丁旭，張浩天，楊凱哲，王哲，張宇，成于思，巢杰

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)系，江蘇 南京 210009 )

外泌體是由細胞分泌釋放到細胞外基質(zhì)的納米級膜性囊泡，富含細胞特異的蛋白質(zhì)、脂類以及核酸等多種生物活性物質(zhì)，參與多種疾病的病理生理過程，本文作者就外泌體在肺相關(guān)疾病中作用的研究進展作一綜述。

1 外泌體的生物學(xué)特性和提取方法

1.1 外泌體的生物學(xué)特性

外泌體是一種由多種免疫和非免疫細胞釋放的雙層磷脂囊泡。外泌體富含生物活性蛋白、脂質(zhì)、核酸等物質(zhì)，這些內(nèi)含物有細胞和組織特異性，并且因細胞的生物活性狀態(tài)不同而改變[1]。外泌體介導(dǎo)物質(zhì)在細胞間的轉(zhuǎn)移是細胞間通信的重要途徑，其也可作為多種疾病的生物標志物，包括神經(jīng)系統(tǒng)﹑心血管系統(tǒng)﹑泌尿系統(tǒng)疾病等，其中以肺部疾病尤為重要[2]。

1.2 外泌體的提取方法

目前對外泌體的提取方法主要有超速離心、免疫吸附、共沉淀、親和層析、密度梯度離心和超濾法等。研究[3]表明，對于外泌體的生物醫(yī)學(xué)研究和臨床治療而言，外泌體的分離和富集是必需的前期分析準備。

2 外泌體與肺部疾病

越來越多的證據(jù)表明，外泌體參與了炎癥性肺部疾病的進展，包括急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)、肺癌等[4]。具有一定的診斷及治療意義。

2.1 ARDS

ARDS是一種急性缺氧性肺功能不全，以頑固性低氧血癥為特點的一組臨床綜合征。ARDS患者的特征性表現(xiàn)有肺毛細血管通透性增加、炎癥細胞浸潤增強以及彌漫性肺泡和肺間質(zhì)水腫[5]。

盡管已開展逾50年的研究，但危重癥患者中ARDS的發(fā)病率及死亡率仍處于較高水平。除此之外，幸存患者由于長期肺功能障礙和心理因素影響等導(dǎo)致其生活質(zhì)量較差。ARDS的治療方案包括液體管理、肺泡表面活性物質(zhì)補充、氣道內(nèi)用藥、糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用、抗氧化劑使用、血液凈化等[6]，但其應(yīng)用是否安全有效在臨床治療中尚存在爭議，ARDS的臨床診治方面仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

近年來多項研究[7-8]顯示了應(yīng)用干細胞分泌的外泌體治療ARDS的巨大前景，其在組織損傷修復(fù)中相比干細胞具有更大的優(yōu)勢：其一，外泌體的性質(zhì)穩(wěn)定，可以長期凍存而不改變生物活性。其二，外泌體的體積很小，可以使得其避免微循環(huán)阻塞迅速到達靶器官并啟動組織修復(fù)。其三，外泌體表面包被磷脂膜，可以保證內(nèi)含的多種生物活性成分不易被酶降解。因此，干細胞分泌的外泌體具有獨特的優(yōu)勢，為有效治療ARDS提供了生物學(xué)依據(jù)。多項研究[9-11]結(jié)果表明，在外泌體中還檢測到了許多具有修復(fù)和再生特性的可溶性因子，如間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分泌的角質(zhì)細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)和血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang1)能夠保護肺泡上皮和內(nèi)皮免受損傷，其他MSCs可溶性因子如白介素-10(interleukin-10，IL-10)和前列腺素-E2(prostaglandin E2，PGE2)可抑制炎癥。

