黃蘇豫，劉佳微，劉筱，楊麗麗，黃安林，吳明開(kāi)

1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代中藥材研究所，貴陽(yáng) 550006； 3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技信息研究所，貴陽(yáng) 550006

在自然條件下由于云層的運(yùn)動(dòng)，植物通常會(huì)經(jīng)歷光的突然增加，尤其是設(shè)施栽培環(huán)境下，溫室骨架以及植物上部冠層的遮蔭使溫室植物冠層呈現(xiàn)大量且持續(xù)變化的光斑。當(dāng)光強(qiáng)突然增加時(shí)，PSⅡ?qū)獾奈找矔?huì)立刻增加［1］，但是電子傳遞系統(tǒng)不能及時(shí)利用多余的還原能，從而導(dǎo)致光化學(xué)系統(tǒng)的抑制［2］。光強(qiáng)的變化通常也伴隨著溫度的變化，波動(dòng)光和熱脅迫是熱帶和亞熱帶地區(qū)夏季的典型生境，當(dāng)植物同時(shí)受到光強(qiáng)和溫度脅迫時(shí)會(huì)使線性電子傳遞和環(huán)式電子傳遞受阻，導(dǎo)致非光化學(xué)淬滅（non-photo?chemical quenching，NPQ）不能有效耗散過(guò)剩光能來(lái)保護(hù)光合系統(tǒng)，對(duì)PSIⅡ造成不可逆損傷［3-4］。目前關(guān)于高溫和波動(dòng)光對(duì)植物光合作用的影響研究大多是在受控環(huán)境生長(zhǎng)的植物上進(jìn)行的。

蘭科植物白及（Bletilla striata）是一種瀕危藥用植物，貴州野生白及生長(zhǎng)于海拔950～1 600 m、土壤含腐殖質(zhì)較豐富的林下、草叢、巖石縫中［5］。白及繁殖常利用其種子進(jìn)行組織培養(yǎng)，因白及組培苗抗逆性差、羸弱，不能直接用于大田栽培，需要移栽到人工大棚中進(jìn)行適應(yīng)性鍛煉，培育形成塊莖，塊莖達(dá)到一定大小形成分叉才能移栽至大田［6］。但現(xiàn)有研究多集中在基質(zhì)類型、遮陰度、施肥和病蟲(chóng)害防治方面［7］，而關(guān)于白及組培苗移栽溫室后對(duì)環(huán)境適應(yīng)的影響研究較少。同時(shí)，植物在夏季通常會(huì)受到波動(dòng)光和熱脅迫，白及作為一種典型的陰生植物，在生產(chǎn)種植過(guò)程中需要采用遮陰栽培，溫度超過(guò)35 ℃會(huì)對(duì)白及的光合作用產(chǎn)生抑制并且對(duì)白及PSⅡ系統(tǒng)造成不可逆的影響［8］。基于白及對(duì)強(qiáng)光強(qiáng)和高溫的敏感性，本研究探討夏季光溫脅迫對(duì)白及生長(zhǎng)及生理生化特性的影響，旨在為白及移栽馴化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

本研究以白及（Bletilla striata）種子培育的組培種苗為研究材料，煉苗后，移栽在泥炭混合基質(zhì)（V泥炭∶V鋸末∶V蛭石=3∶1∶1）的育苗穴盤(pán)中，在相對(duì)濕度為60%～70%的大棚中生長(zhǎng)，使用遮陽(yáng)網(wǎng)控制光照，夏季正午最大光強(qiáng)約為1 300 μmol /（m2·s），最高溫度約為38 ℃，栽培過(guò)程中不存在水分或營(yíng)養(yǎng)脅迫。待植株移栽90 d時(shí)，將植株轉(zhuǎn)入人工氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行2 h的溫度（25、30、35、38 ℃）處理。測(cè)定葉綠素?zé)晒夂凸夂蠚怏w交換參數(shù)。

1.2 樣品采集與測(cè)定

白及移栽30、60、90 d時(shí)隨機(jī)選取10株白及，測(cè)量移栽苗株高、莖寬、葉片長(zhǎng)、葉寬、塊莖寬度及厚度、根長(zhǎng)，稱根、塊莖、葉鮮質(zhì)量。在105 ℃烘箱中殺青10 min，于80 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱各部分干質(zhì)量。烘干后的各部分樣品粉碎，采用硫酸-苯酚比色法測(cè)定多糖含量。

