高 靜，米 雪，周 琦，周 君

（中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 211198）

RNA 修飾在生命活動(dòng)和疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。目前，已鑒定的RNA 修飾達(dá)150余種，這些修飾廣泛分布于信使RNA（messenger RNA，mRNA）、核糖 體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）、核內(nèi)小RNA（small nuclear RNA，snRNA）和核仁小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）等各種RNA 上。RNA 修飾的種類繁多，不同類型的RNA 修飾的含量和功能存在較大差異［1］。其中RNA 甲基化修飾約占RNA 修飾的60%以上，是RNA 修飾的主要形式之一。甲基化修飾發(fā)生在RNA 上的位置主要是堿基的氮原子（N）、嘌呤和嘧啶的碳原子（C）、2'-OH 的氧原子（O）上。常見的RNA 甲基化修飾類型有N6-甲基腺嘌呤（m6A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）、1-甲基腺嘌呤（m1A）、5-羥甲基胞嘧啶（hm5C）、假尿嘧啶（Ψ）等，它們?cè)诎麅?nèi)行使不同的生物學(xué)功能。而m6A修飾作為其中具有代表性的修飾之一，也是目前研究最為透徹的一種RNA修飾類型［2］。

深入研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾及其效應(yīng)蛋白與多種生理和病理過(guò)程密切相關(guān)［3］。例如，m6A 去甲基化酶FTO 的高表達(dá)與急性髓系白血?。?］、肺癌［5-6］等癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其另一去甲基化酶ALKBH5 也可通過(guò)影響m6A 修飾水平從而促進(jìn)包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［7］和胃癌［8］在內(nèi)的多種腫瘤進(jìn)展，因此通過(guò)小分子靶向干預(yù)m6A 效應(yīng)蛋白可作為抗腫瘤的新策略。

本文總結(jié)了有關(guān)m6A修飾的研究成果，闡述了其效應(yīng)蛋白的類型、作用方式、生物學(xué)功能以及m6A 去甲基化酶FTO 和ALKBH5 抑制劑的開發(fā)進(jìn)展，為全面了解m6A去甲基化酶作為疾病診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物提供了理論基礎(chǔ)。

1 m6A甲基化修飾

1974年，Desrosiers 等［2］在 哺 乳 動(dòng) 物 細(xì) 胞 的mRNA 中發(fā)現(xiàn)了m6A 的存在，即腺嘌呤第6 位氮原子上發(fā)生的單甲基化。但由于缺乏穩(wěn)定的分析方法，m6A 的分布、功能以及作用機(jī)制研究很長(zhǎng)時(shí)間處于停滯不前的狀態(tài)。直到2011年，芝加哥大學(xué)何川教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了第1 個(gè)m6A 去甲基化酶——FTO［9］，它可以去除mRNA 內(nèi)部的m6A 修飾，揭示m6A是一種可逆化修飾，由此開創(chuàng)并引發(fā)表觀轉(zhuǎn)錄組 學(xué) 的 研 究 熱 潮。2012年，Dominissini 等［10］和Meyer 等［11］獨(dú)立報(bào)道了全轉(zhuǎn)錄組水平m6A 的高通量測(cè)序方法（m6A-seq 或MeRIP-seq），為人們進(jìn)一步研究m6A 奠定了非常堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。高通量測(cè)序研究結(jié)果表明，m6A 修飾是真核生物mRNA 中豐度最高的甲基化修飾形式，它廣泛存在于病毒RNA、酵母、果蠅、植物及哺乳動(dòng)物等真核生物中，并且m6A修飾位點(diǎn)附近的序列具有高度保守性，傾向于發(fā)生在RRACH（R=G/A，H=A/C/U）序列的腺嘌呤上，這些位點(diǎn)主要分布在RNA 的3'UTR、終止密碼子或者長(zhǎng)外顯子附近，且該分布特征在人類及小鼠中是高度保守的［12］。

