包杰 張靜 陳丹

河南省生殖健康科學(xué)技術(shù)研究院 河南事緣法醫(yī)物證司法鑒定所 河南 鄭州 450002

引言

STR即短串聯(lián)重復(fù)序列，又稱為見微衛(wèi)星DNA，核心序列包括2～7bp，屬于高度串聯(lián)重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)在幾次到幾十次不等。短串聯(lián)重復(fù)序列符合孟德爾遺傳定律，在基因組內(nèi)有著廣泛的分布，存在著高雜合度以及高度多態(tài)性，檢測(cè)難度小，在目前的法醫(yī)學(xué)遺傳標(biāo)記中應(yīng)用十分廣泛，完全可以滿足親子鑒定以及個(gè)體識(shí)別的應(yīng)用需求。另一方面，因?yàn)镾TR基因座突發(fā)概率較大，在親子鑒定方面對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性也有著一定的影響，必須要謹(jǐn)慎對(duì)待，將其帶來(lái)的不利影響降到最低。

1 STR基因座突變規(guī)律

1.1 STR突變規(guī)律

STR基因座現(xiàn)在常被用于親子鑒定，但是其突變率可以達(dá)到0～7×10-3，會(huì)對(duì)鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確率產(chǎn)生影響。為排除這一影響，就需要掌握STR的突變規(guī)律，提前做好預(yù)防和處理[1]。根據(jù)研究可以確定，STR基因座突變?cè)蚴荄NA復(fù)制滑動(dòng)，符合逐步突變模式。每次突變只有一個(gè)重復(fù)單位被改變，在上一次突變的基礎(chǔ)上可以繼續(xù)發(fā)生兩個(gè)或多個(gè)單位的變化，由此可確定多步突變是逐步形成的。

1.2 STR突變步數(shù)

STR等位基因發(fā)生突變，基本上均是重復(fù)單位數(shù)的改變，每個(gè)突變均對(duì)應(yīng)著一個(gè)或數(shù)個(gè)重復(fù)單位的增多/減少。超過(guò)90%的STR突變只有一個(gè)重復(fù)單位的增多/減少，為一步突變。二步突變的概率不足10%，可見多步突變的概率更小[2]。

1.3 STR突變來(lái)源

根據(jù)統(tǒng)計(jì)可確定STR突變主要來(lái)源于父方，可以達(dá)到母方的0.7～14倍，多數(shù)基因座為3～6倍。一旦STR基因座發(fā)生突變，將會(huì)造成重復(fù)單位數(shù)增加或減少，而這一概率父方與母方概率相同，只有較小的概率會(huì)增加重復(fù)單位。

1.4 STR突變率

影響STR基因座突變的重要因素是其多態(tài)性的高低，重復(fù)單位數(shù)目越多相應(yīng)的基因座長(zhǎng)度就越長(zhǎng)，多態(tài)性也會(huì)更高，因此發(fā)生突變的概率更高，如D21S11、FGA等。突變率與完整重復(fù)單位連續(xù)不間斷的長(zhǎng)度幾何平均值為正相關(guān)，甚至是指數(shù)關(guān)系。

1.5 突變的等位基因

即便是一個(gè)基因座，等位基因之間的突變概率也有著較大的差異，主要是因?yàn)榈任换虻耐暾貜?fù)單位數(shù)不同。重復(fù)單位相同且連續(xù)相連，不被不完整重復(fù)單位打斷的較長(zhǎng)的等位基因，發(fā)生突變的概率更高。此種重復(fù)序列在不同的位置均有可能出現(xiàn)復(fù)制滑動(dòng)的情況。正常情況下，存在連續(xù)10個(gè)以上的重復(fù)單位更容易發(fā)生突變。

1.6 其他

隨著父親年齡的增大，STR基因組發(fā)生突變的概率會(huì)一定的增長(zhǎng)。另外，經(jīng)過(guò)觀察X和Y染色體STR突變數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)性染色體STR突變規(guī)律以及突變率與常染色體STR突變沒有明顯差異。

