李鳳鳳，張毅鵬，龔達(dá)林，劉三波，黃麒元，3，梅之南，王學(xué)奎，舒少華

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070； 2.華潤(rùn)三九（黃石）藥業(yè)有限公司，黃石 435000；3.國(guó)藥集團(tuán)中聯(lián)藥業(yè)有限公司，武漢 430070

雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook.f.）是衛(wèi)矛科（Cleastraceae）雷公藤屬植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材之一，其主要活性成分為萜類和生物堿類化合物，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、抗菌、止痛等多種作用［1］。在雷公藤栽培過(guò)程中，白絹病、炭疽病、麗長(zhǎng)角巢蛾等多種病蟲(chóng)害對(duì)其造成嚴(yán)重危害。目前，生產(chǎn)上多采用辛硫磷、氯氰菊酯、乙基多殺菌素等農(nóng)藥來(lái)防治麗長(zhǎng)角巢蛾等害蟲(chóng)。其中，辛硫磷作為廣譜、高效、低毒、易分解的殺蟲(chóng)劑，已經(jīng)成為樂(lè)果、甲胺磷等高毒農(nóng)藥的替代產(chǎn)品［2］；氯氰菊酯是一種廣譜性擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑，對(duì)害蟲(chóng)具有觸殺和胃毒作用［3］；乙基多殺菌素因低毒、低殘留、作用位點(diǎn)獨(dú)特、殺蟲(chóng)譜廣，已經(jīng)應(yīng)用到了多種作物上［4］。雷公藤活性成分復(fù)雜，施用化學(xué)農(nóng)藥后農(nóng)藥殘留會(huì)直接影響其藥效，且長(zhǎng)期攝入殘留農(nóng)藥會(huì)對(duì)人體造成神經(jīng)毒性、致癌、致畸等危害［5-6］。因此，農(nóng)藥殘留量檢測(cè)是雷公藤中藥材質(zhì)量控制的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

目前，常見(jiàn)的檢測(cè)中藥材中農(nóng)藥殘留的方法主要包括色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、毛細(xì)管電泳法、免疫分析法和生物傳感器技術(shù)等，其中色譜和質(zhì)譜法在實(shí)際應(yīng)用中比較廣泛。中藥材基質(zhì)復(fù)雜，且待測(cè)農(nóng)藥大多數(shù)在高溫下不穩(wěn)定，所以液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)成為了測(cè)定農(nóng)藥殘留的主導(dǎo)技術(shù)［7-8］。

QuEChERS法是在固相萃取基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的一種新型樣品前處理技術(shù)［9］，最初針對(duì)一定含水量（>75%）的蔬果等樣本中的農(nóng)藥進(jìn)行提取，具有快速、便捷、廉價(jià)、高效、耐用和安全等特點(diǎn)，得到快速?gòu)V泛應(yīng)用。Lehotay等［10］利用QuEChERS法結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)了蔬菜和水果中229種農(nóng)藥殘留。為保證提取效率，學(xué)者根據(jù)樣本特點(diǎn)和待提取物性質(zhì)進(jìn)行了多種改進(jìn)和優(yōu)化［11］。針對(duì)干燥或含水量較低的樣品，向樣品中添加適量的水，可提高樣品的浸潤(rùn)性，弱化待測(cè)組分與樣品基質(zhì)之間的相互作用，使待測(cè)組分更容易在提取過(guò)程中被充分萃?。?2-13］。

目前，針對(duì)我國(guó)雷公藤種植生產(chǎn)過(guò)程中常用的3種農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法報(bào)道較少，且目前我國(guó)沒(méi)有雷公藤藥材中的農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過(guò)快速樣品前處理結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（QuECh?ERS/UPLC-MS/MS）法測(cè)定雷公藤及根際土壤中辛硫磷、氯氰菊酯和乙基多殺菌素3種農(nóng)藥殘留含量，并與相關(guān)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，旨在為3種農(nóng)藥在雷公藤及根際土壤中的殘留檢測(cè)提供方法指導(dǎo)， 并為我國(guó)盡快制訂雷公藤中藥材中的農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙酸銨（色譜純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（色譜純），中國(guó)武漢弗頓控股有限公司；乙腈和甲醇（質(zhì)譜純），美國(guó)Fisher公司；無(wú)水硫酸鎂（MgSO4，分析純），中國(guó)上海麥克林生化科技有限公司；氯化鈉（NaCl，分析純），德國(guó)BioFro公司；N-丙基乙二胺（PSA， 40～63 μm），美國(guó)Agela Technol?ogies公司；乙基多殺菌素原藥（100 mg，純度為88.28%），德國(guó)Dr. Ehrensorfer公司；氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/L，丙酮中）和辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L，丙酮中），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

