李凌宇， 齊 昊， 高曉光*， 張校亮， 李曉春

(1.太原理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，山西太原 030024；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，山西太原 030001)

目前，我國現(xiàn)有心血管疾病患者約3.3億，遠(yuǎn)高于腫瘤及其它種類疾病[1,2]。研究表明，炎癥是導(dǎo)致心血管疾病的主要因素之一，炎癥標(biāo)志物的定量檢測對心血管疾病的早期診斷及治療具有重要意義[3,4]。超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C Reaction Protein,hs-CRP)是存在于人血漿中的一項能反映機體炎癥狀態(tài)的指標(biāo)。研究顯示，成人體內(nèi)hs-CRP大于3 μg/mL即表示存在心血管疾病風(fēng)險[5]。血清淀粉樣蛋白A(Serum Amyloid A,SAA)是一類由肝細(xì)胞合成，能反映機體感染情況的指標(biāo)。研究表明，SAA濃度與心血管疾病及其并發(fā)癥的嚴(yán)重程度相關(guān)，并被用于預(yù)測冠心病患者的死亡率[6]。綜上，hs-CRP和SAA雙重指標(biāo)對心血管疾病的早期診斷和風(fēng)險評估具有重要意義。

目前，檢測CRP和SAA的方法主要有免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、化學(xué)發(fā)光法等。2012年，Timucin等人提出了一種基于抗體陣列的免疫傳感器，利用酶聯(lián)免疫吸附的原理，實現(xiàn)了對SAA的快速定量檢測[7]。2020年，Bravin等人提出了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的免疫熒光傳感器，實現(xiàn)了對CRP的定量檢測[8]。2021年，Zhao等人提出了一種基于多孔有機框架材料Cd-MOF-74的免疫傳感器，通過將強導(dǎo)電性的金納米顆粒/氮化碳材料作為基底，采用差分脈沖伏安法檢測Cd-MOF-74中Cd2+的信號，實現(xiàn)了對CRP的高靈敏度定量檢測[9]。以上方法基本都能實現(xiàn)對CRP和SAA的快速定量檢測，但存在需要對生物分子進(jìn)行標(biāo)記、易受外界因素干擾和重現(xiàn)性差等缺點。因此，快速、免標(biāo)記、高靈敏度和抗干擾能力強的檢測方法已經(jīng)成為研究熱點。

石墨烯憑借其優(yōu)異的光學(xué)、電學(xué)和力學(xué)特性在材料、能源、生物醫(yī)學(xué)和藥物傳遞等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[10]。Ye等人發(fā)現(xiàn)在全反射條件下，不同厚度的石墨烯對s偏振光的吸收都遠(yuǎn)大于p偏振光[11]。Xing等人搭建了基于石墨烯偏振吸收的折射率傳感裝置，用于對單個癌細(xì)胞的檢測[12]。Jiang等人通過在石墨烯表面修飾抗體，實現(xiàn)了對兔IgG的高靈敏度檢測[13]。此外，石墨烯還被用于氣體傳感領(lǐng)域[14,15]。在本研究中，我們發(fā)展了基于石墨烯偏振吸收性質(zhì)的新型光學(xué)傳感技術(shù)，引入鎖相放大系統(tǒng)來消除環(huán)境光等外界因素的干擾，實現(xiàn)了對心血管疾病標(biāo)志物hs-CRP和SAA的高靈敏度定量檢測，為心血管疾病的早期診斷提供了新的方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Edge Dimension原子力顯微鏡(Bruker Corporation,德國)，inViaTMQontor?共焦顯微拉曼光譜儀(Renishaw,英國)，JSM-7900F熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡(JEOL,日本)，SR865A鎖相放大器(Stanford Research,美國)，ZEPTO-W6氧等離子刻蝕機(上海爾迪儀器科技有限公司)，KQ-400DE數(shù)控超聲波清洗機(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)，PSD Series紫外臭氧清洗機(Novascan Technologies,美國)，TKA-Genpure UV超純水系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific,美國)，KW-4A旋涂儀(Kemet Technology,美國)，MultiskanTMFC酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific,美國)。

氧化石墨烯(GO,昂星新型碳材料常州有限公司)，聚二甲基硅氧烷(PDMS,Dow Corporate,美國)，磷酸鹽緩沖溶液(PBS,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，兔免疫球蛋白G(rabbit IgG)、山羊抗兔免疫球蛋白G(goat anti rabbit IgG)、牛免疫球蛋白M(bovine IgM)、重組人C反應(yīng)蛋白(recombinant human CRP)、C反應(yīng)蛋白抗體(anti-CRP)、重組人血清淀粉樣蛋白A1(recombinant human SAA1)和血清淀粉樣蛋白A1抗體(anti-SAA1)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。人超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)ELISA試劑盒和人血清淀粉樣蛋白A1(SAA1)ELISA試劑盒購自上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司。牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC,0.4 mol/L)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS,0.1 mol/L)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。

圖1 光學(xué)傳感系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of optical sensing systema:helium-neon laser,b:polarizer,c:1/2 wave plate,d:chopper,e:sensor chip,f:diaphragm,g:Wollaston prism,h:balanced detector,i:lock-in amplifier,j:computer.

