曹慧敏 朱 陽 郭祖霆 李 雙 周 旭 遲長鳳 鄭利兵

虎斑烏賊FMRFamide的表達(dá)定位及其Na+通道受體基因的克隆鑒定、表達(dá)分析*

曹慧敏 朱 陽 郭祖霆 李 雙 周 旭 遲長鳳①鄭利兵①

(浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 海洋生物種質(zhì)資源發(fā)掘利用國家地方聯(lián)合工程研究中心 浙江舟山 316022)

FMRFamide是神經(jīng)肽家族的一類重要代表成員, 參與無脊椎動物的多種生理調(diào)控過程。利用同源克隆和RACE技術(shù)獲得了虎斑烏賊神經(jīng)肽FMRFamide的Na+通道受體(FaNaC)的cDNA全長共2 090 bp, 開放閱讀框(open reading frame, ORF) 1 782 bp, 編碼一個由593個氨基酸殘基組成的多肽鏈, N端無信號肽, 具有2個跨膜區(qū); 序列分析顯示其與頭足綱、腹足綱和雙殼綱相似性較高, 聚類為姐妹支。熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測到主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的視葉、腦, 其次是心臟和副纏卵腺。原位雜交結(jié)果顯示其陽性信號存在于視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的細(xì)胞體、視葉深層視網(wǎng)膜的內(nèi)顆粒細(xì)胞層和外細(xì)胞顆粒層、食道上神經(jīng)團(tuán)的各亞葉, 尤以交界區(qū)最為集中。同時, 原位雜交和免疫組化觀察到神經(jīng)肽FMRFamide主要分布在視葉的中央髓質(zhì)區(qū)、邊緣髓質(zhì)區(qū)、內(nèi)細(xì)胞顆粒層和外細(xì)胞顆粒層; 食道上神經(jīng)團(tuán)的陽性信號較少, 主要集中為亞葉交界處。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研究虎斑烏賊FMRFamide及FaNaC的生理功能研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。

虎斑烏賊; FMRFamide; FaNaC; 表達(dá)定位; 原位雜交; 免疫組化

虎斑烏賊()生長速度快、個體大, 是經(jīng)濟(jì)價值較高的養(yǎng)殖品種。多年的人工養(yǎng)殖條件下, 虎斑烏賊表現(xiàn)出了與其他人工養(yǎng)殖品種如曼氏無針烏賊() (Cao, 2016)、商烏賊() (Domingues, 2002)、滑柔魚() (Durward, 1980)、藍(lán)蛸() (Van Heukelem, 1976)等類似的性腺發(fā)育早熟現(xiàn)象, 導(dǎo)致成體規(guī)格小型化(鄭小東等, 2010; Cao, 2016), 嚴(yán)重制約了其養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。然而, 到目前為止, 有關(guān)其生長發(fā)育及生殖過程的調(diào)控機(jī)制還未得到很好的闡述。

本文通過同源克隆及RACE (rapid amplification of cDNA end)技術(shù)克隆虎斑烏賊Na+通道受體(FaNaC)的cDNA全長序列, 并進(jìn)行生物信息學(xué)分析; 利用實(shí)時熒光定量(Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)技術(shù)檢測在雌性個體中的組織分布模式; 進(jìn)一步采用原位雜交(hybridization, ISH)和免疫組織化學(xué)(immumohistochemical staining, IHC)技術(shù)定位分析FMRFamide和在不同組織中的分布特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為認(rèn)識FMRFamide和FaNaC的功能特征提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 對于進(jìn)一步深入探究FMRFamide通過FaNaC參與調(diào)控的生理代謝過程具有重要的理論意義, 同時為頭足類的種質(zhì)資源的恢復(fù)和保護(hù)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

實(shí)驗(yàn)所用性成熟V期虎斑烏賊[體重: (81.13±16.6) g, 胴長: (8.25±0.9) cm]購自廣東省湛江市硇洲島漁民。烏賊生殖時期鑒定與活體解剖, 參照蔣霞敏等(2008)方法, 取腦、視葉、纏卵腺等組織于RNA保存液中, 4 °C過夜后轉(zhuǎn)入–80 °C冰箱保存?zhèn)溆? 取2.5 cm× 2.5 cm×0.2 cm規(guī)格大小的組織于4%多聚甲醛浸泡24 h, 于4 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 SpFaNaC基因全長cDNA的克隆

1.2.1 RNA提取及cDNA的合成 虎斑烏賊腦組織總RNA的提取采用常規(guī)的Trizol法, 通過蛋白抽提、核酸沉淀、洗滌后, 加入適量的DEPC水溶解, 1.2%的瓊脂糖凝膠電泳、核酸分析儀分別進(jìn)行提取RNA質(zhì)量、濃度的檢測。cDNA依據(jù)試劑盒(TaKaRa, Japan)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成, 置于–20 °C備用。

1.2.2全長cDNA的克隆 根據(jù)SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech)說明書利用1.0 μg腦組織總RNA制備3’端和5’端RACE模板。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組文庫中搜索到的基因設(shè)計虎斑烏賊基因在保守區(qū)的引物-F/R (表1), 擴(kuò)增、測序保守區(qū)段序列。根據(jù)測序的序列設(shè)計5’/3’端特異性RACE引物5’/3'--outter/inner (m>70 °C) (表1)進(jìn)行兩端未知序列的擴(kuò)增, 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測、凝膠回收后連接pMD-19T并轉(zhuǎn)化DH5α, 挑陽性單克隆送至上海生工進(jìn)行測序、拼接, 進(jìn)而獲得的cDNA全長序列。