關(guān)于外泌體治療ARDS的潛在機制眾多，它可以通過調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥、組織修復(fù)、促進血管重建等在ARDS治療及預(yù)后中發(fā)揮保護作用。ARDS患者肺功能下降的主要原因是肺間質(zhì)纖維化，其纖維化過程在肺組織損傷早期就已經(jīng)出現(xiàn)，但截至至今尚無防治ARDS后肺間質(zhì)纖維化的特效藥物，于是相關(guān)研究人員聚焦功能強大的外泌體。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號通路作為人體最重要的信號通路之一，功能十分強大，它可以調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化、遷移、衰老、死亡以及細胞外基質(zhì)合成和重塑等生命活動。TGF-β可以由肺內(nèi)多種細胞產(chǎn)生，盡管外泌體對ARDS患者肺纖維化的影響等相關(guān)研究仍處于空缺階段，但許多研究已經(jīng)證明，干細胞釋放的外泌體對其他器官纖維化的保護作用是通過抑制TGF-β通路實現(xiàn)的，這為外泌體治療ARDS引起的肺纖維化提供了廣闊的前景[12]。

綜上所述，外泌體為ARDS的治療提供了新而有力的思路。與此同時，在臨床研究方面也依舊存在著諸多問題亟待解決。

2.2 支氣管哮喘

支氣管哮喘是一種氣道的慢性炎癥性疾病。目前對于哮喘發(fā)病機制研究主要集中在氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性(airway hyper reactivity，AHR)、氣道重構(gòu)、神經(jīng)調(diào)節(jié)機制及其相互作用等幾個方面。其中，AHR是由于氣道對各種刺激因子如變應(yīng)原、藥物等呈現(xiàn)的高度敏感性，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶和(或)咳嗽等癥狀，若診治不及時，隨著病程的延長會產(chǎn)生氣道不可逆性縮窄和氣道重構(gòu)。氣道重構(gòu)作為哮喘重要的病理特征之一，包括結(jié)構(gòu)細胞組成的改變和細胞外纖維化，其發(fā)生主要與持續(xù)存在的氣道炎癥、反復(fù)的氣道上皮損傷和修復(fù)有關(guān)。

有研究[13]表明，哮喘相關(guān)的炎癥細胞如肥大細胞、嗜酸粒細胞等釋放的外泌體或者外泌體miRNA可以作為細胞間信息交換的介質(zhì)，從而促進氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道重構(gòu)的發(fā)展。研究[14]發(fā)現(xiàn),哮喘患者嗜酸粒細胞分泌的外泌體明顯多于健康者,這些外泌體在哮喘的發(fā)生發(fā)展中是不可忽視的。也有研究[15]發(fā)現(xiàn)哮喘患者嗜酸粒細胞分泌的外泌體可促進活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生,進一步損傷氣道上皮細胞，加重氣道炎癥。同時，這種外泌體還可以通過調(diào)節(jié)肺結(jié)構(gòu)細胞，上調(diào)小氣道上皮細胞(small airway epithelial cells，SAEC)中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、趨化因子(C-C基序)配體26(chemokineCC ligand 26，CCL26)和血清骨膜蛋白(periostin，POSTN)的基因表達，延長炎癥狀態(tài)；另一方面還可以誘導(dǎo)SAEC凋亡，延長上皮損傷的修復(fù)時程。因此，嗜酸粒細胞分泌的外泌體可參與到哮喘氣道重構(gòu)過程中，進而促進哮喘的發(fā)展。

此外，其他來源的一些外泌體可作為哮喘等疾病的生物標志物和治療靶點，對哮喘的發(fā)生發(fā)展起到了重要作用。有報道稱哮喘患者肺泡灌洗液中外泌體標志物水平升高，通過測定發(fā)現(xiàn)其中含有區(qū)別于對照組的miRNA種類，因此外泌體可以被視為哮喘的早期標志物。另一組研究表明，哮喘期間IL-13等細胞因子能夠引起哮喘小鼠的上皮細胞外泌體分泌明顯增多，這些上皮細胞來源的外泌體可以誘導(dǎo)未分化巨噬細胞的增殖和趨化。應(yīng)用外泌體抑制劑GW4869后，導(dǎo)致小鼠模型中增殖單核細胞數(shù)量的減少和各種哮喘特征的緩解[16]。因此，推測這些外泌體也可作為預(yù)防和治療哮喘的潛在靶點。