1.2 實驗裝置

如圖1所示，波長為632.8 nm的激光先后經(jīng)過偏振片和1/2波片成為偏振方向可調(diào)的線偏振光。之后，依次通過透鏡、斬波器和反射鏡以全反射角從棱鏡入射與石墨烯發(fā)生相互作用。傳感芯片上微流通道的兩端引出毛細(xì)塑料管，毛細(xì)塑料管連接注射器，由恒流注射泵驅(qū)動實現(xiàn)加樣。反射光經(jīng)過反射鏡、光闌和渥拉斯頓棱鏡，產(chǎn)生s偏振光和p偏振光。兩束光的光強差由平衡探測器采集，產(chǎn)生電壓信號，信號經(jīng)鎖相放大器降噪和放大，由計算機專用軟件采集并處理。

1.3 芯片的制備

芯片的制備主要由三部分組成。(1)還原氧化石墨烯(RGO)的制備：配制濃度為5 mg/mL的GO溶液，將GO溶液均勻地旋涂在經(jīng)親水處理的石英片上，放入管式爐，在95%Ar/5%H2氣氛中以800 ℃高溫還原，制備得到RGO，RGO通過范德華力結(jié)合在石英片表面。(2)微流通道的制備：將PDMS的預(yù)聚物A和交聯(lián)劑B以質(zhì)量比10∶1混合并攪勻，放入真空干燥箱中排出因攪拌產(chǎn)生的氣泡，隨后倒入預(yù)先制備好的模板上，在75 ℃下加熱2 h，使其完全固化。將固化的PDMS取下，在通道的兩端打孔完成制備。微流通道的尺寸為10 mm×2 mm×1.2 mm。(3)RGO與PDMS的鍵合：RGO和PDMS用紫外臭氧清洗機處理15 min，然后立即把RGO和PDMS貼合在一起，75 ℃下加熱3 h，完成傳感芯片的制備。實驗中，使用恒流注射泵將微流通道內(nèi)注滿待測溶液進(jìn)行檢測，檢測過程僅需要24 μL待測溶液。

1.4 RGO的表面活化與修飾

實驗中需要對RGO的表面進(jìn)行活化，以實現(xiàn)后續(xù)抗體在RGO表面的固定。首先，向微流通道中依次注入PBS、EDC/NHS混合溶液，用來活化RGO表面的含氧官能團。30 min后，再注入PBS，沖洗3 min。然后注入抗體溶液(山羊抗兔IgG或anti-CRP或anti-SAA1,250 μg/mL)，抗體以共價結(jié)合的方式固定在RGO表面。再注入封閉液BSA(10 mg/mL)，阻斷RGO表面的非特異性結(jié)合。最后，注入PBS清洗微流通道，以PBS的信號作為基線。在整個過程中，恒流注射泵提供的流速為80 μL/min。

1.5 抗原的檢測

首先，用PBS配制不同濃度的兔IgG，將其注入RGO表面固定有山羊抗兔IgG的傳感芯片中?？乖贵w發(fā)生特異性結(jié)合，此時可以觀察到信號變化，待信號穩(wěn)定后，注入PBS沖洗掉多余的抗原。再注入甘氨酸(0.01 mol/L,pH=2)，使抗原從抗體上解離。最后注入PBS沖洗，信號回到基線。同樣地，用PBS配制不同濃度的hs-CRP和SAA1，將它們分別注入RGO表面固定有對應(yīng)抗體的傳感芯片中，用計算機上的數(shù)據(jù)采集軟件記錄整個過程中的信號變化，其中每個濃度重復(fù)檢測3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測原理

圖2為RGO表面抗原抗體特異性結(jié)合的示意圖。如圖2A所示，首先要對RGO表面進(jìn)行活化，這有利于后續(xù)抗體的固定。圖2B為抗體通過氨基和羧基的共價結(jié)合固定在RGO表面。圖2C為當(dāng)抗原注入微流通道時，抗原和RGO表面的抗體發(fā)生特異性結(jié)合的示意圖。這種特異性結(jié)合會引起RGO表面折射率的變化，導(dǎo)致平衡探測器檢測到的p偏振光和s偏振光的光強差發(fā)生變化，從而實現(xiàn)對抗原的定量檢測。

