能在Eca109 細胞周期分布和凋亡調(diào)控方面發(fā)揮一定作用。YM155 抑制Survivin 表達后，Eca109 細胞G2期細胞所占比例顯著升高，S 期細胞所占比例顯著降低，說明抑制Survivin 表達能夠抑制食管癌細胞DNA 合成。siRNA 抑制Survivin 表達能夠使Eca109 細胞早期凋亡率和總凋亡率顯著升高，說明抑制Survivin 表達能夠促進食管癌細胞凋亡。以上結(jié)果表明，Survivin可參與食管癌細胞周期分布和凋亡調(diào)控。

綜上所述，Survivin表達能夠參與食管癌細胞周期分布和凋亡調(diào)控，但其作用途徑并非通過調(diào)控Tak1、NF-κB表達實現(xiàn)。