吳易峰

(1.廈門(mén)海關(guān)技術(shù)中心，福建廈門(mén) 361026;2.徐敦明職工創(chuàng)新工作室，福建廈門(mén) 361026)

我國(guó)作為傳統(tǒng)的茶葉生產(chǎn)大國(guó)，隨著茶葉生產(chǎn)數(shù)量不斷增多、各種新型農(nóng)藥的發(fā)展，致使茶葉中有大量的農(nóng)藥殘留問(wèn)題[1]。歐盟是我國(guó)茶葉主要出口地之一[2]，對(duì)茶葉農(nóng)藥殘留有相關(guān)規(guī)定[3]。2021年9月國(guó)家實(shí)施新的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2021,規(guī)定了茶葉中106種農(nóng)藥及其代謝物的最大殘留量[4]，并推薦一共超過(guò)16個(gè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，其中包含氣相色譜-質(zhì)譜的混標(biāo)方法[5 - 7]。茶葉檢測(cè)方法繁多，從前處理到儀器種類各不相同，單一檢測(cè)方法難以滿足實(shí)際檢測(cè)需求。

人們對(duì)茶葉中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)技術(shù)已有大量的研究[8 - 12]，其中氣相色譜法作為農(nóng)藥殘留檢測(cè)的方法，需要配備不同的檢測(cè)器[13,14]，如電子捕獲檢測(cè)器(ECD)、火焰光度檢測(cè)器(FPD)、氮磷檢測(cè)器(NPD)等，對(duì)茶葉中殘留的擬除蟲(chóng)菊酯[15]、有機(jī)氯[16]、有機(jī)磷[17]等其他化學(xué)農(nóng)藥檢測(cè)有著靈敏度高的特點(diǎn)。但是由于茶葉基質(zhì)干擾以及農(nóng)藥理化性質(zhì)差異,使得氣相方法很難滿足一次性前處理、一次進(jìn)樣分析不同種類農(nóng)藥殘留量，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留分析困難，成本偏高等問(wèn)題。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，自身對(duì)于非極性物質(zhì)難離子化，導(dǎo)致其對(duì)于有機(jī)氯，擬除蟲(chóng)菊酯等常用農(nóng)藥的檢測(cè)靈敏度不足，因此氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法成為茶葉農(nóng)殘檢測(cè)中最常用的檢測(cè)方法，可以同時(shí)檢測(cè)茶葉中多種農(nóng)藥[18 - 21]。本文基于GB 2763-2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-食品中農(nóng)藥最大殘留限量》的農(nóng)藥限量，進(jìn)一步完善國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，加入溴蟲(chóng)腈，醚菊酯，氟蟲(chóng)睛代謝物，五氯硝基苯代謝物，虱螨脲，四螨嗪等尚未建立國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的農(nóng)藥，優(yōu)化定量限，建立對(duì)茶葉多種農(nóng)藥殘留的氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(TQ-8040，日本Shimadzu)；固相萃取裝置(美國(guó)Supelco)；氮吹儀(瑞典Biotage)；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore)；渦旋混勻器(IKA 3 Basic，德國(guó)IKA)；石墨化炭柱(0.5 g,6 mL,美國(guó)Supelco)。

正己烷、乙酸乙酯、乙腈(色譜純，德國(guó)Merck)；其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。所檢測(cè)的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均來(lái)自Dr.Ehrenstorfer,純度96.5%～99.7%。

準(zhǔn)確稱取10.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷定容至10 mL配制成1 000 mg/L的儲(chǔ)備液并儲(chǔ)存在-4 ℃冰箱中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用，正己烷稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 樣品前處理

試樣制備：取500 g茶葉樣品，粉碎后充分混勻，放入密封袋中。稱取5.00 g(精確至0.01 g)樣品于25 mL離心管中，加入10 mL水浸泡30 min，加入20 mL正己烷，渦旋振蕩2 min，以4 000 r/min離心5 min；取上層于試管中，再用20 mL正己烷提取，以4 000 r/min離心5 min，取上層正己烷提取液，45 ℃水浴氮吹濃縮至約2 mL，待凈化。

將石墨化炭小柱裝在固相萃取裝置上，先用5 mL丙酮淋洗活化小柱，保持流速約1 mL/min，將吹至約2 mL的濃縮液倒入石墨化碳小柱，用約20 mL淋洗液(正己烷-丙酮，體積比2∶1)洗脫，收集所有流出物，置于45 ℃水浴氮吹至近干，用2 mL正己烷溶解殘?jiān)郎y(cè)。

空白樣品：經(jīng)檢測(cè)所有農(nóng)藥均未檢出的烏龍茶。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：石英毛細(xì)管柱Rxi-5MS-sil(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；傳輸線溫度：300 ℃；載氣：氦氣，純度≥99.999%；流速1.2 mL/min；不分流進(jìn)樣，1 min后開(kāi)閥。色譜柱溫度：初始溫度60 ℃，保持0.5 min，以25 ℃/min上升至180 ℃，以10 ℃/min上升至300 ℃保持10 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件離子源：EI源，燈絲電壓70 eV；離子源溫度：230 ℃；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。經(jīng)優(yōu)化后農(nóng)藥多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件如表1。

表1 83種農(nóng)藥定性、定量離子對(duì)和質(zhì)譜分析參數(shù)