圖2 (A)石英片上RGO的示意圖；(B)RGO表面固定有抗體的示意圖；(C)RGO表面抗原抗體結(jié)合的示意圖Fig.2 (A)Schematic diagram of RGO on a quartz plate;(B)Schematic diagram of the antibody immobilized on the surface of RGO;(C)Schematic diagram of the binding of antigen and antibody on the RGO surface

圖3 (A)GO和RGO的拉曼光譜；(B～E)分別為RGO的EDS元素分析結(jié)果、EDS圖、AFM圖和SEM圖Fig.3 (A)Raman spectra of GO and RGO;(B)EDS elemental analysis results,(C)EDS image,(D)AFM image and (E)SEM image of RGO

2.2 RGO的表征分析

實驗中用到的RGO是通過高溫還原GO的方法制備的。圖3A為GO和RGO的拉曼光譜圖。圖中RGO樣品ID/IG(拉曼光譜圖中D峰強度與G峰強度的比值)比GO大，證明高溫還原過程中形成了品質(zhì)較高的石墨烯[16,17]。圖3B和圖3C為RGO樣品的能譜儀(EDS)元素分析結(jié)果。其中Si元素和O元素來源于SiO2基底，C元素來源于RGO。從EDS的結(jié)果可以看出，RGO的制備過程沒有雜質(zhì)引入。此外，圖3D為RGO的原子力顯微鏡(AFM)圖，可以看出實驗中用到的RGO厚度在8 nm左右，其厚度可以通過改變GO溶液的濃度和旋涂儀的轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)。圖3E為RGO樣品的掃描電子顯微鏡(SEM)圖。從圖中可以看出，RGO表面除了些許碎片外，整個樣品十分平整，形成了均勻的薄膜。

2.3 傳感系統(tǒng)的靈敏度和折射率分辨率

運用多層介質(zhì)膜傳輸理論可以定量計算RGO對光的反射、吸收和透射。圖4A為不同厚度的RGO對偏振光的反射率差值隨入射角度的變化關(guān)系。從圖4A可以看出，當(dāng)RGO厚度為8 nm，入射角度為全反射角時，RGO對s偏振光和p偏振光的反射率差值ΔR最大，對折射率變化最為敏感。如圖4B所示，不同濃度的NaCl具有不同的折射率，會引起該傳感系統(tǒng)信號的變化。根據(jù)相關(guān)公式[12]，計算出該傳感系統(tǒng)的靈敏度和折射率分辨率分別為2.14×107mV/RIU和4.67×10-9。

圖4C和圖4D分別是該傳感系統(tǒng)的靈敏度和折射率分辨率隨RGO表面介質(zhì)折射率變化的曲線，可以看出，介質(zhì)的折射率在1.33～1.40范圍內(nèi)，靈敏度和折射率分辨率都會隨介質(zhì)折射率的降低而大幅增加，即表面介質(zhì)的折射率越接近1.33(純水的折射率)，靈敏度和折射率分辨率越高，這為檢測超低濃度的生物分子以及疾病標(biāo)志物提供了理論支持。

圖4 (A)理論模擬不同厚度RGO對偏振光反射率的差值隨入射角度的變化關(guān)系；(B)不同濃度NaCl注入時傳感系統(tǒng)的響應(yīng)，插圖顯示了該傳感系統(tǒng)的噪聲幅值；(C)傳感系統(tǒng)的靈敏度和(D)折射率分辨率隨RGO表面介質(zhì)折射率(n)的變化關(guān)系Fig.4 (A)Theoretical simulation of the relationship between the difference in the reflectivity of polarized light of RGO with different thicknesses and the angle of incidence;(B)Response of the sensing system with different concentrations of NaCl.The illustration shows the noise amplitude of the sensing system;(C)Relationship between the sensitivity and (D)refractive index resolution of the sensing system and the refractive index of the RGO surface medium

2.4 兔IgG的定量檢測

該傳感系統(tǒng)首先被用于兔IgG的檢測。圖5A為固定抗體的過程中傳感信號隨時間的變化關(guān)系，把PBS的信號作為基線，注入EDC/NHS后，由于微流通道內(nèi)RGO表面的折射率發(fā)生變化，信號也隨之發(fā)生變化。30 min后注入PBS，信號回落但沒有回到初始基線，說明RGO表面活化完成。再注入250 μg/mL的山羊抗兔IgG溶液，待穩(wěn)定后注入PBS沖洗，信號下降但并沒有回到基線，證明山羊抗兔IgG已經(jīng)成功固定在RGO表面。之后，把PBS的信號作為新的基線，注入25 μg/mL的兔IgG溶液，微流通道內(nèi)的兔IgG會被RGO上固定的山羊抗兔IgG特異性捕獲，導(dǎo)致信號增大，待信號穩(wěn)定后再注入PBS沖洗掉未結(jié)合的兔IgG，整個過程如圖5B所示。該傳感系統(tǒng)對不同濃度兔IgG的檢測結(jié)果如圖5C所示，在0.025～25 μg/mL濃度范圍內(nèi)檢測結(jié)果具有很好的線性，校準(zhǔn)曲線為y=0.969x+0.369，檢測的最低濃度為0.025 μg/mL。通過測量20個空白樣品的信號，計算得到該傳感系統(tǒng)對兔IgG的檢測限為0.014 μg/mL。