表1 PCR引物信息

續(xù)表

1.3 序列生物信息學(xué)分析

序列的同源比對、多序列比對、分析和修飾、開放閱讀框(ORF)的查找、氨基酸序列的預(yù)測、信號肽、蛋白的理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測、進(jìn)化樹的構(gòu)建參考朱陽(2020)。

1.4 SpFaNaC的組織分布模式

根據(jù)獲得的全長cDNA序列, 用Primer Premier 5.0設(shè)計特異性引物q-F/R (表1)進(jìn)行qRT-PCR檢測性成熟時期雌性個體的組織分布特點(diǎn)。反應(yīng)體系為: TB Green 12.5 μL, q-F/R 1.0 μL, cDNA 2.0 μL, RNase-free ddH2O 8.5 μL; 反應(yīng)程序?yàn)? 95 °C 30 s; 95 °C 5 s, 60 °C 45 s, 40次循環(huán); 擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置熔解曲線以確保所用引物在擴(kuò)增過程的特異性。每個組織3個生物學(xué)重復(fù), 每個樣品3個平行。內(nèi)參基因選用虎斑烏賊和基因(見表1)。

在數(shù)據(jù)處理與分析上, 以2–△△Ct方法進(jìn)行雙內(nèi)參計算、統(tǒng)計, 單因素方差分析和顯著性差異分析方法與朱陽(2020)一致。

1.5 SpFMRF及SpFaNaC的原位雜交

1.5.1 原位雜交探針制備 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)室獲得的序列及本研究中擴(kuò)增的序列設(shè)計制備探針的引物(表1), 反義探針在R引物前加上啟動子序列GATCACTAATACGACTCACTATAGG, 正義探針需在F引物前加上啟動子序列。經(jīng)PCR擴(kuò)增并測序的序列作為模板進(jìn)行探針制備, 反應(yīng)結(jié)束后利用RNA-Clean up kit純化反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物, 電泳檢測探針質(zhì)量, 核酸分析儀檢測濃度后分裝至–80 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 原位雜交 具體方法參照Zheng等(2020), 石蠟切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、乙醇梯度復(fù)水、蛋白酶K消化、4%多聚甲醛再固定后, 滴加預(yù)雜交液于42 °C預(yù)雜交2 h。加入3 ng/μL探針的雜交液于80 °C變性5 min后置于冰上備用。預(yù)雜交結(jié)束后, 棄掉預(yù)雜交液, 滴加雜交液于切片上, 于暗盒中50 °C孵育16 h。第二天, 孵育探針結(jié)束的組織切片經(jīng)梯度檸檬酸鈉緩沖液(saline sodium citrate buffer, SSC buffer )漂洗后, 滴加封閉液于室溫封閉2～3 h, 再與抗地高辛-AP抗體(1︰2 000) (Roche)室溫孵育2～3 h。一系列漂洗后, 進(jìn)行NBT/BCIP顯色、封片、拍照。

1.6 SpFMRFamide的免疫組化

利用Anti-FMRFamide抗體(ImmunoStar, USA)對虎斑烏賊腦組織中FMRFamide的表達(dá)分布進(jìn)行檢測, 具體步驟為: 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟處理, 100%- 95%-85%-70%乙醇中復(fù)水, 每次5 min; 將組織切片置于3% H2O2(PBS配置)室溫處理10 min, PBS漂洗; 滴加5% BSA室溫封閉20 min, 滴加Anti-FMRFamide抗體(1︰2 000) 4 °C過夜后PBS漂洗; 滴加二抗IgG (1︰1 000), 室溫30 min, PBS漂洗; 滴加SABC復(fù)合物, 室溫反應(yīng)30 min, PBS漂洗; DAB法顯色, 蘇木精復(fù)染后, 經(jīng)70%-85%-95%-100%乙醇復(fù)水處理, 每次3 min; 二甲苯再次透明、封片、拍照。

2 結(jié)果

2.1 SpFaNaC基因的cDNA信息

經(jīng)測序拼接得到cDNA全長2 090 bp (圖1), 其中包含5’-非編碼區(qū)(untranslated region, UTR) 262 bp, 3’-UTR 46 bp, 開放閱讀框(open reading frame, ORF) 1 782 bp, 編碼593個氨基酸。分子量MW為63.9 kDa, 理論等電點(diǎn)為12.5。SignalP在線預(yù)測FaNaC的N端沒有信號肽; SMART分析顯示FaNaC有2個跨膜區(qū)。預(yù)測FaNaC有6個糖基化位點(diǎn), 36個絲氨酸位點(diǎn)、22個蘇氨酸位點(diǎn)和12個酪氨酸位點(diǎn), 共有 70個磷酸化位點(diǎn)。預(yù)測該蛋白的三級結(jié)構(gòu): 包含α螺旋結(jié)構(gòu)(45%)、擴(kuò)展鏈(12%)和無規(guī)則卷曲(43%)。

