王文濤 俞志明 宋秀賢 郭宏紅 任向征

球形棕囊藻同化吸收硝酸鹽的氮氧穩(wěn)定同位素分餾研究*

王文濤1, 2, 3, 4俞志明1, 2, 3, 4①宋秀賢1, 2, 3, 4郭宏紅1, 5任向征1, 2, 3, 4

(1. 中國科學院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室 山東青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室 山東青島 266071; 3. 中國科學院海洋大科學研究中心 山東青島 266071; 4. 中國科學院大學 北京 100049; 5. 青島科技大學化學與分子工程學院 山東青島 266042)

球形棕囊藻; 同化吸收; 氮穩(wěn)定同位素; 氧穩(wěn)定同位素; 同位素分餾

球形棕囊藻()屬于定鞭藻綱, 在南北極及熱帶的海洋中均有分布, 其存在單細胞和囊體細胞兩種可相互轉(zhuǎn)化的生活形態(tài), 是少數(shù)具有復雜異型生活史的海洋藻之一(齊雨藻等, 2001)。球形棕囊藻赤潮是一種全球廣泛分布的生態(tài)災害, 自1997年以來我國沿海多地也均有相關(guān)報道, 暴發(fā)時會產(chǎn)生大量溶血性毒素與有機泡沫, 形成最大直徑約兩到三厘米的囊體, 嚴重威脅近海的生態(tài)健康和人類安全(陳菊芳等, 1999; 齊雨藻等, 2001; 沈萍萍等, 2018)。此外, 球形棕囊藻是重要的二甲基硫化物(dimethyl sulfide, DMS)生產(chǎn)者, 對全球的硫循環(huán)和氣候調(diào)節(jié)均有影響(朱蓉等, 2013; 涂俊杰等, 2022)。充分了解球形棕囊藻的生長特性, 摸清環(huán)境因素對該赤潮暴發(fā)的控制機制, 是相關(guān)生態(tài)災害防控的重要基礎之一。

氮是海洋浮游植物生長的基礎, 在人類活動的影響下, 過量氮營養(yǎng)鹽被排放入海, 導致部分海域呈現(xiàn)富營養(yǎng)化特征, 是引發(fā)赤潮災害的重要因素之一。針對球形棕囊藻吸收利用氮營養(yǎng)鹽的研究發(fā)現(xiàn), 球形棕囊藻赤潮多暴發(fā)于相對較高濃度、較高比例硝酸鹽的海域, 如歐洲北海(Tungaraza, 2003)、廣西北部灣(Lv, 2019)、深圳大鵬灣等(劉悅等, 2022)。室內(nèi)培養(yǎng)實驗也證實, 球形棕囊藻在硝酸鹽為主要氮源體系中具有更高單細胞豐度, 并可以形成囊體(王艷等, 2006, 2013; 梁大勇等, 2018)?；谏鲜鲅芯靠芍? 充分了解環(huán)境硝酸鹽變化對球形棕囊藻生長的影響, 是我們理解球形棕囊藻赤潮暴發(fā)機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

然而由于海水中的硝酸鹽具有高度的時空異質(zhì)性和環(huán)境敏感性, 傳統(tǒng)分析方法無法精準刻畫其生物地球化學過程, 在闡釋硝酸鹽遷移轉(zhuǎn)化方面存在較大困難。近些年, 硝酸鹽穩(wěn)定同位素技術(shù)逐漸成為研究海洋氮循環(huán)和氮驅(qū)動生態(tài)過程的重要技術(shù)。由于其具有氮、氧兩種穩(wěn)定同位素作為限制參數(shù), 因此可以更加精準地解析硝酸鹽的來源, 準確刻畫關(guān)鍵循環(huán)過程(Sigman, 2019)。盡管硝酸鹽穩(wěn)定同位素技術(shù)尚未應用于球形棕囊藻赤潮暴發(fā)機制方面的研究, 但是作為開展近海富營養(yǎng)化和生態(tài)災害研究的前沿方法, 該技術(shù)已在相關(guān)領(lǐng)域展現(xiàn)出了極高的應用前景(楊志等, 2012; 陳法錦等, 2013)。

硝酸鹽氮、氧穩(wěn)定同位素技術(shù)研究氮循環(huán)關(guān)鍵過程建立在穩(wěn)定同位素分餾效應的基礎上, 即某元素的數(shù)種穩(wěn)定同位素在生物作用下以不同速率遷移轉(zhuǎn)化, 使得參與反應的物質(zhì)產(chǎn)生同位素比值變化, 從而記錄相關(guān)轉(zhuǎn)化過程的信息(Altabet, 2005; 洪義國, 2013)。例如海洋中的浮游植物在同化吸收硝酸鹽時, 理論上會優(yōu)先利用輕同位素, 導致反應物重同位素富集, 引起同位素比值的變化。因此了解相關(guān)過程的分餾系數(shù)是利用穩(wěn)定同位素技術(shù)解析物質(zhì)循環(huán)轉(zhuǎn)化的基礎。