雷公藤根樣、土壤樣品于2021年11月13日采集于湖北省陽(yáng)新縣平原村雷公藤種植基地 （115°E， 29°N）。隨機(jī)取30株雷公藤作為檢測(cè)植株樣品，其中根樣取自于所選定的雷公藤植株地下10～20 cm處，土樣選擇對(duì)應(yīng)部位的根際土壤（黃棕壤，有機(jī)質(zhì)17.88 g/kg，全氮0.46 g/kg，全磷0.86 g/kg，全鉀6.29 g/kg，堿解氮84.35 mg/kg，速效磷25.92 mg/kg，pH 4.94）。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（TSQ Altis?），美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和ACQUITY UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm），美國(guó)Waters公司；FW80高速粉碎機(jī)、101-AB電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；BX3200H超聲波清洗儀，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；AR223CN分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；B-20R型冷凍離心機(jī)，德國(guó)NACHT公司；MX-S型旋渦混合器，美國(guó)Scilogex公司。

1.3 樣品前處理

將雷公藤根樣洗凈，擦凈表面水分后于65 ℃烘箱中烘干6 h，粉碎，過(guò)孔徑230 μm篩，試驗(yàn)前于65 ℃烘箱中烘干4 h，備用。土壤樣品自然風(fēng)干，除去碎石、雜草和植物根莖等雜物，過(guò)孔徑280 μm篩，備用。準(zhǔn)確稱取雷公藤根樣和土壤樣品各2 g（精確至0.01 g），分別置于50 mL 離心管中，各加入去離子水4 mL，充分浸潤(rùn)后，加入乙腈4 mL，渦旋混勻1 min，超聲30 min后依次加入氯化鈉0.4 g和無(wú)水硫酸鎂1.6 g，再次渦旋2 min后4 000 r/min離心5 min。精密量取上清液2 mL于15 mL離心管中，分別加入N-丙基乙二胺0.1 g和無(wú)水硫酸鎂0.3 g，旋渦1 min，于4 ℃、5 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)膜，待測(cè)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至 0.1 mg）至10 mL容量瓶中，加入乙腈溶解，定容至刻度，搖勻，配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，在4 ℃冰箱中保存，待用。空白基質(zhì)溶液：分別準(zhǔn)確稱取未施藥的雷公藤根樣和土壤樣品各2 g（精確至0.01 g），按照本文“1.3”方法進(jìn)行樣品前處理，得到根樣空白基質(zhì)溶液和土壤空白基質(zhì)溶液?？瞻谆|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用空白基質(zhì)溶液分別稀釋3種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配制一系列濃度的空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于做基質(zhì)匹配校準(zhǔn)工作曲線。

1.5 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)條件

色譜條件：色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量1 μL；流速0.4 mL/min；流動(dòng)相 A：乙腈；流動(dòng)相B：5 mmol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫程序：0 min，5% A，95% B；10 min，99% A，1% B；13 min，99% A，1% B；13.1 min，5% A，95% B；15 min，5% A，95% B。

質(zhì)譜條件：Thermo Fisher超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（TSQ Altis?）檢測(cè)，電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；正離子掃描模式；選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（selective reaction monitoring，SRM）；毛細(xì)管電壓3.5 kV；離子傳輸線溫度325 ℃；霧化溫度350 ℃；輔助氣和鞘氣均為N2，輔助氣流速10 mL/min；鞘氣流速40 mL/min。優(yōu)化后的各目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 辛硫磷、氯氰菊酯和乙基多殺菌素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of phoxim，cypermethrin and spinetoram

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜與質(zhì)譜檢測(cè)條件的優(yōu)化

考察了2種超高效液相色譜柱Waters ACQUI?TY UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和Waters ACQUITY UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm）在乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-5 mmol/L的乙酸銨溶液2種流動(dòng)相和梯度洗脫條件下分離目標(biāo)物的情況。3種農(nóng)藥在不同的色譜柱和流動(dòng)相條件下的保留時(shí)間、峰形和分離情況見(jiàn)表2。結(jié)果表明，采用乙腈-5 mmol/L的乙酸銨溶液為流動(dòng)相，在本文“1.5”的梯度洗脫條件下，使用HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm ）色譜柱，15 min內(nèi)3種農(nóng)藥均可得到較高的靈敏度、峰形和重現(xiàn)性。其中乙基多殺菌素的2種本體乙基多殺菌素-J和乙基多殺菌素-L能達(dá)到較好分離，符合系統(tǒng)適用性的要求。