圖1 虎斑烏賊FaNaC的核苷酸序列和預(yù)測的氨基酸序列

注: 起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)位于黑色線框內(nèi)。糖基化位點(diǎn)用黑色三角號在氨基酸下面標(biāo)出, 磷酸化位點(diǎn)位于紅色線框, 跨膜區(qū)域用淡灰色陰影表示

2.2 SpFaNaC的同源性分析

NCBI Blast序列比對結(jié)果顯示,FaNaC與頭足綱和腹足綱的FaNaC具有較高的相似性, 其中與真蛸預(yù)測的FaNaC序列相似性高達(dá)77%, 與中華章魚()為77%, 與雙斑蛸()為76%, 與散大蝸牛為45%, 與靜水椎實(shí)螺()為42%。

ClustalW對FaNaC進(jìn)行了多序列比對分析(圖2), 結(jié)果顯示FaNaC有 2個跨膜區(qū)(TM)、2個胞內(nèi)環(huán)(IL)和1個胞外環(huán)(EL)。蛋白的N端與C端都位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi), 中間絕大部分氨基酸位于胞外區(qū)。FaNaC蛋白在TM1區(qū)后80～90個氨基酸殘基處有一個與FMRFamide結(jié)合的特異性位點(diǎn)。

2.3 虎斑烏賊FaNaC的進(jìn)化分析

進(jìn)一步利用NCBI數(shù)據(jù)庫中篩選的16條代表性物種的FaNaC氨基酸序列, 通過Mega X軟件基于最大似然法(Bootstrap 10000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。結(jié)果顯示,FaNaC首先與曼氏無針烏賊FaNaC聚在一起, 頭足綱FaNaC與雙殼綱、腹足綱動物FaNaC聚為姐妹支, 腕足動物門和節(jié)肢動物門動物FaNaC作為外支, 其進(jìn)化分析結(jié)果與傳統(tǒng)的分類高度一致。

圖2 SpFaNaC的氨基酸序列(用▼表示)與其他物種的FaNaC多序列比對

注: 比對序列的GenBank登錄號為: 中華章魚(XP_029650472.1)、真蛸(QHX41573.1)、雙斑蛸(XP_014786424.1)、散大蝸牛(2202327A)、靜水椎實(shí)螺AAK20896.1)。相同的氨基酸殘基用黑色表示, 相似的氨基酸殘基用灰色表示。對比圖標(biāo)出了FaNaC的跨膜區(qū)(TM)、胞內(nèi)環(huán)(IL)、胞外環(huán)(EL)。紅框內(nèi)為FMRFamide的結(jié)合位點(diǎn)

圖3 基于SpFaNaC的蛋白序列和其他物種的相應(yīng)蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

注: 采用MEGA X軟件, 采用極大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。代表物種的GenBank號為: 真蛸(XP_029650472.1)、雙斑蛸(XP_014786424.1)、蝦夷扇貝() (XP_021342352.1)、福壽螺() (XP_025106862.1)、霸王蓮花青螺() (XP_009046425.1)、長牡蠣() (XP_011440507.1)、美洲牡蠣() (XP_022300062.1)、光滑雙臍螺() (XP_013063488.1)、加利福尼亞海兔() (AAY44399.2)、靜水椎實(shí)螺(AAK20896.1)、三旋卷麗螺() (AAF80601.1)、海豆芽() (XP_013400770.1)、美洲鱟() (XP_022239173.1)、大腹園蛛() (GBM10430.1)、散大蝸牛(2202327A)

2.4 SpFaNaC的組織分布

利用qRT-PCR技術(shù)通過2–△△Ct方法檢測了在成年虎斑烏賊的組織分布特點(diǎn), 結(jié)果如圖4所示:在檢測的所有組織中均有一定的表達(dá), 以鰓組織中的表達(dá)量作為參照設(shè)定為1。在各組織間的兩兩比較中, 腦和視葉的表達(dá)量顯著高于其他組織(<0.05), 其中, 在腦組織中表達(dá)量最高, 其他組織表達(dá)無顯著差異(<0.05)。

2.5 SpFMRFamide前體及SpFaNaC的原位雜交定位

2.5.1前體mRNA的組織原位定位 通過原位雜交方法對前體mRNA (同“”基因)在組織中的表達(dá)進(jìn)行了定位(圖5)。與正義探針處理的組織無任何雜交信號(圖5a)相比, 反義探針標(biāo)記后的視葉組織中清晰可見FMRFamide前體基因mRNA的陽性雜交信號, 主要分布在視葉的中央髓質(zhì)區(qū)、邊緣髓質(zhì)區(qū)、內(nèi)細(xì)胞顆粒層和外細(xì)胞顆粒層, 在邊緣髓質(zhì)區(qū)的陽性信號較少、強(qiáng)度較弱, 在網(wǎng)織層無陽性信號(圖5b)。同時, 在虎斑烏賊食道上神經(jīng)團(tuán)中出現(xiàn)了FMRFamide前體基因較為稀疏的陽性雜交信號(圖5c, 5d), 主要分布在食道上神經(jīng)團(tuán)的基葉、垂直葉和嗅葉中, 且以這三個亞葉交界處的信號最為集中。