鑒于目前尚未有相關(guān)研究揭示球形棕囊藻同化吸收硝酸鹽過程的氮、氧穩(wěn)定同位素變化及其分餾特征, 通過開展室內(nèi)培養(yǎng)實驗, 獲取營養(yǎng)鹽濃度、硝酸鹽氮、氧穩(wěn)定同位素等關(guān)鍵參數(shù), 計算球形棕囊藻同化吸收硝酸鹽的穩(wěn)定同位素分餾系數(shù), 分析其變化規(guī)律與控制因素, 并與其他海洋藻類的研究結(jié)果進行對比。本研究首次獲取了球形棕囊藻同化吸收硝酸鹽的氮、氧雙穩(wěn)定同位素分餾系數(shù), 豐富了海洋浮游植物同位素分餾數(shù)據(jù)庫, 為硝酸鹽穩(wěn)定同位素技術(shù)的運用和球形棕囊藻赤潮暴發(fā)機制研究提供了重要的基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用藻種為球形棕囊藻(), 取自中國科學院海洋研究所海洋微藻培養(yǎng)庫。培養(yǎng)實驗所用的海水為經(jīng)0.45 μm 混合纖維膜過濾后于121 °C 滅菌30 min的天然海水。藻種在f/2培養(yǎng)基(Guillard, 1975), 溫度20 °C, 光照度5 000 lx, 光暗比L︰D=12︰12的條件下培養(yǎng)至指數(shù)生長期用于實驗。

1.2 實驗方法

取單個囊體, 離心破碎后, 經(jīng)200 μm篩絹過濾, 放入滅菌的天然海水中進行饑餓培養(yǎng), 監(jiān)測硝酸鹽濃度, 待其低于檢測限后開始實驗。向其中加入f/2培養(yǎng)基, 分裝至39個75 cm2的無菌細胞培養(yǎng)瓶, 在20 °C、12︰12光照黑暗比條件下培養(yǎng), 每2天取3瓶樣品, 使用GF/F濾膜過濾100 mL水樣, 50 mL濾液加入1滴氯仿固定后置于–20 °C冷凍保存, 用于測定氮、磷、硅等營養(yǎng)鹽濃度, 50mL濾液裝入無菌潔凈離心管中置于-20 °C冷凍保存, 用于測定硝酸鹽氮、氧穩(wěn)定同位素。

1.3 樣品分析

1.4 分餾系數(shù)計算

球形棕囊藻同位素分餾系數(shù)()的計算基于Rayleigh公式:

substrate()＝substrate(=1)–×ln, (1)

其中,代表了反應物的剩余比例,substrate()則代表該時刻反應物的穩(wěn)定同位素比值,substrate(=1)代表初始時期反應物的穩(wěn)定同位素比值, 即未發(fā)生反應物消耗(=1)時。Rayleigh模型適用于封閉體系, 即在反應過程中未發(fā)生反應物的補充。由于本計算是基于反應物的同位素比值變化, 因此可有效避免藻類對海水其他氮源吸收的干擾, 分餾系數(shù)更準確。

2 結(jié)果與討論

2.1 球形棕囊藻培養(yǎng)實驗五項營養(yǎng)鹽變化特征

2.2 球形棕囊藻培養(yǎng)實驗硝酸鹽氮、氧穩(wěn)定同位素變化特征

2.3 硝酸鹽氮、氧穩(wěn)定同位素分餾系數(shù)變化特征

圖2 硝酸鹽氮、氧穩(wěn)定同位素值(δ15N-和δ18O-)隨時間的變化特征

圖3 硝酸鹽氮、氧穩(wěn)定同位素分餾系數(shù)(15ε和18ε)的變化特征

注: 分餾系數(shù)從第3天開始計算, 虛線表示第7～25天對應分餾系數(shù)的平均值

然而值得注意的是, 在球形棕囊藻同化吸收硝酸鹽時, 氮、氧穩(wěn)定同位素并非一直按照等比或近似等效變化。氮的分餾系數(shù)最初達到了14.06‰, 隨后逐漸下降, 最終穩(wěn)定在3.3‰左右, 而氧的分餾則從2.02‰上升至4.91‰, 后穩(wěn)定在3.1‰左右。這種前期展現(xiàn)出的N、O分餾系數(shù)差異可能是受到兩方面的因素所致: 一方面可能由于是藻類對外界環(huán)境變化的應激響應, 突然增加的氮源導致球形棕囊藻在實驗初期同化吸收增強, 產(chǎn)生較高的分餾系數(shù), 而后隨球形棕囊藻對環(huán)境適應, 其產(chǎn)生的硝酸鹽分餾系數(shù)降低; 而另一方面可能由于劇烈的硝酸鹽跨膜運輸所致(Karsh, 2014)。后者的詳細討論將與2.4部分中的不同微藻間分餾系數(shù)比較一起敘述。