1.3 氣體交換參數(shù)測(cè)定

參考Yang等［4］的方法，待測(cè)葉片首先在6400-40熒光葉室中強(qiáng)光（1 000 μmol/（m2·s））和不同溫度（25、30、35、38 ℃）處理適應(yīng)20～30 min，以25 ℃處理為對(duì)照，至凈光合速率（Pn）和氣孔導(dǎo)度（Gs）穩(wěn)定后，葉片在弱光［50 μmol /（m2·s），2 min］和強(qiáng)光［1 000 μmol /（m2·s），2 min］之間交替變化，持續(xù)30 min。Li-Cor 6400XT每2 s記錄1次數(shù)據(jù)。待測(cè)葉片在同樣的處理下適應(yīng)20～30 min，至Pn和Gs穩(wěn)定后，在弱光（50 μmol/（m2·s））下持續(xù)5 min和10 min，隨后光強(qiáng)再次上升到強(qiáng)光（1 000 μmol /（m2·s））持續(xù)5 min。Li-Cor 6400XT每2 s記錄1次數(shù)據(jù)。測(cè)定期間，葉室內(nèi)測(cè)量光為L(zhǎng)i-Cor 6400XT默認(rèn)光源，即90%紅光+10%藍(lán)光，CO2濃度為400 μmol/mol，空氣流速為500 μmol/s。

測(cè)定期間，某時(shí)刻的光合誘導(dǎo)狀態(tài)為此時(shí)的凈光合速率占最大凈光合速率的百分比［9］，光合誘導(dǎo)狀態(tài)＝（Pn-Pnd）/（Pnf-Pnd）×100，式中，Pn為凈光合速率；Pnd為待測(cè)葉片暗適應(yīng)時(shí)穩(wěn)定的凈光合速率；Pnf為25 ℃時(shí)，光誘導(dǎo)期結(jié)束（即強(qiáng)光強(qiáng)下，適應(yīng)30 min）時(shí)待測(cè)葉片達(dá)到的最大凈光合速率。

1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

植株首先在暗室中暗適應(yīng)30 min，隨后將待測(cè)葉片在6400-40熒光葉室中暗適應(yīng)30 min左右，記錄最?。‵o）和最大（Fm）熒光。暗適應(yīng)結(jié)束后將Li-Cor 6400XT葉室內(nèi)光強(qiáng)瞬時(shí)提高到1 000 mmol /（m2·s）并持續(xù)30 min，記錄Fs和Fm'。計(jì)算PSⅡ最大量子產(chǎn)量（Fv/Fm）、PSⅡ有效量子產(chǎn)量（ΦPSII）、光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）、光下最大光化學(xué)效率（Fv'/Fm'）、光保護(hù)指標(biāo)（ΦNPQ）、光損傷指標(biāo)（ΦNO）、線性電子傳遞速率（ETR）和非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）［10］。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用單因素ANOVA進(jìn)行方差分析確定不同處理的差異顯著性，繪圖采用Origin 2022。

2 結(jié)果與分析

2.1 光溫耦合對(duì)氣體交換參數(shù)的影響

測(cè)定結(jié)果顯示，白及葉片經(jīng)連續(xù)強(qiáng)光-弱光-強(qiáng)光轉(zhuǎn)換，光合誘導(dǎo)狀態(tài)對(duì)溫度脅迫展現(xiàn)出不同的響應(yīng)，高溫脅迫顯著降低了光合誘導(dǎo)狀態(tài)，35和38 ℃處理下的光合誘導(dǎo)狀態(tài)分別為55%～65%和30%～40%，25和30 ℃下的白及植株在經(jīng)過(guò)一系列交替光的轉(zhuǎn)換后光合誘導(dǎo)狀態(tài)仍高達(dá)80%～90%和70%～80%（圖1A）。

交替光轉(zhuǎn)換下溫度和Gs呈負(fù)相關(guān)，在25～35 ℃下降明顯，峰值從0.17左右降到0.90左右（圖1B）。白及葉片的胞間二氧化碳濃度和溫度呈正相關(guān)（圖1 C），CK和38 ℃相比，Ci上升了7%，并且蒸騰速率和溫度也呈現(xiàn)正相關(guān)（圖1D）。溫度的升高致使葉片光合下降，高溫脅迫下各處理在弱光和強(qiáng)光的轉(zhuǎn)換之間仍然保持相同的變化趨勢(shì)。