研究表明，m6A修飾是一種動(dòng)態(tài)可逆的調(diào)節(jié)方式，它受m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶（m6A writers）和去甲基化酶（m6A erasers）的共同調(diào)控，能夠被m6A 識(shí)別蛋白（m6A readers）選擇性的識(shí)別結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能［3］。目前已發(fā)現(xiàn)的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的主要成分包括

METTL3、METTL14［13］、WTAP［14］、KIAA1429（VIRMA）［15］、RBM15［16］、HAKAI［17］、ZC3H13（KIAA0853）［18］和METTL16［19］等，它們能夠催化S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）的甲基轉(zhuǎn)移到腺嘌呤的第6 位氮原子上。而FTO［9］和ALKBH5［20］作為去甲基化酶能動(dòng)態(tài)可逆地去除靶RNA的m6A 甲基化修飾。m6A 修飾的生物學(xué)功能主要是通過(guò)m6A識(shí)別蛋白發(fā)揮調(diào)控作用的，目前已知的識(shí)別蛋白主要有YTH 結(jié)構(gòu)域蛋白（YTHDF1［21］、YTHDF2［22］、YTHDF3［23］、YTHDC1 和YTHDC2）、核不均一核糖核蛋白HNRNP 家族蛋白（HNRNPA2B1［24］、HNRNPC 和HNRNPG）和胰島素樣生長(zhǎng)因 子2 mRNA 結(jié) 合 蛋 白IGF2BP 家 族 蛋 白［25］（IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3）。通過(guò)m6A 識(shí)別蛋白的結(jié)合，不僅可以影響mRNA 的穩(wěn)定性、促進(jìn)蛋白翻譯效率、調(diào)控mRNA 與miRNA 的剪接和促進(jìn)mRNA 出 核［26］。m6A 也 可以干 擾底物RNA 的結(jié)構(gòu)，作為“結(jié)構(gòu)開關(guān)”調(diào)控HNRNPC 與RNA 的結(jié)合［27］。此外，m6A 參與了多種生物學(xué)過(guò)程［28］，如干細(xì)胞分化、細(xì)胞分裂、配子發(fā)生和生物節(jié)律等，以及多種疾病的發(fā)生［29］，包括腫瘤、肥胖、神經(jīng)性疾病和不育等，在個(gè)體發(fā)育及生理病理調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。

2 m6A去甲基化酶

AlkB家族作為鐵（Ⅱ）和酮戊二酸（2-OG）依賴性加氧酶是一種重要的核酸脫甲基酶，圖1展示了9 個(gè)AlkB 人類同源蛋白的基因結(jié)構(gòu)，通過(guò)保守性分析發(fā)現(xiàn)它們都擁有“HXD…H”（X 表示任何氨基酸）和“R…R”兩個(gè)基序，已知這兩個(gè)基序分別在鐵（Ⅱ）結(jié)合以及酮戊二酸結(jié)合過(guò)程中起到重要作用。其中FTO 和ALKBH5 是值得關(guān)注的兩個(gè)m6A去甲基化酶。

圖1 人類AlkB家族的基因結(jié)構(gòu)圖以及保守性分析

2.1 FTO去甲基化酶

早在2007年就有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)FTO 的氧化去甲基化作用［30］，后續(xù)又證明甲基化的RNA 是FTO 的首選底物［31］。而2011年發(fā)表在Nature Chemical Biology雜志上的研究工作揭示了FTO 在體外針對(duì)RNA 中豐富的m6A 殘基具有高效的氧化去甲基化活性，證實(shí)核RNA 中的m6A 是FTO 的主要生理底物［9］。

如圖2 所示，F(xiàn)TO 在不用物種中的代表性轉(zhuǎn)錄本含有代表鐵（Ⅱ）結(jié)合的“HXD…H”基序和代表酮戊二酸結(jié)合的“R…R”基序。