圖4 SpFaNaC基因組織表達(dá)差異性分析

注: 結(jié)果表示均值±標(biāo)準(zhǔn)差(=3)。誤差線上標(biāo)不同的字母表示差異顯著(<0.05)。組織名稱縮寫: OL: 視葉; RE: 視網(wǎng)膜; ANG: 副纏卵腺; OV: 卵巢; HE: 心臟; NG: 纏卵腺; BR: 腦; ST: 胃; MU: 肌肉; IN: 腸道; SK: 皮膚; LI: 肝臟; PA: 胰臟; GI: 鰓

圖5 SpFMRF前體基因mRNA的視葉和腦的原位雜交定位

注: a. 視葉組織的正義探針對照組; b. 視葉組織的反義探針處理組; c. 食道上神經(jīng)團(tuán)的反義探針處理組; d. 圖3中黑色線框所標(biāo)注區(qū)域放大圖。藍(lán)色為陽性信號, 標(biāo)尺在圖片右下方顯示?？s寫: bl (basal lobes): 基葉; svl (subvertical lobe): 亞垂直葉; vl (vertical lobe): 垂直葉; olf (olfactory lobe): 嗅葉; med (medulla): 髓質(zhì); out.gr.cel (outer granule cells layer): 外顆粒細(xì)胞層; inn.gr.cel (inner granule cells layer): 內(nèi)顆粒細(xì)胞層; pl (plexiform zone): 網(wǎng)織層

2.5.2mRNA的組織原位定位mRNA在虎斑烏賊視網(wǎng)膜、視葉和腦組織中的原位雜交結(jié)果如圖6所示, 與正義探針無任何雜交信號相比(圖6a, 6c), 反義探針孵育后的各組織中能觀察到明顯的藍(lán)色陽性雜交信號。其中, 視網(wǎng)膜中能觀察到較為微弱的藍(lán)色陽性雜交信號, 且陽性信號存在于感光細(xì)胞的細(xì)胞體部分(圖6b); 視葉組織中也能清晰地觀察到mRNA的陽性雜交信號, 主要分布在深層視網(wǎng)膜的內(nèi)顆粒細(xì)胞層、外細(xì)胞顆粒層, 網(wǎng)織層和髓質(zhì)區(qū)域無陽性信號(圖6d); 在腦中也清晰地觀察到了大量的陽性雜交信號(圖6e, 6f, 6g, 6h), 雜交信號較多、較強(qiáng); 主要分布在垂直葉、亞垂直葉、基葉、足葉、嗅葉區(qū)域, 且大量的陽性信號同樣在這幾個亞葉的交界區(qū)最為集中。

注: a. 視網(wǎng)膜正義探針; b. 視網(wǎng)膜反義探針; c. 視葉正義探針; d. 視葉反義探針; e.mRNA在腦部基葉和亞垂直葉的原位雜交定位; f.mRNA在腦部嗅葉的原位雜交定位; g.mRNA在腦部垂直葉的原位雜交定位; h.mRNA在腦部足葉的原位雜交定位。黑色箭頭表示陽性信號(藍(lán)色), 標(biāo)尺顯示在圖片右下方。photoreceptor: 感光細(xì)胞感受器; ce.phot (photoreceptor cell body part): 感光細(xì)胞細(xì)胞體; ce.sup (supporting cell): 支持細(xì)胞; ce.ep (epithelial): 上皮細(xì)胞。med (medulla): 髓質(zhì); out.gr.cel (outer granule cells layer): 外顆粒細(xì)胞層; inn.gr.cel (inner granule cells layer): 內(nèi)顆粒細(xì)胞層; pl (plexiform zone): 網(wǎng)織層; bl (basal lobes): 基葉; vl (vertical lobe): 垂直葉; svl (subvertical lobe): 亞垂直葉; olf (olfactory lobe): 嗅葉; pel (pedal lobe): 足葉

2.6 SpFMRFamide成熟肽在虎斑烏賊腦中的定位

原位雜交實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)錄水平上分析了FMRFamide的組織定位, 本實(shí)驗(yàn)利用免疫組化技術(shù)進(jìn)一步研究其在蛋白水平上的組織分布定位, 如圖7所示: 與不加anti-FMRFamide抗體的對照中只有藍(lán)色細(xì)胞核無任何信號相比(圖7b, 7g), anti-FMRFamide抗體孵育后的視葉組織和食道上神經(jīng)團(tuán)明顯存在鐵銹色的陽性免疫信號。

其中, 在視葉組織的深層視網(wǎng)膜的網(wǎng)織層放射狀神經(jīng)纖維部位檢測到了大量的免疫陽性信號(圖7c, 7d), 外細(xì)胞顆粒層外緣也有較強(qiáng)的鐵銹色陽性免疫信號, 推測此部位可能是視葉組織與腦、視網(wǎng)膜相連接的神經(jīng)纖維; 在邊緣髓質(zhì)區(qū)中存在鐵銹色連接成的帶狀信號分布(圖7e), 在中央髓質(zhì)區(qū)也觀察到了零星的陽性免疫信號的分布(圖7f), 可見不規(guī)則的陽性免疫反應(yīng)信號沿傳入?yún)矤钌窠?jīng)纖維束向各個方向延伸。在腦食道上神經(jīng)團(tuán)中主要分布在垂直葉、亞垂直葉、嗅葉、視腺、背基葉和前基葉區(qū)域, 其中, 背基葉和嗅葉中的陽性信號密度較高于其他部位, 且這些區(qū)域存在的密集陽性信號呈擴(kuò)散狀(圖7h, 7i); 在背基葉和嗅葉兩個區(qū)域相連接交界區(qū)域的陽性信號最為集中, 且呈簇狀分布(圖7j, 7k, 7l)。總之, 陽性免疫信號主要集中于不同亞葉的邊緣, 在亞葉中心較少或幾乎無信號。