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑選擇

常用的農(nóng)藥提取溶劑有乙腈，正己烷，乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)空白樣品加標(biāo)分別用乙腈、正己烷、乙酸乙酯作為提取劑，比對(duì)其回收率，結(jié)果如圖1。如圖可見(jiàn)正己烷和乙腈擁有更好的回收率，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[5 - 7]使用乙腈作為提取溶劑，實(shí)際操作中乙腈沸點(diǎn)較高，通過(guò)溶劑轉(zhuǎn)換時(shí)間長(zhǎng)，效率低。若直接使用乙腈進(jìn)樣容易造成樣品超載和柱流失，不利于儀器使用和大批量的進(jìn)樣，故最后使用正己烷作為提取試劑。

2.2 凈化條件優(yōu)化

茶葉提取液中通常含有非常多的色素、生物堿和一些有機(jī)酸，為了減少對(duì)儀器的損耗和降低儀器基質(zhì)效應(yīng)，茶葉提取液的凈化尤為重要。參照文獻(xiàn)方法[8]首先采用凈化能力很強(qiáng)的石墨化炭復(fù)合中性氧化鋁固相萃取小柱，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中性氧化鋁極性大，對(duì)極性物質(zhì)(如甲拌磷，水胺硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥)吸附很強(qiáng)，洗脫回收率較低，結(jié)合實(shí)際需求，不復(fù)合使用中性氧化鋁，選用單一石墨化碳固相萃取小柱凈化。凈化前后的回收率如圖2所示，可以看到在除去大部分色素之后，對(duì)于檢測(cè)農(nóng)藥回收率沒(méi)有很大影響。

圖1 不同提取劑的提取效果對(duì)比Fig.1 Comparison of extraction efficiency of different extractants

圖2 凈化效果的比較Fig.2 Comparison of purification effects

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)GC-MS/MS母離子和子離子一一對(duì)應(yīng)的多反應(yīng)檢測(cè)模式，通過(guò)設(shè)定多個(gè)時(shí)間段和掃描通道同時(shí)分析多種農(nóng)藥成分，先通過(guò)氣相色譜對(duì)其進(jìn)行分離，應(yīng)用電子轟擊源(EI源)對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行電離，確定農(nóng)藥的出峰時(shí)間和一級(jí)碎片離子，選擇離子強(qiáng)度高的一級(jí)碎片作為母離子，碎片掃描模式對(duì)母離子在不同碰撞能量下進(jìn)行二次電離，選擇信號(hào)較強(qiáng)的二級(jí)碎片離子作為子離子，以產(chǎn)生信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)的碰撞能量作為最終優(yōu)化碰撞能量。待測(cè)農(nóng)藥的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)條件見(jiàn)表1，相較于其他使用三重四級(jí)桿的文獻(xiàn)方法[7,15,17,21]，本文大部分農(nóng)藥多提供了一對(duì)定性離子對(duì)，進(jìn)一步避免假陽(yáng)性的情況發(fā)生，總離子流圖見(jiàn)圖3。

圖3 83種農(nóng)藥的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram for multi reaction monitoring of 83 pesticides The peak numbers denoted were the same as those listed in Table 1.

2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與定量限

在確定的最佳儀器分析條件下，配制待測(cè)農(nóng)藥濃度依次為5、10、50、100、500 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)組分的峰面積(y)對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x,μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果顯示，待測(cè)農(nóng)藥在5～500 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

采用標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)定,向空白茶葉中添加83種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以定量離子對(duì)信噪比(S/N)大于3的濃度為檢出限，以定量離子對(duì)S/N大于10的濃度為定量限。詳見(jiàn)表2,每種農(nóng)藥的定量限均能滿足相關(guān)法規(guī)的要求[3,4]。

2.5 方法回收率與精密度

在空白茶葉樣品中添加不同濃度的待測(cè)農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中農(nóng)藥含量的濃度為50、100、500 μg/kg，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平濃度下做6個(gè)平行樣，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看目標(biāo)分析物的回收率均在70%～110%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.2%～11.6%之間，其中有機(jī)磷的回收率在75.2%～95.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.9%～11.2%之間，有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯的回收率在70%～97.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.7%～11.6%?；厥章逝c精密度都符合農(nóng)藥殘留分析要求，待測(cè)農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表2。

表2 83種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)

(續(xù)表2)

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法對(duì)某樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)該樣品檢出溴蟲(chóng)腈0.046 mg/kg，氯氟氰菊酯0.025 mg/kg，若按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[5,7]進(jìn)行檢測(cè)則須出證為未檢出，可見(jiàn)本方法擁有更高的靈敏度以滿足日常檢測(cè)需求，對(duì)近期進(jìn)口的100個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中溴蟲(chóng)腈，戊唑醇，苯醚甲環(huán)唑，氯氟氰菊酯，氯氰菊酯，唑蟲(chóng)酰胺檢出率為23%，25%，53%，52%，47%，74%，部分陽(yáng)性樣品的譜圖如圖4所示，從樣品的譜圖上看通過(guò)氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)可以很好的除去茶葉中雜質(zhì)的干擾，通過(guò)提取離子對(duì)的方式可以有效降低基線和減少雜峰的干擾，可以提高農(nóng)殘檢測(cè)的靈敏度。

圖4 部分陽(yáng)性樣品的色譜圖Fig.4 Chromatograms of some positive samples

3 結(jié)論

建立了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測(cè)茶葉中多種農(nóng)藥殘留的方法，樣品經(jīng)過(guò)超純水浸泡，用正己烷液液萃取，石墨化炭固相萃取小柱凈化，待測(cè)農(nóng)藥的檢出限均能達(dá)到檢測(cè)要求。該方法前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，一次前處理就可以同時(shí)檢測(cè)83種農(nóng)藥，為茶葉農(nóng)殘檢測(cè)提供了一種快速可行的方法。