圖2 不同物種中脂肪含量與肥胖相關(guān)蛋白(FTO)的的基因結(jié)構(gòu)圖以及保守性分析

有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在脂肪形成過(guò)程中FTO 表達(dá)和m6A 水平呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)TO 消耗會(huì)阻礙分化，只有催化活性的FTO 才能恢復(fù)脂肪生成［32］。FTO 能夠一定程度上促進(jìn)急性髓系白血?。?］、非小細(xì)胞肺癌［5］、人乳腺癌［33］和膀胱癌［34］等的發(fā)展。另外，F(xiàn)TO 抑制與抗PD-1阻斷相結(jié)合可能會(huì)降低黑色素瘤免疫治療的耐藥［35］。與相鄰的正常組織相比，宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中FTO 能調(diào)節(jié)β-catenin 的表達(dá)，在體外和體內(nèi)增強(qiáng)化療-放療的抗性［36］。

2.2 ALKBH5去甲基化酶

ALKBH5 是在2013年被發(fā)現(xiàn)的第2 個(gè)m6A 去甲基化酶［37］。該研究證實(shí)其是另一種哺乳動(dòng)物去甲基化酶，可在體外和體內(nèi)去除核RNA（主要是mRNA）上的m6A修飾［37］。

類似于FTO，ALKBH5轉(zhuǎn)錄本在不同物種中的代表性轉(zhuǎn)錄本（圖3）也含有代表鐵（Ⅱ）結(jié)合的“HXD…H”基序和代表酮戊二酸結(jié)合的“R…R”基序。

圖3 不同物種中AlkB同源蛋白5（ALKBH5）的基因結(jié)構(gòu)圖和保守性分析

ALKBH5 在組織中廣譜表達(dá)。其在睪丸中特別豐富，能夠影響小鼠精子發(fā)生和生育能力［38］。抑制ALKBH5 能減少自噬通量并促進(jìn)缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）處理的心肌細(xì)胞的凋亡［39］。此外，ALKBH5 能夠抑制胃癌細(xì)胞［40］、肺腺癌細(xì)胞［41］和上皮性卵巢癌細(xì)胞［42］等多種細(xì)胞的生長(zhǎng)。另有報(bào)道稱ALKBH5 的缺失使黑色素瘤對(duì)其的免疫治療增敏［43］，有助于免疫治療的療效，可作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。

3 m6A去甲基化酶抑制劑的開發(fā)

3.1 FTO去甲基化酶抑制劑

FTO 是全基因組關(guān)聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)肥胖風(fēng)險(xiǎn)基因，此外，它還是第1 個(gè)被發(fā)現(xiàn)的可逆的m6A 去甲基化酶。作為非血紅素雙加氧酶超家族中的成員之一，F(xiàn)TO 能夠催化鐵（Ⅱ）和α-酮戊二酸（2-OG）依賴的底物氧化去甲基化過(guò)程，因此，從作用機(jī)制上來(lái)說(shuō)，F(xiàn)TO抑制劑可分為金屬離子螯合劑、2-OG類似物和底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑3類。

通用型抑制劑N-草酰甘氨酸（N-oxalylglycine，NOG）與2-OG 有類似結(jié)構(gòu)，可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制FTO與下游底物的結(jié)合［44］。研究表明，環(huán)狀和非環(huán)狀2-OG 類似物都具有抑制FTO 的作用。然而由于它們較低的特異性和選擇性，難以在某些因FTO高表達(dá)導(dǎo)致疾病進(jìn)展的腫瘤中作為靶向治療藥物。因此研發(fā)出高選擇性和特異性的FTO 抑制劑成為此后的研究重點(diǎn)。目前，已有研究報(bào)道了一些FTO 抑制劑（表1），其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖4所示。