注: a. 視葉HE染色; b. 視葉對照組; c. 視葉FMRFamide表達(dá); d. 深層視網(wǎng)膜FMRFamide表達(dá); e～f. 視葉髓質(zhì)FMRFamide表達(dá); g. 食道上神經(jīng)團(tuán)對照組; h～l. 食道上神經(jīng)團(tuán)FMRFamide表達(dá)。黑色箭頭表示陽性信號(鐵銹色), 細(xì)胞核為藍(lán)色, 標(biāo)尺顯示在圖片的右下角。med (medulla): 髓質(zhì); out.gr.cel (outer granule cells layer): 外顆粒細(xì)胞層; inn.gr.cel (inner granule cells layer): 內(nèi)顆粒細(xì)胞層; pl (plexiform zone): 網(wǎng)織層; bl (basal lobes): 基葉; vl (vertical lobe): 垂直葉; svl (subvertical lobe): 亞垂直葉; dbl (dorsal basal lobe): 背基葉; abl (anterior basal lobe): 前基葉; olf (olfactory lobe): 嗅葉; ot (optic tract): 視神經(jīng)束; og (optic gland): 視腺

3 討論

3.1 神經(jīng)肽FMRFamide的內(nèi)分泌調(diào)控作用

Wells等1959年證明破壞視葉神經(jīng)將導(dǎo)致頭足類視腺和性腺的增生, 推測視葉和視腺具有抑制生殖系統(tǒng)的發(fā)育的調(diào)控作用(Wells, 1978)。1998年Le Gall等人提出FMRFamide是抑制腺體活動的活性物質(zhì)(Le Gall, 1988)。本研究中觀察到前體基因大量表達(dá)于視葉中, 在腦組織不同亞葉的交界區(qū)域也有少量分布, 推測FMRFamide可能在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮信息傳遞的作用; 課題組前期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)只有FMRFamide與GnRH共同刺激時會抑制卵巢細(xì)胞的分泌活動(Zhu, 2020), 推測在頭足類的生殖調(diào)控軸上, FMRFamide與GnRH存在某種未知的相互調(diào)控關(guān)系, 并且這種調(diào)控很可能直接影響生殖過程。

頭足類大腦的視覺分析系統(tǒng)位于視葉的深層視網(wǎng)膜, 而與運(yùn)動和記憶相關(guān)的功能區(qū)域位于髓質(zhì)區(qū)(Moore, 1919)。1998年, Cosmo和Cristo推測頭足類FMRFamide的主要轉(zhuǎn)錄表達(dá)區(qū)位于其食道上神經(jīng)團(tuán)的擬柄狀區(qū)和嗅葉, 并通過FMRFamide參與對生殖的調(diào)控(di Cristo, 2003)。本研究免疫組化結(jié)果觀察到FMRFamide的免疫信號大量存在于虎斑烏賊視葉的網(wǎng)織層、髓質(zhì)區(qū), 而這些信號終止于外顆粒細(xì)胞層; 在視葉外緣的視神經(jīng)束也有強(qiáng)烈的陽性信號。FMRFamide前體在虎斑烏賊視葉和嗅葉中的高度表達(dá)為支持頭足類通過視覺系統(tǒng)來調(diào)控FMRFamide的分泌, 進(jìn)而通過FMRFamide調(diào)控相應(yīng)生理功能這些觀點(diǎn)提供了有效支撐。Saidel(1982)研究證實(shí)了頭足類中存在開始于嗅葉終止于深層視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維, 可能這些來自視葉的神經(jīng)纖維一直將信號傳遞給了視網(wǎng)膜; 此外, 頭足類嗅葉的后小葉和中小葉中存在若干FMRFamide免疫反應(yīng)陽性的神經(jīng)細(xì)胞(di Cristo, 2003), di Cristo等(2003)也同樣推測視葉中的神經(jīng)肽FMRFamide來源于嗅葉, 這些報道與本研究中腦組織的背基葉和嗅葉中存在大量陽性免疫信號, 尤其在這兩個亞葉的組織交接區(qū)的結(jié)果相似。然而, 我們的研究并不完全支持這一觀點(diǎn), 本研究利用原位雜交和免疫組化技術(shù)檢測到在視葉中的表達(dá)顯著高于在嗅葉中的表達(dá)。頭足類的嗅葉一直被認(rèn)為是化學(xué)感受器官中的嗅覺器官(Bolshakov, 2002; Brockway, 2002), 來自嗅葉和擬柄狀區(qū)的全部信息被輸入到視網(wǎng)膜, 進(jìn)而調(diào)節(jié)感光細(xì)胞的活性。