表2 4種色譜條件下化合物的保留時(shí)間、峰形和分離度情況Table 2 Retention time， peak shape and resolution of compounds under four different chromatographic conditions

2.2 線性范圍、檢出限與定量限分析

按照本文“1.4”方法配制一系列空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），線性回歸分析，擬合得各農(nóng)藥的基質(zhì)匹配線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)。如表3所示，在根樣空白基質(zhì)和土壤空白基質(zhì)中，辛硫磷（0.5～100.0 ng/mL）、氯氰菊酯（5～2 000 ng/mL）、乙基多殺菌素-J（0.01～1 000.00 ng/mL）、乙基多殺菌素-L（0.1～1 000 ng/mL）的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。為最大程度消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，在實(shí)際樣品檢測(cè)中采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

以信噪比（S/N）為10和3時(shí)對(duì)應(yīng)的空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為定量限（LOQ）和檢出限（LOD），3種農(nóng)藥的定量限和檢出限結(jié)果如表3所示，均遠(yuǎn)低于相關(guān)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)中3種農(nóng)藥在藥用植物中的最大殘留限量（MRL）（表4）。結(jié)果證明本研究建立的QuEChERS/UPLC-MS/MS方法靈敏度高，可滿足實(shí)際定量檢測(cè)需求。

表3 3種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear equations， correlation coefficients， LODs and LOQs of three pesticides

表4 國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)體系中3種農(nóng)藥的最大殘留限量Table 4 The maximum residue limits of three pestcides in domestic and foreign standard systems mg/kg

2.3 方法的回收率與精密度分析

3種農(nóng)藥在雷公藤根和土壤樣中的回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。參考3種農(nóng)藥在國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)體系中的最大殘留限量，每種農(nóng)藥設(shè)定 3個(gè)添加水平，分別加入到不含農(nóng)藥殘留的雷公藤根樣和土壤樣品（未施藥）中，每個(gè)水平平行6次，計(jì)算得出平均加樣回收率在85.22%～113.08%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.56%～5.67%，均符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

表5 3種農(nóng)藥在雷公藤根和土壤樣中的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 5 Average recoveries and RSDs of three pesticides in roots and soil samples （n=6）

2.4 雷公藤樣品和土壤樣品中3種農(nóng)藥殘留檢測(cè)

對(duì)采集于華潤(rùn)三九（黃石）藥業(yè)有限公司雷公藤GAP種植示范基地（湖北省陽(yáng)新縣平原村）的雷公藤根部樣品和土壤樣品各30份進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可見(jiàn)，土壤樣品中辛硫磷、乙基多殺菌素、氯氰菊酯的殘留量均未檢出；根部樣品中辛硫磷的殘留量為0.010～0.037 mg/kg，乙基多殺菌素-J的殘留量為

表6 雷公藤根樣和土壤樣品中3種農(nóng)藥殘留量檢出范圍Table 6 Detected range of three pesticides residues in real samples mg/kg

3 討論

本研究檢測(cè)的3種農(nóng)藥是雷公藤種植過(guò)程中最常用的農(nóng)藥，其中辛硫磷屬于有機(jī)磷類農(nóng)藥，見(jiàn)光易分解、殘留期短、殘留危害小，適合施入土中，防止地下害蟲(chóng)。乙基多殺菌素（XDE-175-J， XDE-175-L）是多殺菌素類的殺蟲(chóng)劑，具有生物農(nóng)藥的安全性和化學(xué)農(nóng)藥的速效性，主要降解方式是光解和微生物降解，最終分解為碳、氮、氧等［14］。氯氰菊酯是廣譜性的菊酯類殺蟲(chóng)劑，廣泛應(yīng)用于中藥材的生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程，其殘留超標(biāo)會(huì)對(duì)人體造成神經(jīng)毒性和生殖內(nèi)分泌毒性，這類農(nóng)藥超標(biāo)較為嚴(yán)重的中藥材是菊花、金銀花和枸杞等［7］，但目前氯氰菊酯在雷公藤種植過(guò)程中的殘留情況很少見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