圖4 m6A去甲基化酶FTO抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

表1 已開發(fā)的N6-甲基腺嘌呤(m6A)去甲基化酶FTO抑制劑

3.1.1 大黃酸(rhein) 2012年，上海藥物研究所通過(guò)高通量虛擬篩選和生化分析等方法，將天然產(chǎn)物大黃酸（rhein，化合物1）確定為第1 個(gè)特異性較高的FTO 抑制劑［45］。根據(jù)生物物理實(shí)驗(yàn)分析以及動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸既不是2-OG 結(jié)構(gòu)類似物，也不是結(jié)合2-OG 輔助因子的金屬離子螯合劑，而是通過(guò)與FTO 底物競(jìng)爭(zhēng)，特異地結(jié)合其催化結(jié)構(gòu)域，從而抑制FTO去甲基化酶功能。

首先，限制性核酸內(nèi)切酶消化、等溫滴定量熱法、熒光偏振法和液相色譜分析等體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了大黃酸的抑制活性。其次，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，大黃酸也被證明能夠提高人神經(jīng)瘤細(xì)胞系BE（2）-C 中總mRNA的m6A修飾水平，并且大黃酸對(duì)BE（2）-C細(xì)胞并未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，這為日后大黃酸在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用中增加了更多的可能性。然而大黃酸對(duì)AlkB 亞家族的選擇性很小［46］。

3.1.2 甲氯芬那酸(MA)和（(2E)-4-[N‘-（4-芐基吡啶-3-羰基）-肼基]-4-氧代丁-2-烯酸） 為了篩選FTO 的選擇性抑制劑，上海藥物所研究團(tuán)隊(duì)于2015年通過(guò)高通量熒光偏振（FP）方法比較了各種藥物化合物存在下m6A-ssDNA 結(jié)合FTO 和AlkBH5 的差異［47］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)非甾體抗炎藥甲氯芬那酸（MA，化合物2）以劑量依賴的方式抑制含有m6A 的ssDNA 或ssRNA 的FTO 去甲基化，卻不能與ALKBH5 蛋白結(jié)合，也不競(jìng)爭(zhēng)ALKBH5 與ssDNA 的結(jié)合。進(jìn)一步的抑制機(jī)制研究顯示，MA既不是2-OG 的化學(xué)模擬物，也不是鐵的螯合劑，它與FTO 結(jié)合形成一個(gè)發(fā)夾基序。該基序作為核酸識(shí)別蓋（nucleotide recognition lid，NRL）的一部分，可用于提供MA 和FTO 之間額外的相互作用，而ALKBH5 恰好缺乏NRL 部分的發(fā)夾基序。因此MA 是體外FTO 去甲基化的高選擇性抑制劑，并且針對(duì)MA/FTO 結(jié)構(gòu)化合物可進(jìn)行強(qiáng)效FTO 抑制劑的結(jié)構(gòu)引導(dǎo)設(shè)計(jì)。

同年，新加坡國(guó)立大學(xué)的TOH 研究團(tuán)隊(duì)［48］基于AlkB酶的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)的固有結(jié)構(gòu)差異的原理，設(shè)計(jì)合成小分子化合物來(lái)更有效地選擇性抑制AlkB 酶。在篩選的數(shù)十種化合物中，（（2E）-4-［N'-（4-芐基吡啶-3-羰基）-肼基］-4-氧代丁-2-烯酸）（化合物3）被確定為一種有效的FTO 選擇性抑制劑。它對(duì)FTO 的選擇性是其他AlkB 亞家族的30~130 倍。晶體學(xué)分析顯示，（（2E）-4-［N'-（4-芐基吡啶-3-羰基）-肼基］-4-氧代丁-2-烯酸）同時(shí)占據(jù)FTO蛋白中核苷酸與2-OG的結(jié)合位點(diǎn)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，它的乙酯衍生物能夠抑制細(xì)胞中m6A去甲基化酶的活性。這是首次報(bào)道的一種對(duì)特定的AlkB 亞家族成員具有選擇性的抑制劑，這種選擇性為其作為功能探針和治療先導(dǎo)物提供了新思路。