據(jù)報道, 在軟體動物中, FMRFamide可以引起心臟興奮和心臟抑制, 調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的突觸傳遞, 調(diào)節(jié)內(nèi)臟和軀體肌肉, 調(diào)節(jié)唾液腺, 并在腎臟的滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用(Khan, 1998), 并且FMRFamide可以通過作用于心臟動脈瓣膜來調(diào)節(jié)血淋巴的分布(Mercier, 2003)。FaRPs在扇貝中刺激淀粉酶的分泌并且調(diào)節(jié)滲透壓, 有研究證明在蛭類中FMRFamide充當(dāng)抗利尿激素(Krajniak, 2005)。FMRFamide參與動物體的消化、生殖和滲透壓調(diào)節(jié)等多項(xiàng)生理活動, 其具體調(diào)控方式還需進(jìn)一步研究。

3.2 FaNaC介導(dǎo)的生理調(diào)控作用

到目前為止, 尚未描述FaNaC相互作用蛋白, 有趣的是, 散大蝸牛FaNaC (FaNaC)的C末端與I型PDZ結(jié)合基(S/T-x-V/L)具有同源性(Songyang, 1997), 推測FaNaC可能與含PDZ域的蛋白質(zhì)互作。本研究中在腦和視葉中有極高的表達(dá), 在視葉的深層視網(wǎng)膜、食道上神經(jīng)團(tuán)的各葉都有的陽性表達(dá)。FaNaC (Lingueglia, 1995)和靜水椎實(shí)螺FaNaC (FaNaC) (Perry, 2001)在神經(jīng)系統(tǒng)中和足肌中被檢測到, 并且FaNaC顯然比FaNaC分布更廣泛。但是, 海兔免疫組化結(jié)果表明該蛋白只在少量神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá), 此結(jié)果與電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果只有少量神經(jīng)元細(xì)胞具有依賴Na+的快速興奮性反應(yīng)相一致(Davey, 2001); 在哺乳動物細(xì)胞(Belkin, 1993)和非洲爪蟾()卵母細(xì)胞(Lingueglia, 1995)中異源表達(dá)FaNaC的生理特性類似于散大蝸牛的C2神經(jīng)元所表現(xiàn)的FMRFamide離子通道特性(Green, 1994)。Davey等的原位雜交結(jié)果顯示智利螺旋蝸牛()的C2神經(jīng)元和散大蝸牛足神經(jīng)節(jié)中的多巴胺神經(jīng)元中也存在FaNaC陽性表達(dá)(Davey, 2001), 表明GDN與FMRFamide神經(jīng)元之間可能存在互作關(guān)系。

FMRFamide與FaNaC互作引起細(xì)胞的快速去極化。FMRFamide對FaNaC的作用與其他突觸或神經(jīng)元配體-門控通道的激活相類似, 表達(dá)FMNa酰胺的神經(jīng)元存在于富含F(xiàn)MRFamide的神經(jīng)節(jié)中(Davey, 2001), 因此, 被FMRFamide激活的通道也許會在含有FMRFamide的神經(jīng)元形成的連接處參與突觸的迅速傳遞; GDN的電生理實(shí)驗(yàn)表明, FaNaC可能在突觸傳遞的終末過程中發(fā)生(Davey, 2001), 然而, FaNaC參與的突觸生理學(xué)仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在前期研究中, 電生理實(shí)驗(yàn)證實(shí)加州海兔(Ruben, 1986; Belkin, 1993)、靜水椎實(shí)螺(Skingsley, 1993; Perry, 2001)的神經(jīng)元受到FMRFamide刺激時會通過激活鈉離子通道的方式快速去極化; FaNaCs在各類神經(jīng)元中都有表達(dá), FMRFamide是FaNaCs的激活劑, 阿米洛利能抑制FMRFamide誘導(dǎo)的電流能, 而且這個影響的過程不受GPCR的活化, 同時, FMRFamide還可以調(diào)控ASICs酸電流(Kellenberger, 2015; Vick, 2015)。FMRFamide能夠顯著提高亮大蝸牛離體腦神經(jīng)節(jié)NO的合成水平, 而FaNaC的抑制劑鹽酸阿米洛利能夠顯著降低其產(chǎn)NO的水平, 說明在神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)NO的通路中, FMRFamide可以通過激活FaNaC將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)NO的產(chǎn)生(R?szer, 2004)。以上結(jié)果表明FMRFamide與Na+通道受體存在相互調(diào)控關(guān)系, 兩者具體互作方式有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究利用同源克隆和RACE技術(shù)獲得了虎斑烏賊神經(jīng)肽FMRFamide的Na+通道受體(FaNaC)的cDNA全長序列, 采用序列分析探討其與頭足綱、腹足綱和雙殼綱的相似性。采用qRT-PCR檢測到主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦和視葉, 并進(jìn)一步采用ISH對其在腦、視葉和視網(wǎng)膜進(jìn)行了定位。同時, 采用ISH和IHC技術(shù)觀察到神經(jīng)肽FMRFamide主要分布在視葉的中央髓質(zhì)區(qū)、邊緣髓質(zhì)區(qū)、內(nèi)細(xì)胞顆粒層和外細(xì)胞顆粒層。

朱陽, 2020. 虎斑烏賊兩種FMRFamide受體基因的克隆和FMRFamide功能研究初探[D]. 舟山: 浙江海洋大學(xué).

鄭小東, 林祥志, 王昭凱, 等, 2010. 日本無針烏賊全人工養(yǎng)殖條件下生活史研究[J]. 海洋湖沼通報(3): 24-28.