間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體(MSC-exosomes，MSC-Ex)和調(diào)節(jié)性T細胞都是有效的免疫調(diào)節(jié)劑，后者異常增殖和功能改變能夠介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)失衡和慢性變態(tài)反應(yīng)性炎癥，誘導(dǎo)哮喘的產(chǎn)生，而間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可參與介導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞的免疫抑制功能[17]。MSC-Ex通過上調(diào)外周血單個核細胞中的IL-10和TGF-β1，從而促進調(diào)節(jié)性T細胞的增殖和宿主的免疫抑制能力。有實驗[18]證明MSC-Ex調(diào)節(jié)機制可能是抗原呈遞細胞依賴性途徑，也進一步說明間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體在免疫調(diào)節(jié)中起到了關(guān)鍵作用，并且MSC-Ex有對哮喘的治療比基于干細胞治療更具安全性。

2.3 COPD

COPD是一種以呼吸道受阻、進行性氣流障礙為特點的肺部疾病，患病機制與支氣管炎癥及肺成纖維細胞的增殖活化有關(guān)。此病呈緩慢進行性發(fā)展，最終累及多個臟器，對患者的生命造成嚴重的損害。有數(shù)據(jù)顯示，COPD在全世界已成為一種重要的致死因素[19]。

COPD的診斷、治療都與外泌體有一定的聯(lián)系。研究[20]顯示，香煙提取物(cigarette smoke extract，CSE)培養(yǎng)支氣管上皮細胞16HBE產(chǎn)生的細胞上清中外泌體miR-186表達明顯增加，并證實miR-186通過靶向結(jié)合Bcl2L11基因，促進人胚肺成纖維細胞(human fetal lung fibroblast cells，MRC-5)細胞增殖；YANG等[21]用CSE刺激人支氣管上皮細胞HBE后，其細胞上清中外泌體miR-21表達增高，且用細胞上清培養(yǎng)成纖維細胞后發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)高表達的miR-21通過升高缺氧誘導(dǎo)因子1α使成纖維細胞向肌成纖維細胞分化。因此，外泌體miR-186、miR-21與COPD患者肺部的病理改變可能存在關(guān)聯(lián)。謝羽飛等[22]從慢性非阻塞性肺疾病患者的外周血清中提取外泌體，發(fā)現(xiàn)外泌體miR-186的表達相對正常人明顯增高，且通過對患者FEV1%的測量證實血清中miR-186的高表達與肺功能負相關(guān)。也有學(xué)者[23]發(fā)現(xiàn)外泌體可以作為治療COPD的新思路：MSCs可能分泌內(nèi)皮細胞來源的外泌體(endothelial microparticls，EMPs)，此外泌體主要是通過上調(diào)IL-10/TGF-β而發(fā)揮免疫抑制作用。WANG等[24]發(fā)現(xiàn)CSE誘導(dǎo)小鼠氣道上皮細胞(mouse aortic endothelial cells，MAECs)產(chǎn)生的外泌體使髓系細胞觸發(fā)受體-1(triggeringreceptor expressed on myeloid cells 1，TREM-1)的表達增高，從而促進M1型巨噬細胞極化，加重了COPD患者肺部的炎癥反應(yīng)；而敲除TREM-1可以部分逆轉(zhuǎn)CSE誘導(dǎo)MAECs產(chǎn)生的外泌體對M1巨噬細胞極化的促進作用。肺內(nèi)多個不同類型的細胞分泌的外泌體富含半胱氨酸蛋白61(cysteine-richangiogenic inducer-61，CCN1),而CCN1可介導(dǎo)IL-8的升高來誘導(dǎo)炎癥細胞進入肺間質(zhì)中[25]。近期一些研究[26]發(fā)現(xiàn)，COPD患者標本中分泌豐富的IL33Δ34亞型的上皮表達增加，中性鞘磷脂酶2(neutral sphingomyelinase 2，nSMase2)表達增強；進一步研究表明nSMase2可介導(dǎo)IL-33的分泌，IL-33通過nSMase2調(diào)控的多囊泡內(nèi)體(multivesicular endosomes，MVE)途徑附著于外泌體表面與其共分泌。由此推測，外泌體可能在COPD病程的炎癥調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，可以作為COPD治療的靶標。