3.1.3 N-CDPCB 和CHTB N-CDPCB（1a，化合物4）是由鄭州大學(xué)的?？?biāo)研究團(tuán)隊(duì)于2015年設(shè)計(jì)得到的新型FTO 小分子抑制劑［49］。通過(guò)鑒定人FTO 與N-CDPCB 的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其與報(bào)道的FTO 特異性抑制劑MA 的結(jié)構(gòu)有部分重疊，并且發(fā)現(xiàn)N-CDPCB與FTO蛋白的相互作用主要是通過(guò)范德華力、疏水作用力和氫鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)的，揭示了FTO抑制劑的一個(gè)新的結(jié)合位點(diǎn)以及它們相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

2016年，利用相同的設(shè)計(jì)方法，該研究團(tuán)隊(duì)又發(fā)現(xiàn)了另一種FTO 抑制劑CHTB（化合物5）［50］，它的作用方式與N-CDPCB相似，也是通過(guò)范德華力、疏水作用力和氫鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)FTO 蛋白的特異性識(shí)別的。結(jié)構(gòu)分析顯示CHTB 占據(jù)了FTO 蛋白活性位點(diǎn)的L 形空腔。新的結(jié)合位點(diǎn)的識(shí)別為進(jìn)一步開發(fā)選擇性和強(qiáng)效的FTO 抑制劑提供了新的機(jī)會(huì)，這有望為治療肥胖或肥胖相關(guān)疾病的新治療靶點(diǎn)提供信息。

3.1.4 天然化合物根赤殼菌素(radicicol) 2018年，鄭州大學(xué)的?？?biāo)研究團(tuán)隊(duì)在進(jìn)一步研究該新結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)效關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，4-氯-1，3-二醇基團(tuán)是N-CDPCB（1a）、CHTB 以及它們的類似物的共同結(jié)構(gòu)基序。因此，研究人員根據(jù)N-CDPCB/FTO復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)的新的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)具有4-氯-1，3-二醇基團(tuán)的化合物進(jìn)行了基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，同時(shí)利用相似性搜索和活性分析，進(jìn)而確定了天然化合物根赤殼菌素（radicicol，化合物6）是一種有效的FTO 抑制劑［51］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，它對(duì)FTO去甲基化活性呈劑量依賴性抑制，半抑制濃度為16.04 μmol/L。并且兩者之間的相互作用主要是熵驅(qū)動(dòng)的。晶體結(jié)構(gòu)分析表明，根赤殼菌素在FTO 結(jié)合位點(diǎn)采用L 形構(gòu)象，并與之前發(fā)現(xiàn)的FTO小分子抑制劑N-CDPCB占據(jù)相同的位置。該抑制劑的發(fā)現(xiàn)為設(shè)計(jì)更有效的化合物來(lái)抑制FTO 的活性提供了新的信息。

3.1.5 FB23 和FB23-2 繼2015年篩選出MA 抑制劑之后，上海藥物所Huang 等［52］在2019年進(jìn)一步優(yōu)化合成了MA 衍生物FB23（化合物7）和FB23-2（化合物8）?；诮Y(jié)構(gòu)導(dǎo)向的合理設(shè)計(jì)開發(fā)的這兩種FTO 抑制劑，即FB23 和FB23-2，通過(guò)占據(jù)底物結(jié)合位點(diǎn)直接與FTO 結(jié)合，選擇性地抑制FTO的m6A去甲基化酶活性。

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)B23-2 能顯著抑制人急性髓系白血病（AML）細(xì)胞系細(xì)胞和原代母細(xì)胞AML 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其分化或凋亡。此外，F(xiàn)B23-2也能顯著抑制異種移植小鼠中的人AML細(xì)胞系和原代細(xì)胞的進(jìn)展。這可能對(duì)通過(guò)靶向表觀轉(zhuǎn)錄組RNA 甲基化進(jìn)行癌癥治療，產(chǎn)生廣泛的影響。