圖5 (A)抗體的固定過程；(B)兔IgG的實時檢測結(jié)果圖；(C)不同濃度兔IgG的檢測結(jié)果Fig.5 (A)Antibody fixing process;(B)Real-time detection results of rabbit IgG;(C)Detection results of different concentrations of rabbit IgG

2.5 心血管疾病標(biāo)志物的定量檢測及準(zhǔn)確性考察

為了評估該傳感系統(tǒng)對于心血管疾病標(biāo)志物的檢測性能，選用hs-CRP和SAA1作為檢測指標(biāo)進(jìn)行了實驗。圖6A、圖6C分別為該傳感系統(tǒng)對不同濃度hs-CRP及SAAI的檢測結(jié)果。從圖中可以看出該傳感系統(tǒng)信號與hs-CRP及SAAI的濃度線性范圍均為0.1～25 μg/mL范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出很好的線性，hs-CRP 校準(zhǔn)曲線為y=0.888x+0.305，檢測限為0.020 μg/mL；SAAI校準(zhǔn)曲線為y=0.809x+0.439，檢測限為0.023 μg/mL。兩者的檢測限均遠(yuǎn)低于臨床檢測標(biāo)準(zhǔn)10 μg/mL。此外，該傳感系統(tǒng)對生物分子檢測的特異性也得到了驗證。用固定有hs-CRP和SAA1抗體的傳感芯片分別檢測濃度為20 μg/mL的hs-CRP，兔IgG，牛IgM和SAA1，實驗結(jié)果如圖6B和圖6D所示，hs-CRP和SAA1信號較強，其他生物分子的信號較弱，表明該傳感系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)對生物分子的特異性檢測。

為了驗證本研究中傳感系統(tǒng)的準(zhǔn)確性和可靠性，我們用該傳感系統(tǒng)與商用酶標(biāo)儀分別測定相同濃度的hs-CRP和SAA1，并將結(jié)果進(jìn)行對比。配制不同濃度的hs-CRP標(biāo)準(zhǔn)樣品(16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL)和SAA1標(biāo)準(zhǔn)樣品(24 μg/mL、12 μg/mL、6 μg/mL、3 μg/mL、1.5 μg/mL、0.75 μg/mL)，將傳感系統(tǒng)測定的電壓值與商用酶標(biāo)儀測得的吸光度值進(jìn)行擬合，結(jié)果如圖6E和圖6F所示，兩種儀器的測定結(jié)果呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性，證明基于石墨烯偏振吸收性質(zhì)的光學(xué)傳感系統(tǒng)可以準(zhǔn)確檢測hs-CRP和SAA1的濃度。

圖6 (A)不同濃度hs-CRP的檢測結(jié)果；(B)傳感系統(tǒng)對hs-CRP的特異檢測；(C)不同濃度SAA1的檢測結(jié)果；(D)傳感系統(tǒng)對SAA1的特異檢測；(E)傳感系統(tǒng)和商用酶標(biāo)儀對hs-CRP檢測結(jié)果的相關(guān)性；(F)傳感系統(tǒng)和商用酶標(biāo)儀對SAA1檢測結(jié)果的相關(guān)性Fig.6 (A)Detection results of different concentrations of hs-CRP;(B)Specific detection of hs-CRP by the sensor system;(C)Detection results of different concentrations of SAA1;(D)Specific detection of SAA1 by the sensor system;(E)Correlation between the detection results of hs-CRP by the sensing system and the commercial microplate reader;(F)Correlation between the detection results of the SAA1 by the sensing system and the commercial microplate reader

3 結(jié)論

本文利用石墨烯在全反射條件下對不同偏振光吸收的不同，發(fā)展了一種基于石墨烯偏振吸收性質(zhì)的新型光學(xué)傳感技術(shù)。引入鎖相放大系統(tǒng)，消除了環(huán)境光和震動等外界因素的干擾。通過在石墨烯表面修飾抗體，檢測抗原抗體特異性結(jié)合時引起的折射率變化，該傳感系統(tǒng)實現(xiàn)了對心血管疾病標(biāo)志物hs-CRP和SAA的高靈敏度定量檢測。基于石墨烯偏振吸收性質(zhì)的光學(xué)傳感技術(shù)具有免標(biāo)記、高靈敏度和微體積檢測的優(yōu)點，對心血管疾病的早期診斷及風(fēng)險評估具有重要意義。