2.4 IPF

IPF是一種慢性、進行性、間質(zhì)性纖維化的肺疾病，病變一般局限在肺部，IPF的主要特征是肺上皮細胞的損傷、成纖維細胞的活化和細胞外基質(zhì)的沉積。IPF好發(fā)于老年人群，一般確診后的中位生存期僅為2～5 年，5年生存率為20%～ 25%。目前臨床常用抗纖維化劑、抗氧化劑、細胞因子抑制劑等治療方法，但大部分的效果都不太理想，因為它們均不能逆轉(zhuǎn)IPF的進展，所以目前研究新的治療方法對我國嚴重老齡化的基本國情特別重要[27]。

細胞灌洗液中的外泌體是一種存在于局部微環(huán)境中細胞間通信的信使，其在IPF的表達和功能有待進一步確定。以往的實驗[28]結(jié)果顯示IPF患者體內(nèi)的支氣管灌洗液外泌體中miR1403p和miR374b等生物標志物的表達是上調(diào)的，而let-7d、miR30a5p、miR-26a和miR-16這些標志物表達是下調(diào)的。其中l(wèi)et-7d和miR-26a的下調(diào)可能在IPF的病理、發(fā)病和進展中起著核心作用。let-7d的作用是抑制致癌驅(qū)動蛋白和TGF-β的表達增強子——HGMA2的生理作用，可以保護肺泡Ⅱ型上皮細胞；而miR-26a的作用是控制Lin28B的表達，當(dāng)miR-26a表達下調(diào)時Lin28B的表達就會下降，會沉默let-7d的保護作用。

另一個發(fā)現(xiàn)[29]是miR30a5p可抑制MAP3K7結(jié)合蛋白3的表達,而IPF患者支氣管灌洗液的外泌體中miR30a5p表達是下調(diào)的，所以它對MAP3K7結(jié)合蛋白3的抑制作用就會減弱，引起MAP3K7結(jié)合蛋白3反彈式的表達增多，這可能是IPF進展的關(guān)鍵因素。由于相關(guān)研究較少，所以這個發(fā)現(xiàn)還需要進一步的實驗證實。

總的來說，科學(xué)界為了更好地了解IPF的發(fā)病機制和演變所做的研究，對外泌體標志物進行了評估，其中關(guān)于外泌體中miRNAs表達的分析或?qū)⒊蔀镮PF全新且有效的治療靶點。

2.5 肺癌

2020年版GLOBOCAN發(fā)布的全球癌癥數(shù)據(jù)中，肺癌占總體癌癥發(fā)病的11.4%，位居第2，仍是癌癥死亡的重要原因[30]。治療肺癌亟待解決的難題是如何早期明確診斷，并針對靶標提供相應(yīng)的有效治療。

外泌體參與肺癌的發(fā)生發(fā)展，其含有多種蛋白質(zhì)，與肺癌的早期診斷和預(yù)后有著重要聯(lián)系[31]。有研究[32]表明，外泌體中的蛋白質(zhì)可以誘導(dǎo)非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的發(fā)生發(fā)展。NSCLC細胞外泌體富含具有受體功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的蛋白質(zhì)，諸如SRC、EGFR等蛋白，這些蛋白在NSCLC細胞外泌體中聚集，并發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,從而增加受體細胞增殖率，進而促進NSCLC的發(fā)生和發(fā)展。

外泌體中的蛋白質(zhì)影響肺癌的發(fā)生發(fā)展，因此很多人猜測外泌體蛋白質(zhì)有潛力作為肺癌的腫瘤標志物，而一些研究證明了這個猜測。有研究[33]對比150例正常人和431例肺癌患者的血漿中提取的外泌體蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)，CD171、CD151和TSPAN8蛋白在肺癌患者血漿中明顯高表達，在肺癌不同分期CD171、CD151和TSPAN8蛋白的表達水平無明顯差異，這為CD171、CD151和TSPAN8蛋白可能作為早期肺癌診斷標志物提供了依據(jù)。該研究還指出，這3種蛋白質(zhì)的表達因肺癌組織學(xué)類型而異：肺腺癌中CD151、CD171高表達，而在肺鱗癌中CD151、TSPAN8蛋白高表達，CD151蛋白則是在小細胞肺癌唯一表達上調(diào)的蛋白質(zhì)。經(jīng)過評測，多蛋白質(zhì)標志物模型相較于單一蛋白質(zhì)標志物精準度更高。還有研究[34]分析肺癌患者、間質(zhì)性肺炎患者和正常對照組血清發(fā)現(xiàn)，外泌體上的肺腺癌特異性抗原CD91可作為肺癌篩查標志物，并且不受性別和年齡的影響，可作為癌胚抗原的輔助補充檢測，提高精準度。