3.1.6 恩他卡朋(entacapone) 2019年，北京生命科學(xué)研究所的研究團(tuán)隊(duì)使用了一種基于結(jié)構(gòu)的對(duì)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局FDA 批準(zhǔn)的藥物進(jìn)行虛擬篩選的方法，進(jìn)而將兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）抑制劑恩他卡朋（化合物9）確定為一種潛在的FTO 抑制劑［53］。它最初被FDA 批準(zhǔn)是作為左旋多巴和卡比多巴聯(lián)合治療帕金森病的輔助治療。通過(guò)結(jié)構(gòu)和生化研究，發(fā)現(xiàn)恩他卡朋在體外直接結(jié)合FTO 并抑制FTO 活性。它可以降低飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的體重和空腹血糖濃度。此外，RNA-seq結(jié)果還鑒定出轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，F(xiàn)OXO1）mRNA 是作為FTO 的直接底物，并證明了恩他卡朋在FTO-FOXO1調(diào)節(jié)軸對(duì)小鼠肝臟糖異生和小鼠脂肪組織生熱的調(diào)節(jié)作用中具有重要影響。

3.1.7 CS1(NSC337766)和CS2(NSC368390) 雖然m6A 修飾與各種類型癌癥的起始、進(jìn)展、維持和耐藥性密切相關(guān)，但目前針對(duì)m6A 調(diào)節(jié)劑進(jìn)行癌癥治療的有效抑制劑的開發(fā)仍處于起步階段。2020年，陳建軍教授團(tuán)隊(duì)首先對(duì)來(lái)自美國(guó)國(guó)家癌癥研究所的上萬(wàn)種化合物進(jìn)行了基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選以及后續(xù)驗(yàn)證分析，鑒定出兩種有效的小分子化合物CS1（化合物10）和CS2（化合物11）［54］，它們可通過(guò)靶向FTO 進(jìn)而抑制癌癥干細(xì)胞的維持和免疫逃避。

CS1 和CS2 在抑制急性髓系白血病細(xì)胞活力和FTO 去甲基酶活性方面表現(xiàn)出強(qiáng)大效果，通過(guò)靶向FTO 并占據(jù)催化活性位點(diǎn)進(jìn)而干擾FTO 與m6A 修飾RNA 的結(jié)合，有效地抑制其m6A 去甲基化酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CS1 和CS2 通過(guò)抑制FTO 活性和干擾FTO 的信號(hào)通路，比如激活凋亡信號(hào)通路和抑制MYC 通路，進(jìn)而發(fā)揮抗白血病作用。與之前報(bào)道的FB23-2 等FTO 抑制劑相比，CS1 和CS2 在抑制急性髓系白血病細(xì)胞活力方面表現(xiàn)出10 ~ 30 倍的功效，表明它們的療效大大提高。

3.1.8 谷胱甘肽生物印跡納米復(fù)合材料(GNPIPP12MA) 盡管近年來(lái)一些小分子FTO 抑制劑的開發(fā)取得了很有前景的進(jìn)展，但由于生物功能溫和、不良反應(yīng)和對(duì)白血病干細(xì)胞的敏感性和特異性較低，其臨床潛力仍然有限。2022年Cao等［55］研究開發(fā)了負(fù)載FTO 抑制劑的谷胱甘肽GSH生物印跡納米復(fù)合材料（GNPIPP12MA），它通過(guò)靶向FTO/m6A 通路協(xié)同GSH 消耗來(lái)增強(qiáng)抗白血病發(fā)生。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GNPIPP12MA 可選擇性靶向白血病母細(xì)胞，尤其是白血病干細(xì)胞，通過(guò)破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)誘導(dǎo)鐵死亡。此外，GNPIPP12MA 增加了白血病干細(xì)胞中的m6A 修飾，降低了轉(zhuǎn)錄水平。GNPIPP12MA 通過(guò)增加細(xì)胞毒性T 細(xì)胞的浸潤(rùn)來(lái)增強(qiáng)抗白血病免疫，從而增強(qiáng)PD-L1 阻斷的療效。這項(xiàng)研究為靶向m6A 甲基化的GSH 生物印跡納米平臺(tái)提供了新的思路，該平臺(tái)可作為一種協(xié)同治療腫瘤干細(xì)胞的策略，有望應(yīng)用于臨床。