QuEChERS前處理方法，操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，溶劑少；UPLC-MS/MS檢測(cè)方法線性關(guān)系良好，檢出限和定量限均較低，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，且串聯(lián)質(zhì)譜的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）模式能較好地避免干擾，二者聯(lián)合可滿足定性和定量檢測(cè)要求。QuEChERS/UPLC-MS/MS法的不足之處是需要使用較為貴重的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，儀器操作相對(duì)復(fù)雜。

采用QuEChERS/UPLC-MS/MS法測(cè)定雷公藤及根際土壤中3種農(nóng)藥殘留，在實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果中，土壤樣品中3種農(nóng)藥殘留均未檢出，說(shuō)明在雷公藤的種植過(guò)程中科學(xué)規(guī)范使用辛硫磷、氯氰菊酯和乙基多殺菌素3種農(nóng)藥不會(huì)對(duì)雷公藤根際土壤造成殘留污染。雷公藤根部樣品中辛硫磷和乙基多殺菌素的殘留量較低，均低于GB 2763-2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中對(duì)藥用植物枸杞（干）規(guī)定的最大殘留限量（2 mg/kg），同時(shí)也低于《美國(guó)藥典-國(guó)家處方集》（USP40-NF35）、《歐盟藥典》（EP 9.2）和《日本藥典》（JP 17）中規(guī)定的2種農(nóng)藥的最大殘留限量（0.01 mg/kg）。張治科等［15］采用液相色譜法測(cè)定辛硫磷在甘草中的殘留量，最低檢出限為5.0 μg/kg。本研究建立的UPLC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)最低檢出限為12.5 ng/kg，靈敏度更高。實(shí)際檢測(cè)結(jié)果表明雷公藤根部樣品中辛硫磷的殘留量均較低，說(shuō)明在雷公藤的種植過(guò)程中科學(xué)規(guī)范使用辛硫磷不會(huì)對(duì)中藥材造成殘留污染。GB 2763-2021中對(duì)藥用植物只規(guī)定了枸杞（干）中氯氰菊酯的最大殘留限量（2 mg/kg），《中國(guó)藥典》未對(duì)藥用植物中氯氰菊酯的殘留限量做出規(guī)定，一些國(guó)外的標(biāo)準(zhǔn)體系中制定了藥用植物中氯氰菊酯的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，其中《美國(guó)藥典-國(guó)家處方集》（USP40-NF35）、《歐盟藥典》（EP 9.2）和《日本藥典》（JP 17）中規(guī)定的最大殘留限量為1.0 mg/kg，《韓國(guó)藥典》（KP10）中規(guī)定的最大殘留限量為0.5 mg/kg。楊紅兵等［16］采用氣相色譜法測(cè)定了枸杞中氯氰菊酯的殘留量，檢出限是4.360 μg/kg，而本研究建立的方法檢出限是0.714 μg/kg，靈敏度更高。實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果中，氯氰菊酯在土壤樣品中未檢出，但在雷公藤根部樣品中殘留量在2.940～6.540 mg/kg，表明雷公藤可能對(duì)氯氰菊酯具有富集作用。

本研究建立的檢測(cè)方法和實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果，為制定3種農(nóng)藥在雷公藤及根際土壤中的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)提供了分析方法，對(duì)雷公藤種植過(guò)程中常用農(nóng)藥的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控具有一定的指導(dǎo)作用。但本研究只測(cè)定了乙基多殺菌素2種本體乙基多殺菌素-J和乙基多殺菌素-L的殘留量，為更加嚴(yán)格控制殘留，后續(xù)研究應(yīng)增加2種代謝物N-脫甲基-乙基多殺菌素-J（Ndemethyl-XDE-175-J）和N-甲?；?乙基多殺菌素-J（N-formyl-XDE-175-J）的殘留量檢測(cè)［17］。同時(shí)應(yīng)繼續(xù)深入研究氯氰菊酯在雷公藤中的殘留動(dòng)態(tài)和富集情況，確定其在雷公藤上的使用劑量、施用方式、安全間隔期和安全采收期等，為科學(xué)評(píng)價(jià)該農(nóng)藥在雷公藤上應(yīng)用的殘留風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)，同時(shí)應(yīng)參考國(guó)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合中國(guó)雷公藤種植實(shí)際情況，盡快制定出更完善的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。