圖1 白及葉片經(jīng)連續(xù)強(qiáng)光-弱光-強(qiáng)光轉(zhuǎn)換下氣體交換參數(shù)對(duì)瞬時(shí)溫度脅迫的響應(yīng)Fig.1 Response of gas exchange parameters to transient temperature stress in Bletilla striata leaves under continuous strong-weak-strong light conversion

2.2 溫度對(duì)弱光照射持續(xù)時(shí)間的影響

在經(jīng)歷5 min的弱光后，強(qiáng)光來(lái)臨時(shí)，各個(gè)溫度達(dá)到穩(wěn)態(tài)的時(shí)間t35℃

圖2 葉片經(jīng)不同時(shí)間弱光處理后轉(zhuǎn)移到強(qiáng)光下其光合速率變化過(guò)程對(duì)溫度脅迫的響應(yīng)Fig.2 Response of photosynthetic rate change process of leaves to temperature stress after different time of weak light treatment transferred to strong light

2.3 溫度對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由表1可知，38 ℃處理的Fo最高，35 ℃處理次之，均顯著高于25 ℃處理（對(duì)照），說(shuō)明白及葉片在高溫條件下類囊體膜受損嚴(yán)重。CK（25 ℃）的Fv/Fm值為0.84，優(yōu)于其他處理；30、35、38 ℃時(shí)的Fv/Fm值比對(duì)照處理的分別下降了2.4%、6.0%和7.1%，表明高溫對(duì)白及光能轉(zhuǎn)換效率均有不同程度的抑制作用，溫度越高抑制作用越明顯。NPQ隨溫度升高而上升，38 ℃時(shí)的NPQ比25 ℃提高了26%。說(shuō)明白及受到高溫脅迫后，PSⅡ吸收的光能中用于耗散和發(fā)出熒光的能量增多，而用于光化學(xué)反應(yīng)的能量減少。高溫脅迫下ETR下降明顯，38 ℃與CK相比約下降了46.5%。ETR下降說(shuō)明光合機(jī)構(gòu)受損，電子傳遞過(guò)程不能正常有效進(jìn)行，導(dǎo)致光能轉(zhuǎn)換效率降低，進(jìn)而導(dǎo)致光合速率的下降。ΦPSⅡ隨溫度升高呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，與CK相比，30 ℃下被利用的光能并沒(méi)有顯著的改變，但是在35和38 ℃下降趨勢(shì)明顯，分別下降了27%和45%。光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）和光下最大光化學(xué)效率（Fv'/Fm'）同樣隨溫度升高顯著降低。

表1 溫度脅迫對(duì)白及葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Table 1 Effects of temperature stress on chlorophyll fluorescence parameters of Bletilla striata leave

2.4 夏季移栽對(duì)白及生長(zhǎng)指標(biāo)、生物量和多糖含量的影響

由于白及組培苗抗逆性差、羸弱，不能直接進(jìn)入大田栽培，需要移栽到人工大棚中進(jìn)行適應(yīng)性鍛煉。馴化初期，30 與60 d的株高并沒(méi)有表現(xiàn)出差異，但是在莖寬、根數(shù)、根長(zhǎng)、塊莖厚上表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05），隨著馴化時(shí)間的延長(zhǎng)，在90 d時(shí)，株高、葉片長(zhǎng)、塊莖寬和根長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著差異（表2），但是在90 d時(shí)，白及仍未初步形成“馬鞍型”塊莖。

表2 馴化時(shí)間對(duì)白及移栽苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Table 2 Effect of domestication time on growth indexes of Bletilla striata seedlings cm

白及移栽苗根冠比呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，表明在移栽前期以地下部的生長(zhǎng)為主，于90 d左右地上部的生長(zhǎng)占主要部分。根的生物量占比和莖葉生物量占比均隨馴化時(shí)間的延長(zhǎng)而提高（圖3 A），但塊莖生物量比呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。

白及多糖含量是白及質(zhì)量指標(biāo)之一，由圖3可以看出，塊莖的多糖含量隨馴化時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，并且在60 d后顯著增加，多糖含量相比于60 d時(shí)增加了51%。而葉片和根的多糖含量受馴化時(shí)間的影響較?。▓D3 B）。