3.1.9 小分子抑制劑18097 2022年，研究人員通過(guò)虛擬篩選、結(jié)構(gòu)優(yōu)化和生物測(cè)定等方法開發(fā)出了一種新的FTO 小分子抑制劑18097（化合物12）［56］。

小分子抑制劑18097 通過(guò)與FTO 活性位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期過(guò)程和癌細(xì)胞遷移?？梢詫?duì)乳腺癌細(xì)胞的表觀轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行重編程，尤其是P53通路相關(guān)基因的重編程。小分子抑制劑18097通過(guò)招募IGF2BP1 來(lái)增加mRNA 的穩(wěn)定性，進(jìn)而激活P53信號(hào)通路。此外，它還抑制了細(xì)胞脂肪生成，通過(guò)下調(diào)PPARγ 和C/EBPα/β mRNA 的穩(wěn)定性來(lái)降低二者的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，小分子抑制劑18097能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和肺定植。綜上所述，F(xiàn)TO 可以作為一種潛在的藥物靶點(diǎn)，小分子抑制劑18097是一種特異性的、有效的FTO 抑制劑，可在體內(nèi)外抑制實(shí)體腫瘤細(xì)胞，尤其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移有抑制作用，因此可以作為一種潛在的抗乳腺癌藥物。

3.2 ALKBH5去甲基化酶抑制劑

與FTO 不同的是，ALKBH5 直至2013年才初次被報(bào)道具有m6A 去甲基化酶作用［37］，并且它也是Fe（Ⅱ）/2-OG依賴性雙加氧酶。而有關(guān)ALKBH5抑制劑的研究一直鮮有報(bào)道（表2），目前已開發(fā)的ALKBH5抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖5。

表2 已開發(fā)的m6A去甲基化酶ALKBH5抑制劑

圖5 m6A去甲基化酶ALKBH5抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

3.2.1 檸檬酸鹽 2014年，Xu 等［57］發(fā)現(xiàn)TCA 循環(huán)中間體檸檬酸鹽可以作為ALKBH5 溫和型抑制劑，IC50約為488 μmol/L，具有較弱的抑制效應(yīng)。檸檬酸與ALKBH5 的結(jié)合方式與在FTO 中觀察到的不同。在FTO-檸檬酸復(fù)合物中，檸檬酸取代了2-OG，而金屬離子仍然完好無(wú)損。但在ALKBH5-檸檬酸復(fù)合物中，檸檬酸同時(shí)占據(jù)了金屬離子和2-OG。雖然還需要對(duì)ALKBH5復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的研究，但通過(guò)初步分析ALKBH5 結(jié)合底物的特異性環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不僅可以為ALKBH5對(duì)ssRNA去甲基化的分子機(jī)制提供見解，確定檸檬酸鹽作為ALKBH5 的溫和型抑制劑，同時(shí)也為ALKBH5的高特異性抑制劑開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