外泌體miRNA具有促進肺癌發(fā)生發(fā)展的作用，一些研究發(fā)現(xiàn)外泌體miRNA以抑癌基因為靶點，通過抑制抑癌基因從而促進腫瘤細胞的增殖、遷移以及血管的生成。鋅指蛋白Kruppel樣因子9(Kruppel-like factor 9，KLF9)參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并參與細胞的增殖和分化等過程?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)腫瘤組織中鋅指蛋白低表達，從而影響腫瘤細胞的增殖和遷移。有研究[35]發(fā)現(xiàn)，miR-660-5p在NSCLC患者血清外泌體中高表達，并且通過體外實驗證實高表達miR-660-5p能促進細胞的遷移和侵襲能力。另證明KLF9為其靶點，能通過下調(diào)KLF9的表達促進NSCLC的發(fā)生發(fā)展。RCAN1.1和RCAN1.4是抑癌基因RCAN1的兩種主要異構(gòu)體，研究[36]發(fā)現(xiàn)外泌體miR-619-5p能夠抑制RCAN1.4，誘導(dǎo)血管新生，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

外泌體miRNA有作為肺癌早期篩查標志物的潛力。有研究[37]表明，外泌體miRNA-126在肺癌患者與正常人血清中的表達水平存在顯著差異，這為外泌體miRNA-126可作為NSCLC早期篩查的標志物提供了依據(jù)。Zhang等[38]發(fā)現(xiàn)miR-17-92家族中miR-17-5p有潛力作為肺癌輔助診斷的生物標志物，與健康對照組對比，NSCLC患者血清外泌體中miR-17-5p表達顯著上調(diào)，這提示miR-17-5p有潛力作為標志物為NSCLC提供診斷依據(jù)，且同時觀察到肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能與外泌體miR-17-5p的高表達有一定的聯(lián)系。

目前放療、化療、分子靶向及免疫治療等治療方法患者預(yù)后較差，治療過程中的一大難題是產(chǎn)生耐藥，而腫瘤細胞分泌的外泌體可通過多種方式介導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥，進而促進腫瘤的發(fā)展。因此外泌體的研究是治療肺癌減少耐藥的一個重要切入點，通過調(diào)控miRNA的表達可以抑制腫瘤的增殖和遷移，達到治療的效果。研究[39]發(fā)現(xiàn)順鉑(cisplatin，DDP)處理肺癌細胞A549后，其分泌的外泌體可降低其他A459細胞對DDP的敏感性。經(jīng)分析，處理后的A459細胞的外泌體中miRNA-21上調(diào)，將這種外泌體miRNA-21上調(diào)的A549細胞與野生型細胞共同孵育，野生型細胞miRNA-21表達水平亦上調(diào)，并對DDP產(chǎn)生耐藥。這提供了一個新的治療方向，即以外泌體miRNA為靶向，通過人為干預(yù)外泌體表達來達到抑制癌細胞增殖的目的。有研究[40]通過抑制miRNA-181a的表達，成功地提高了肺癌細胞對紫杉醇和鉑類藥物的敏感性，由此證明了外泌體miRNA靶向治療的可行性。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，外泌體廣泛地參與到肺部疾病中，現(xiàn)有研究已闡明部分外泌體在ARDS﹑哮喘﹑COPD﹑IPF和肺癌中的診治作用及分子機制。部分研究為肺疾病的治療提供了新方向：干細胞釋放的外泌體可以治療ARDS后肺纖維化；干細胞來源的外泌體可調(diào)節(jié)哮喘患者肺部失衡的免疫環(huán)境；人工干預(yù)肺癌患者體內(nèi)外泌體miRNA的表達可抑制腫瘤的增殖和遷移。外泌體還被證實在ARDS、哮喘和肺癌等疾病中可作為早期診斷的標志物，但肺疾病中外泌體仍是一個新的研究方向，其所包含的物質(zhì)眾多，作用機制復(fù)雜，研究者仍面臨著很多問題，對于外泌體參與肺部疾病進展的具體分子機制仍需要去探索。