蔣霞敏, 符方堯, 李正, 等, 2008. 人工養(yǎng)殖曼氏無針烏賊生殖系統(tǒng)的解剖學(xué)與組織學(xué)研究[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 15(1): 63-72.

BELKIN K J, ABRAMS T W, 1993. FMRFamide produces biphasic modulation of the LFS motor neurons in the neural circuit of the siphon withdrawal reflex ofby activating Na+and K+currents [J]. Journal of Neuroscience, 13(12): 5139-5152.

BOLSHAKOV K V, ESSIN K V, BULDAKOVA S L,, 2002. Characterization of acid-sensitive ion channels in freshly isolated rat brain neurons [J]. Neuroscience, 110(4): 723-730.

BROCKWAY L M, ZHOU Z H, BUBIEN J K,, 2002. Rabbit retinal neurons and glia express a variety of ENaC/DEG subunits [J]. American Journal of Physiology: Cell Physiology, 283(1): C126-C134.

CAO Z H, SUN L L, CHI C F,, 2016. Molecular cloning, expression analysis and cellular localization of an LFRFamide gene in the cuttlefish[J]. Peptides, 80: 40-47.

COSCOY S, LINGUEGLIA E, LAZDUNSKI M,, 1998. The Phe-Met-Arg-Phe-amide-activated sodium channel is a tetramer [J]. Journal of Biological Chemistry, 273(14): 8317-8322.

DAVEY F, HARRIS S J, COTTRELL G A, 2001. Histochemical localisation of FMRFamide-gated Na+channels inand[J]. Journal of Neurocytology, 30(11): 877-884.

DI COSMO A, DI CRISTO C D, 1998. Neuropeptidergic control of the optic gland of: FMRF-amide and GnRH immunoreactivity [J]. Journal of Comparative Neurology, 398(1): 1-12.

DI CRISTO C, BOVI P D, DI COSMO A, 2003. Role of FMRFamide in the reproduction of: molecular analysis and effect on visual input [J]. Peptides, 24(10): 1525-1532.

DOCKRAY G J, 2004. The expanding family of -RFamide peptides and their effects on feeding behaviour [J]. Experimental Physiology, 89(3): 229-235.

DOMINGUES P M, SYKES A, ANDRADE J P, 2002. The effects of temperature in the life cycle of two consecutive generations of the cuttlefish(Linnaeus, 1758), cultured in the Algarve (South Portugal) [J]. Aquaculture International, 10(3): 207-220.

DURWARD R D, VESSEY E, O’DOR R K, 1980. Reproduction in the squid,: first observations in captivity and implications for the life cycle [J]. Journal of Northwest Atlantic Fishery Science(6): 7-13.

ESPINOZA E, CARRIGAN M, THOMAS S G,, 2000. A statistical view of FMRFamide neuropeptide diversity [J]. Molecular Neurobiology, 21(1/2): 35-56.

FURUKAWA Y, MIYAWAKI Y, ABE G, 2006. Molecular cloning and functional characterization of theFMRFamide- gated Na+channel [J]. Pflügers Archiv, 451(5): 646-656.

GREEN K A, FALCONER S W P, COTTRELL G A, 1994. The neuropeptide Phe-Met-Arg-Phe-NH2(FMRFamide) directly gates two ion channels in an identifiedneurone [J]. Pflügers Archiv, 428(3/4): 232-240.

GUAN Z H, KIM J H, LOMVARDAS S,, 2003. P38 MAP kinase mediates both short-term and long-term synaptic depression in[J]. Journal of Neuroscience, 23(19): 7317-7325.

KELLENBERGER S, SCHILD L, 2015. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. XCI. structure, function, and pharmacology of acid-sensing ion channels and the epithelial Na+channel [J]. Pharmacological Reviews, 67(1): 1-35.

KHAN H R, PRICE D A, DOBLE K E,, 1998. FMRFamide-related peptides, partial serotonin depletion, and osmoregulation in(Mollusca: Pulmonata) [J]. Journal of Comparative Neurology, 393(1): 25-33.

KRAJNIAK K G 2005. Annelid endocrine disruptors and a survey of invertebrate fmrfamide-related peptides [J]. Integrative and Comparative Biology, 45(1): 88-96.

LE GALL S, FéRAL C, VAN MINNEN J,, 1988. Evidence for peptidergic innervation of the endocrine optic gland inby neurons showing FMRFamide-like immunoreactivity [J]. Brain Research, 462(1): 83-88.

LI M J, WANG M, WANG W L,, 2019. The immunomodulatory function of invertebrate specific neuropeptide FMRFamide in oyster[J]. Fish & Shellfish Immunology, 88: 480-488.

LINGUEGLIA E, CHAMPIGNY G, LAZDUNSKI M,, 1995. Cloning of the amiloride-sensitive FMRFamide peptide-gated sodium channel [J]. Nature, 378(6558): 730-733.

MARTIN R, VOIGT K H, 1987. The neurosecretory system of the: a neurohemal organ [J]. Experientia, 43(5): 537-543.

MERCIER A J, FRIEDRICH R, BOLDT M 2003. Physiological functions of FMRFamide-like peptides (FLPs) in crustaceans [J]. Microscopy Research and Technique, 60(3): 313-324.

MOORE A R, 1919. The selective action of nicotine on the central nervous system of the squid,[J]. Journal of General Physiology, 1(5): 505-508.