由于該化合物對(duì)U87-MG 細(xì)胞的影響似乎并不依賴于其鈉通道阻斷能力，因此通過(guò)使用SPILLO-PBSS 軟件確定了MV1035 的替代脫靶相互作用。在MV1035排名最高的脫靶點(diǎn)中，重點(diǎn)關(guān)注的是RNA 去甲基化酶ALKBH5 酶，該酶在癌癥中發(fā)揮了關(guān)鍵的腫瘤抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，MV1035可以靶向m6A去甲基化酶ALKBH5，從而提高m6A 水平。此外結(jié)果還進(jìn)一步表明，CD73 可能是作為下游靶蛋白參與MV1035 抑制ALKBH5，降低U87細(xì)胞系遷移和侵襲性的途徑。3.2.3 化合物20m 2022年，F(xiàn)ang 等［59］報(bào)道了一類新的含有1-芳基-1H-吡唑支架的ALKBH5 抑制劑。通過(guò)基于熒光極化的篩選、結(jié)構(gòu)優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，化合物20m（化合物14）的熒光極化作用最強(qiáng)，IC50為0.021 μmol/L，且化合物20m對(duì)ALKBH5 比對(duì)FTO 以及其他AlkB 亞家族成員具有更高的選擇性。細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（CETSA）結(jié)果顯示，化合物20m 可有效穩(wěn)定HepG2 細(xì)胞中的ALKBH5。斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)表明，化合物20m可提高完整細(xì)胞的m6A水平。綜上所述，化合物20m是一種高效選擇性的具有細(xì)胞活性的ALKBH5 抑制劑，可作為一種多功能的化學(xué)探針來(lái)探索ALKBH5 的生物學(xué)功能。

4 m6A去甲基化酶抑制劑的應(yīng)用與展望

越來(lái)越多的研究表明，m6A去甲基化酶在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，其中去甲基化酶FTO 與急性髓系白血?。?］、胰腺癌［60］和肺癌［6］等癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其高表達(dá)會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖、腫瘤干細(xì)胞的自我更新［61］、腫瘤轉(zhuǎn)移以及導(dǎo)致不良的腫瘤預(yù)后［35］。去甲基化酶ALKBH5 可通過(guò)影響m6A 修飾水平從而促進(jìn)包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［7］和胃癌［8］在內(nèi)的多種腫瘤進(jìn)展。因此，已經(jīng)有越來(lái)越多的去甲基化酶抑制劑被開發(fā)并應(yīng)用于抗腫瘤治療。FTO 是目前研究和發(fā)展最多的m6A 相關(guān)酶，而最新報(bào)道的FTO 抑制劑也達(dá)到了很高的活性和選擇性，并展現(xiàn)出一定的臨床應(yīng)用潛能。隨著各項(xiàng)技術(shù)的不斷突破，ALKBH5抑制劑的篩選也處于穩(wěn)步發(fā)展的過(guò)程中。

然而，大部分化合物仍處于生化或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證階段，部分化合物即使經(jīng)過(guò)了小鼠體內(nèi)驗(yàn)證，在人體環(huán)境中，其抑制效率和安全性維持仍未可知，并且對(duì)于抑制劑調(diào)控腫瘤的具體作用機(jī)制也未能清晰闡述，遠(yuǎn)不能滿足新藥的臨床前研究推進(jìn)。因此，高效高選擇性抑制劑的開發(fā)和研究仍有待進(jìn)一步深入。

對(duì)于已開發(fā)的小分子化合物，還需要進(jìn)一步系統(tǒng)研究其調(diào)控腫瘤的機(jī)制，并通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化，以提高其生物利用度、抑制效果和治療效果。同時(shí)分析此類抑制劑應(yīng)用于各種腫瘤之間的異同，對(duì)于腫瘤的診療具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。此外，通過(guò)藥物化學(xué)等手段篩選新的更高活性和選擇性的小分子抑制劑，開發(fā)高特異性抑制劑有助于腫瘤研究中甲基化修飾功能的探究。這些篩選出的藥物有望成為有用的工具分子，幫助研究人員進(jìn)一步探索m6A 相關(guān)生物過(guò)程的機(jī)制，同時(shí)對(duì)于腫瘤臨床治療也有著積極意義。