圖3 移栽馴化時(shí)間對(duì)白及幼苗生物（A）和多糖含量（B）的影響Fig.3 Effect of transplanting and accliating time on biomass（A） and polysaccharide content（B） of Bletilla striata seedlings

3 討論

3.1 光溫耦合對(duì)氣體交換參數(shù)的影響

凈光合速率下降，胞間CO2濃度或氣孔導(dǎo)度上升，說(shuō)明凈光合速率的下降是由非氣孔限制因素造成的[11]。在高溫下，光化學(xué)反應(yīng)和碳代謝受到抑制，葉片的水分狀態(tài)和細(xì)胞內(nèi)二氧化碳濃度出現(xiàn)顯著變化，這些變化都導(dǎo)致了光合速率的降低[12-14]。熱脅迫導(dǎo)致的光抑制被認(rèn)為是由于抑制了RuBP的羧化速率和Rubisco活性[15-16]。葉片由強(qiáng)光轉(zhuǎn)移到弱光下，再次轉(zhuǎn)換到強(qiáng)光時(shí)，光合速率恢復(fù)至強(qiáng)光水平的時(shí)間和Rubisco活性有關(guān)[17-18]。

在本研究中，35 ℃與CK相比光合速率顯著降低，而在前人的研究中34 ℃短期內(nèi)對(duì)白及的光合速率不會(huì)產(chǎn)生太大的影響[8]，原因可能是選用的白及生長(zhǎng)期不同以及在波動(dòng)光下，供給側(cè)產(chǎn)生的還原能不能被受體測(cè)利用，加重了光抑制現(xiàn)象。白及葉片在強(qiáng)-弱-強(qiáng)光的轉(zhuǎn)換下，葉片的光合速率受溫度脅迫的影響，并隨著弱光持續(xù)照射時(shí)間的增加，凈光合速需要更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)恢復(fù)至正常水平。

3.2 溫度對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

葉綠素?zé)晒鈪?shù)是植株響應(yīng)熱脅迫的重要指標(biāo)，高溫會(huì)使Fo升高，原因是類囊體結(jié)構(gòu)遭到了破壞，因此，F(xiàn)o也被作為植物耐熱性相關(guān)的生理特征［19-20］。熱脅迫通過(guò)抑制PSⅡ的修復(fù)來(lái)降低PSⅡ活性從而加深植物的光抑制程度［21-22］。Fv/Fm反映PSⅡ?qū)饽艿睦眯?，是評(píng)判光抑制的重要指標(biāo)，在脅迫狀態(tài)下會(huì)發(fā)生明顯的變化。ΦPSⅡ是PSII反應(yīng)中心部分關(guān)閉時(shí)的光能捕獲效率，F(xiàn)v'/Fm'反映開(kāi)放的PSⅡ反應(yīng)中心的光能捕獲效率，兩者都能體現(xiàn)PSII反應(yīng)中心對(duì)光能的轉(zhuǎn)化效率。熒光淬滅是植物體內(nèi)光合效率調(diào)節(jié)的一個(gè)重要指標(biāo)，分為光化學(xué)淬滅和非光化學(xué)淬滅兩類。光化學(xué)淬滅反映光能直接被用于光化學(xué)電子傳遞的比例，非光化學(xué)淬滅的大小表明植物耗散過(guò)剩光能為熱的能力，反映了植物的光保護(hù)能力，并且熱耗散對(duì)植物光合機(jī)構(gòu)免受破壞起到積極的作用。高溫下，PSⅡ反應(yīng)中心的失活和類囊體結(jié)構(gòu)的改變，被認(rèn)為是ETR下降的主要原因。高溫抑制PSⅡ活性，降低其穩(wěn)定性，進(jìn)而抑制光合作用。

本研究探討了夏季光溫耦合對(duì)白及馴化苗生長(zhǎng)發(fā)育及多糖含量的影響，結(jié)果表明：白及移栽苗的生長(zhǎng)指標(biāo)和馴化時(shí)間成正比，根冠比在90 d內(nèi)先升后降，塊莖多糖含量90 d較60 d增加了51%，夏季波動(dòng)光和高溫對(duì)白及生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重危害。因此，在夏季應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)白及馴化苗的水肥管理，從而減輕高溫和波動(dòng)光帶來(lái)的傷害。