2.4 典型微藻同化吸收硝酸鹽的穩(wěn)定同位素分餾系數(shù)對比

目前針對海洋微藻同化吸收硝酸鹽過程所引發(fā)的同位素分餾情況, 國內(nèi)外已有一定的研究積累。總體來看, 海洋微藻氮、氧穩(wěn)定同位素分餾具有較大范圍, 按照綱的分類, 大部分的微藻的15呈現(xiàn)甲藻綱<蒲林藻綱<硅藻綱的特征(表1)。本研究的球形棕囊藻15和18分別為3.32‰±0.38‰和3.12‰±0.59‰, 恰好符合這一特點。這可能與藻類本身對營養(yǎng)鹽的同化吸收特性相關(guān)。

表1 典型海洋微藻同化吸收硝酸鹽的穩(wěn)定同位素分餾系數(shù)

續(xù)表

注:a: 本研究;b:Needoba(2003);c: Montoya(1995);d: Wada (1980);e: Granger(2004);f:Waser(1998);g:Wada(1978);h:Pennock(1996);I: Granger(2010)

此外, 藻類同化吸收引起的穩(wěn)定同位素分餾系數(shù)大小既取決于藻類自身特性, 也與藻的培養(yǎng)方式有關(guān)。當黑暗等減緩藻細胞光合作用時, 硝酸鹽向胞外的釋放速率與硝酸鹽在胞內(nèi)的還原速率可以達到相對較高比例, 胞內(nèi)經(jīng)還原酶改造的硝酸鹽同位素信號釋放到胞外, 從而降低胞內(nèi)外的硝酸鹽穩(wěn)定同位素差異, 令基質(zhì)穩(wěn)定同位素值與分餾系數(shù)升高(Needoba, 2004)。綜上, 本實驗使用的12︰12光照培養(yǎng)方式, 以及計算的15和18值, 可較客觀反映球形棕囊藻同化吸收硝酸鹽過程的分餾系數(shù)特征。

圖4 浮游植物同化吸收硝酸鹽的過程示意與發(fā)生的穩(wěn)定同位素分餾(參考自Karsh et al, 2014)

注:in表示進入細胞膜的分餾,out表示出細胞膜的分餾,NR表示硝酸鹽還原的分餾, NR表示硝酸鹽還原, Norg表示有機氮

3 結(jié)論與展望

本文開展了針對球形棕囊藻()同化吸收硝酸鹽的氮、氧穩(wěn)定同位素分餾研究。結(jié)果表明:

(2) 球形棕囊藻同化吸收硝酸鹽過程的15和18均值分別為3.32‰±0.38‰和3.12‰±0.59‰, 二者呈現(xiàn)1︰1的比例特征, 分餾系數(shù)小于大部分的硅藻綱而大于甲藻綱;

(3) 根據(jù)微藻同化吸收與硝酸鹽跨膜運輸?shù)榷鄠€過程對同位素分餾的影響, 球形棕囊藻生長前中期的硝酸鹽還原酶活性較高, 可能是引起氮分餾系數(shù)由高逐漸降低的重要原因。

本結(jié)果首次給出了球形棕囊藻的氮、氧穩(wěn)定同位素分餾系數(shù), 補充了海洋微藻同位素分餾數(shù)據(jù)庫, 為穩(wěn)定同位素技術(shù)研究赤潮暴發(fā)的環(huán)境驅(qū)動機制提供關(guān)鍵基礎數(shù)據(jù)。在此基礎上, 后續(xù)可以進一步開展針對球形棕囊藻微觀環(huán)境氮循環(huán)過程的研究, 精準闡明營養(yǎng)環(huán)境對球形棕囊藻不同生活史階段和赤潮暴發(fā)的影響, 以期為近海赤潮災害研究提供重要支撐。

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NITROGEN AND OXYGEN STABLE ISOTOPIC FRACTIONATION OF NITRATE ASSIMILATION BY

WANG Wen-Tao1, 2, 3, 4, YU Zhi-Ming1, 2, 3, 4, SONG Xiu-Xian1, 2, 3, 4, GUO Hong-Hong1, 5, REN Xiang-Zheng1, 2, 3, 4

(1. CAS Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071, China; 3. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 4. University of Chinese Academy, Beijing 100049, China; 5. College of Chemistry and Molecular Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China)

; assimilation; nitrogen isotope; oxygen isotope; isotopic fractionation

P734

10.11693/hyhz20220400105

*山東省自然科學基金青年基金, ZR2019QD014號; 國家自然科學基金青年基金, 41806091號; 2019年度“泰山學者攀登計劃”。王文濤, 碩士生導師, 特聘副研究員, E-mail: wtwang@qdio.ac.cn

俞志明, 博士生導師, 研究員, E-mail:zyu@qdio.ac.cn

2022-04-22,

2022-05-30