2 STR基因座突變后非父排除率

在不考慮突變的情況下，檢測(cè)的一系列遺傳標(biāo)記中出現(xiàn)任何一個(gè)排除親子關(guān)系的概率即累積非父排除率。一旦STR基因組出現(xiàn)突變，便需要有至少兩個(gè)遺傳標(biāo)記才可以排除親子關(guān)系。經(jīng)過(guò)研究可以確定，檢測(cè)Power Plex 16系統(tǒng)允許三個(gè)基因座突變的累積費(fèi)父排除率＞0.99，檢測(cè)24個(gè)STR允許三個(gè)三個(gè)基因座突變的累積費(fèi)父排除率＞0.9999[3]。

3 STR基因座突變下父權(quán)指數(shù)計(jì)算

3.1 平均突變父權(quán)指數(shù)

在基因座發(fā)生突變的情況下，假如被檢測(cè)男子為真正生父，但是受突變影響出現(xiàn)排除親子關(guān)系分型結(jié)果的概率與突變率一致。被檢隨機(jī)男子并非生父，出現(xiàn)的排除親子關(guān)系分型結(jié)果的概率是非父排除率。基于PI定義分析，PI為兩種情況下概率的比值：AMPI=μ/PE。其中μ表示基因座突變率，PE表示非父排除率[4]。應(yīng)用此種方法計(jì)算，最終得到的AMPI值至于PE大小相關(guān)，與被檢男子的具體基因分型并不相關(guān)。

3.2 傳遞概率計(jì)算法

傳遞概率計(jì)算法的原理于無(wú)突變情況下的PI值計(jì)算方法一致，只是突變親代傳遞等位基因給后代的概率有所改變，與等位基因的突變概率相同。此種方法計(jì)算，主要與爭(zhēng)議父基因型相關(guān)，需要以基因分型信息為支持，得到更具有針對(duì)性的PI值?，F(xiàn)在對(duì)于STR基因座突變的研究越來(lái)越多，掌握了越來(lái)越多的突變數(shù)據(jù)，但是多數(shù)只能夠使用整個(gè)基因座的突變率。傳遞概率法計(jì)算則是需要應(yīng)用到特異等位基因突變概率，要根據(jù)基因座突變率推算得到等位基因的突變概率才可以。由此就決定了此種方法計(jì)算過(guò)程的復(fù)雜性，實(shí)際應(yīng)用中要格外注意。

3.2.1 突變模型。STR等位基因突變概率的計(jì)算模型包括等概率模型、遞減模型、成比例模型、驗(yàn)性遞減模型以及逐步穩(wěn)態(tài)模型。其中，等概率模型以及成比例模型均與逐步突變模型不符。遞減模型符合SMM，將突變概率和重復(fù)序列長(zhǎng)度變化之間的關(guān)系納入到考慮范圍內(nèi)，且對(duì)等位基因頻率數(shù)據(jù)庫(kù)中內(nèi)有的新等位基因情況也進(jìn)行了綜合分析，只是未針對(duì)與等位基因頻率之間的非穩(wěn)態(tài)關(guān)系進(jìn)行分析。經(jīng)驗(yàn)性低價(jià)模型的原理更為簡(jiǎn)單，利用Ms表示等位基因發(fā)生s（s＞1）步突變概率，則Ms≈（1/2）（1/10）|s-1|。逐步穩(wěn)態(tài)模型不僅考慮了突變概率和重復(fù)序列長(zhǎng)度變化的關(guān)系，同時(shí)還考慮了不同等位基因突變概率有所差異的情況。此模型同時(shí)符合SMM和群體等位基因頻率穩(wěn)定不變的要求，相比其他幾種模型，在基因突變概率方面的計(jì)算方面理論上應(yīng)用效果最好。

