郭文博

(佳木斯市中心醫(yī)院普外一科,黑龍江 佳木斯 154002)

胰腺癌具有發(fā)病迅速、預(yù)后差、死亡率高等特點(diǎn)[1]。特別是胰腺血供豐富，又無包膜，發(fā)病早期就容易轉(zhuǎn)移至胰周淋巴結(jié)，甚至轉(zhuǎn)移到肝和肺等組織器官[2]。胰腺癌的早期診斷比較困難，很多患者在確診時(shí)已處于中晚期，伴隨有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率低于10%，為此探索胰腺癌的發(fā)病機(jī)制具有重要價(jià)值[3]?，F(xiàn)代研究表明胰腺癌的發(fā)生與發(fā)展涉及癌脫離原發(fā)病灶、躲避免疫監(jiān)視、通過淋巴和血管遷移錨定生長(zhǎng)等病理過程，也是一個(gè)多基因參與、多步驟完成的過程[4]。DNA甲基化作為惡性腫瘤發(fā)生的早期事件，是當(dāng)前胰腺癌研究的熱點(diǎn)，DNA異常甲基化可導(dǎo)致抑癌基因失活[5]。ZNF是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，ZNF772是ZNF家族的一個(gè)成員[6]。ZNF772表達(dá)異常可導(dǎo)致下游Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活，從而促進(jìn)惡性腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移[7]。ZNF772基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化可能是ZNF772表達(dá)下調(diào)的重要原因之一，但是其調(diào)節(jié)的機(jī)制還需要進(jìn)一步分析[8]。本文具體探討了胰腺癌患者ZNF772基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的特征，希望能為明確胰腺癌的發(fā)生提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料：2018年2月～2021年1月選擇在佳木斯市中心醫(yī)院診治的胰腺癌患者118例為胰腺癌組，同期選擇胰腺炎患者118例為胰腺炎組。納入標(biāo)準(zhǔn)：兩組分別符合胰腺癌、胰腺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)(經(jīng)病理確診)；年齡20～80歲；研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)；均具有病理取樣的指征；Karnofsky評(píng)分(KPS)≥60分；病灶要求為原發(fā)病灶；病理檢查前未行任何其他治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠與哺乳期婦女；有嚴(yán)重的未控制的內(nèi)科疾病或急性感染者；合并其他創(chuàng)傷和腫瘤病史患者；無法得到病理證實(shí)的胰腺病變患者。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。在胰腺癌患者中，臨床分期Ⅰ期68例，Ⅱ期32例，Ⅲ期18例；組織學(xué)分化：高分化58例，中分化32例，低分化28例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移32例。

表1 兩組一般資料比較

1.2ZNF772基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的檢測(cè)：取所有患者的胰腺病理組織，采用DNA抽提Kit試劑盒(QIAGEN公司)提取DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光度值，確保提取的DNA質(zhì)量合格。采用PCR檢測(cè)ZNF772基因啟動(dòng)子區(qū)表達(dá)水平，PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為352 bp，上游序列為5′-TATGAGGCGTTAGAAAGTGTTT-3′，下游序列為5′-AATCAACTTTACCGGAAAACCCA-3′，同時(shí)使用GAPDH引物進(jìn)行內(nèi)參的擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃30 s、55℃30 s、72℃45 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物送至大連TAKARA公司進(jìn)行序列測(cè)序，主要判斷CpG 位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化，TG判為非甲基化，CG序列判為甲基化。

1.3調(diào)查資料：調(diào)查患者的性別、年齡、BMI、收縮壓、舒張壓、心率等一般資料，記錄胰腺癌患者的臨床分期、組織學(xué)分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等資料。

2 結(jié)果

2.1ZNF772基因相對(duì)表達(dá)水平比較：胰腺癌組的ZNF772基因相對(duì)表達(dá)水平(0.88±0.11)，低于胰腺炎組的(2.47±0.18)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.193，P=0.001)。

2.2ZNF772基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化率比較：胰腺癌組的ZNF772基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化率為22例(18.6%)，高于胰腺炎組的2例(1.7%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.553，P=0.000)。

2.3ZNF772基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化與胰腺癌病理特征的關(guān)系：在胰腺癌組中，不同臨床分期、組織學(xué)分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的ZNF772基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 ZNF772基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化與胰腺癌病理特征的關(guān)系[n(%)，n=118]

2.4多因素分析：在胰腺癌組中，Logistic回歸顯示臨床分期、組織學(xué)分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移都為影響ZNF772基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的重要因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響胰腺癌ZNF772基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的多因素分析

3 討論

胰腺癌是臨床上較常見的惡性腫瘤之一，該病惡性程度較高，淋巴、肝臟轉(zhuǎn)移率也相對(duì)較高，很多患者在就診時(shí)失去了手術(shù)指征，且放療和化療不夠敏感，這也使得預(yù)后一直較差，為此積極探索胰腺癌的發(fā)病機(jī)制具有重要價(jià)值[9]。胰腺癌致病相關(guān)因素有環(huán)境、遺傳等[10]。表觀遺傳學(xué)是指DNA序列無變化，而是相關(guān)化學(xué)修飾來改變基因的功能，如小RNA調(diào)控、DNA甲基化、染色體組蛋白修飾等。特別是DNA的異常甲基化可使抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島出現(xiàn)異常甲基化，導(dǎo)致抑癌基因失活；也可激活癌基因，促進(jìn)腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移[11]。ZNF蛋白家族數(shù)量龐大，與多種人類腫瘤相關(guān)，已發(fā)現(xiàn)ZNF亞型的異常表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[12]。從機(jī)制上分析，CpG島主要位于ZNF772基因的啟動(dòng)子區(qū)域，DNA的甲基化通常發(fā)生于CpG島上，主要為在胞嘧啶的第五位碳原子上加上一個(gè)甲基化基因，從而變成5-甲基胞嘧啶[13]。ZNF772基因能夠抑制惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，抑制癌血管生成，但是DNA甲基化可導(dǎo)致ZNF772基因表達(dá)水平降低，從而誘發(fā)惡性腫瘤的形成[14-15]。腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致惡性腫瘤患者預(yù)后死亡的重要原因，其也是一種遺傳學(xué)與表觀遺傳學(xué)過程。而DNA甲基化可使惡性腫瘤患者的表觀遺傳學(xué)模式被破壞，導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)受到抑制[16-17]。而經(jīng)去DNA甲基化治療，可達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生的目的[18-19]。本研究顯示在胰腺癌組中，不同臨床分期、組織學(xué)分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的ZNF772基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Logistic回歸顯示臨床分期、組織學(xué)分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移都為影響ZNF772基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的重要因素。當(dāng)前也有研究表明，相對(duì)于健康正常人，80%以上的胰腺癌患者存在關(guān)鍵性腫瘤抑制基因的甲基化，并且DNA甲基化發(fā)生在遺傳學(xué)改變之前，為此早期檢測(cè)到抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)有利于預(yù)測(cè)患者的病情與預(yù)后狀況[20-22]。不過本研究也存在一定的不足，調(diào)查的病例數(shù)量比較少，沒有納入正常對(duì)照組，將在后續(xù)研究中進(jìn)行探討。總之，胰腺癌患者多伴隨有ZNF772基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化，從而導(dǎo)致ZNF772基因表達(dá)水平下降，ZNF772基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化可能作為一種監(jiān)測(cè)胰腺癌病情的重要指標(biāo)。