PERRY S J, STRAUB V A, SCHOFIELD M G,, 2001. Neuronal expression of an FMRFamide-gated Na+channel and its modulation by acid pH [J]. Journal of Neuroscience, 21(15): 5559-5567.

PRICE D A, GREENBERG M J, 1977. Structure of a molluscan cardioexcitatory neuropeptide [J]. Science, 197(4304): 670-671.

R?SZER T, JENEI Z, GáLL T,, 2004. A possible stimulatory effect of FMRFamide on neural nitric oxide production in the central nervous system ofL. [J]. Brain, Behavior and Evolution, 63(1): 23-33.

R?SZER T, KAPPELMAYER J, NAGY G G, 2006. The neuropeptide FMRFamide can protect cells against apoptosis in the snail digestive gland [J]. Apoptosis, 11(2): 173-182.

R?SZER T, KISS-TóTH é D, 2014. FMRF-amide is a glucose- lowering hormone in the snail[J]. Cell and Tissue Research, 358(2): 371-383.

RUBEN P, JOHNSON J W, THOMPSON S, 1986. Analysis of FMRF-amide effects on Aplysia bursting neurons [J]. Journal of Neuroscience, 6(1): 252-259.

SAIDEL W M, 1982. Connections of the octopus optic lobe: an HRP study [J]. Journal of Comparative Neurology, 206(4): 346-358.

SALZET M, BULET P, WATTEZ C,, 1994. FMRFamide- related peptides in the sex segmental ganglia of the Pharyngobdellid leech: identification and involvement in the control of hydric balance [J]. European Journal of Biochemistry, 221(1): 269-275.

SKINGSLEY D R, BRIGHT K, SANTAMA N,, 1993. A molecularly defined cardiorespiratory interneuron expressing SDPFLRFamide/GDPFLRFamide in the snail Lymnaea: monosynaptic connections and pharmacology [J]. Journal of Neurophysiology, 69(3): 915-927.

SONGYANG Z, FANNING A S, FU C,, 1997. Recognition of unique carboxyl-terminal motifs by distinct PDZ domains [J]. Science, 275(5296): 73-77.

VAN HEUKELEM W F, 1976. Growth, bioenergetics and life-span ofand[D]. Honolulu, USA: University of Hawaii: 3-5.

VICK J S, ASKWITH C C, 2015. ASICs and neuropeptides [J]. Neuropharmacology, 94: 36-41.

WELLS M J, 1978. Octopus: physiology and behaviour of an advanced invertebrate [M]. London: Chapman and Hall.

ZHENG L B, QIU J Y, CHEN J,, 2020. Histopathological changes and piscidin 5-like location in infectedwith parasite[J]. Fish & Shellfish Immunology, 99: 52-58.

ZHU Y, SUN L L, WU J H,, 2020. An FMRFamide neuropeptide in cuttlefish: Identification, characterization, and potential function [J]. Molecules, 25(7): 1636.

FMRFAMIDE LOCALIZATION AND MOLECULAR CHARACTERIZATION, AND THE EXPRESSION OF ITS Na+CHANNEL RECEPTOR IN

CAO Hui-Min, ZHU Yang, GUO Zu-Ting, LI Shuang, ZHOU Xu, CHI Chang-Feng, ZHENG Li-Bing

(National and Provincial Joint Engineering Research Centre for Marine Germplasm Resources Exploration and Utilization, School of Marine Science and Technology, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

Many reports have showed that neuropeptides play pivotal regulatory roles in the neuroendocrine process. FMRFamide is an important representative member in neuropeptide family and involved in the physiological process. We cloned the full-length cDNA of FMRFamide Na+channel receptor gene in(designated) with homologous amplification and RACE (rapid-amplification of cDNA ends). The cDNA ofis 2090 bp length, including a 1782 bp opening reading frame (ORF), encoding 593 amino acid residues with none a signal peptide at N-terminal and 2 transmembrane (TM) regions. Sequence analysis showed thatshared higher identity with cephalopods, gastropods, and bivalve species, and clustered as sister branches. Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) results showedhad relative higher expression level in the central nervous system optic lobe and brain followed by heart and accessory nidamental gland.hybridization (ISH) results showed thatmRNA positive signals could be detected significantly in the inner cell granular layer and outer cell granular layer of the optic lobe, the photoreceptor cells of retina, the sub-lobes of supraoesophageal mass, and the positive signals are the most concentrated in the border area. In addition, ISH and immunohistochemical staining (IHC) results showed that FMRFamide mainly distributed in the central medullary area, peripheral medullary area, inner cell granular layer, and outer cell granular layer of the optic lobe. There were relatively few positive signals in the supraoesophageal mass, and the positive signals were most concentrated in the border area. This study provided a basis for studying the role of FMRFamide and its Na+channel receptors in the physiological process of.

; FMRFamide; FaNaC; expression localization;hybridization (ISH); immumohistochemical staining (IHC)

Q789; S931; S968

10.11693/hyhz20220400097

*國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 31872547號; 浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目, LY20C190007號。曹慧敏, 碩士研究生, E-mail: 13485312058@163.com

遲長鳳, 博士, 教授, E-mail: chicf@zjou.edu.cn; 鄭利兵, 博士, 助理研究員, E-mail: zhenglb@zjou.edu.cn

2022-04-13,

2022-06-19