3.2.2 突變率性別比。存在較多的研究表示父方與母方之間的突變概率有所差異，這樣在計(jì)算突變PI值時(shí)，也需要將此方面的突變率性別差異納入到考慮范圍內(nèi)。例如Brenner按照女性突變率是男性突變率的1/3.5進(jìn)行PI值計(jì)算。

3.2.3 突變方向。雖然在一些研究中STR突變多趨向于增加重復(fù)單位，但是在計(jì)算等位基因突變率時(shí)，往往都是采用突變重復(fù)序列增加或減少機(jī)會(huì)相等的算法進(jìn)行計(jì)算。

3.2.4 一步突變與多步突變。部分情況下孩子等位基因是通過(guò)親代一步突變或者多步突變而來(lái)，例如母方基因型為12，13，孩子基因型為13，14，父方基因型為15，16。對(duì)于多步突變（16突變成14）的情況是否也需要納入考慮，目前尚未完全統(tǒng)一。但是實(shí)際上基因座發(fā)生二步甚至多步突變的概率是非常小的，以及幾乎不對(duì)對(duì)最終PI值的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，大多數(shù)情況對(duì)其是忽略不計(jì)的。

3.2.5 非整數(shù)步突變。假如D24S11基因座中，母方基因型為29，30，孩子基因型為30，31，父方基因型是32，33，就可以判斷存在非整數(shù)突變。但是此種非整數(shù)重復(fù)單位改變的情況下在STR基因座突變中的可能性非常小。其有可能不是重復(fù)序列的改變，而是重復(fù)序列側(cè)翼序列的改變，無(wú)論是選擇逐步穩(wěn)態(tài)模型還是經(jīng)驗(yàn)遞減模型進(jìn)行計(jì)算，均無(wú)法得到準(zhǔn)確的等位基因突變概率，影響最終鑒定結(jié)果可靠性。

3.2.6 父、母均有突變可能性。例如母方基因型為12，13，孩子基因型為12，14，父方基因型為12，15。可以說(shuō)明父母均有基因座突變的可能性，那么在進(jìn)行計(jì)算時(shí)需要考慮母方的突變可能性嗎？相比來(lái)講，如果將母方突變納入到考慮范圍內(nèi)，最終的計(jì)算結(jié)果將會(huì)對(duì)PI值產(chǎn)生明顯的影響。雖然在親子鑒定的實(shí)施中基本上是認(rèn)定父方突變，但是對(duì)于部分特殊案例也有著極大的情況，不能夠完全忽視母方突變的可能性。

4 STR基因座突變對(duì)親子鑒定準(zhǔn)確性影響注意要點(diǎn)

4.1 初步判定突變

在對(duì)一定數(shù)量的STR基因座進(jìn)行檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)其中之后少數(shù) 幾個(gè)基因座排除親子關(guān)系的情況下，不排除存在突變的可能。一般情況下因?yàn)榛蜃亩鄳B(tài)性、突變率以及親子關(guān)系認(rèn)定水平等特點(diǎn)，對(duì)于存在的幾個(gè)的實(shí)際數(shù)量并沒有明確規(guī)定。應(yīng)用PowerPlex 16與AmpFLSTR Identifler系統(tǒng)時(shí)，假如可以檢出15個(gè)STR的基因型，存在3個(gè)以內(nèi)的基因座排除親子關(guān)系，便可懷疑存在突變。其他不排除親子關(guān)系基因座的累積非父排除率可以達(dá)到99%以上。如果存在4個(gè)及以上也無(wú)法排除STR突變的可能性，只能夠確定突變的概率比較小。

4.2 增多基因座數(shù)目

測(cè)序是可以鑒定是否存在突變的有效方法，其中需要增加檢測(cè)的遺傳標(biāo)記數(shù)，可以通過(guò)累積非父排除率進(jìn)行估計(jì)。累積非父排除率越高以及允許突變基因座越多的情況下，需要檢測(cè)的遺傳標(biāo)記也就越多。并且，對(duì)于需要增加檢測(cè)遺傳標(biāo)記的情況，依然存在著新突變發(fā)生的可能。

4.3 區(qū)分突變情形

4.3.1 沉默等位基因。如果出現(xiàn)親代一方與孩子全部表現(xiàn)為純合子的情況，如母方分型為29，30，孩子分型是30，父方分型為32，便需要注意因等位基因漏擴(kuò)產(chǎn)生的沉默等位基因。沉默等位基因基本上均是引物和模板間不配對(duì)導(dǎo)致，可選擇不同引物或試劑盒檢測(cè)，還可以通過(guò)改變擴(kuò)增條件來(lái)進(jìn)行證實(shí)。以ISFG要求為依據(jù)，要對(duì)沉默等位基因基因座的PI值進(jìn)行計(jì)算。

4.3.2 親屬個(gè)體代替檢驗(yàn)。存在親緣關(guān)系的個(gè)體之間具有相同等位基因的可能性要高于隨機(jī)個(gè)體之間的概率。假如與生父存在親緣關(guān)系的個(gè)體代替生父進(jìn)行親子鑒定，便有一定的可能性檢測(cè)出被檢男子與孩子之間存在個(gè)別基因座排除親子關(guān)系的可能性。但是被檢測(cè)的基因座數(shù)目越多，則出現(xiàn)這種情況的可能性也越低。

4.3.3 單親二體。子代一對(duì)染色體完全來(lái)自母方或父方，如果是單親二體將會(huì)導(dǎo)致假排除，一般需要對(duì)同一號(hào)染色體上的多個(gè)基因座進(jìn)行檢測(cè)來(lái)證實(shí)。

5 STR基因座突變對(duì)親子鑒定準(zhǔn)確性影響試驗(yàn)

5.1 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

3130型自動(dòng)遺傳分析儀、Identifiler plus試劑盒與9700型PCR擴(kuò)增儀。

5.2 試驗(yàn)方法

①DNA提取與擴(kuò)增。應(yīng)用Identifiler plus試劑盒進(jìn)行15個(gè)STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增處理，包括D8S1179、D2S1339、D21S11、D19S433、CSF1PO、D16S539、TH01、D3S1358、FGA、D18S51、TPOX與D2S1338。 控制整個(gè)反應(yīng)體系為10μL，并按照親子鑒定要求完成各項(xiàng)參數(shù)的設(shè)置：30℃條件小操作10min，41℃條件下處理30min，99℃下處理5min，5℃下處理5min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)處理，且最后的10min需要延長(zhǎng)，調(diào)整溫度為72℃。處理后得到的產(chǎn)物要置于4℃條件下保存。②檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。應(yīng)用Chelex-100提取模板BNA，并將處理得到的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)3500DX基因分析儀完成毛細(xì)血管電泳。再利用全自動(dòng)分析儀來(lái)確定親權(quán)關(guān)系。

5.3 試驗(yàn)結(jié)果

用于本次試驗(yàn)的親子鑒定標(biāo)本共有3120份，支持親子關(guān)系的有1946份，三聯(lián)體806份，二聯(lián)體1150份，合計(jì)觀察到減數(shù)分裂共有1805次，15例基因座突變，突變率為0.83%。其中，突變率前三位基因分別是D8S1179、D21S11和D2S1339?？梢源_定STR在DNA合成過(guò)程中存在著比較高的突變率，造成基因突變，而對(duì)親子鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。

6 結(jié)束語(yǔ)

STR基因座在親子鑒定中存在著比較高的突變率，尤其是父方突變概率要高于母方。為降低突變對(duì)鑒定結(jié)果的影響，需要掌握STR基因座突變的規(guī)律，總結(jié)基因突變情況計(jì)算侵權(quán)指數(shù)，進(jìn)一步提高親子鑒定的準(zhǔn)確性。