陳 威，梁 新，蘇 捷，陳琦松，陳佳婧，朱麗君，雷 昌

（1.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），云南 大理 671000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

滇黃芩（Scutellaria amoena）為唇形科黃芩屬植物的干燥根，是云南道地藥材，藥用歷史悠久，為白族、彝族、僳僳族、藏族、納西族等少數(shù)民族的藥用資源[1]，其性寒，味苦，歸肺、胃、膽、肝、大腸路，具有清肺胃熱、燥濕氣、解毒、消炎、止血、安胎、降脂等功效[2，3]。有研究表明[4]，滇黃芩對臨床常見的金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等多種致病微生物均有不同程度的抑制作用，但對滇黃芩發(fā)揮抗菌作用的藥效物質(zhì)及作用機(jī)制尚缺乏整體認(rèn)識，導(dǎo)致無法系統(tǒng)評估其潛在的應(yīng)用價(jià)值與替代黃芩藥用的合理性，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用和推廣。超高效液相色譜四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography -quadrupole -time -of -flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)是液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)在近年的一個(gè)新進(jìn)展，能夠靈敏、可靠、快速全面地對中藥多成分體系進(jìn)行鑒定與分析；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治原則相吻合的新興藥理學(xué)分支學(xué)科[5，6]，通過利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫和計(jì)算機(jī)軟件，構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)-通路”的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)，具有整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)；兩者結(jié)合可初步闡明復(fù)方制劑體內(nèi)“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”作用機(jī)制，近年來已被廣泛用于中藥藥效物質(zhì)及作用機(jī)制研究領(lǐng)域[7-9]。本研究主要采用UPLC-Q-TOFMS 技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析滇黃芩抗菌的潛在藥效物質(zhì)及作用機(jī)制，以期為滇黃芩抗菌的藥效物質(zhì)及作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Acquity 超高效液相色譜儀、Xevo G2-XS 型四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、離子源為雙源電噴霧離子源（美國Waters 公司），超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），萬分之一電子分析天平（梅特勒）。水為屈臣氏蒸餾水，乙腈為質(zhì)譜純，甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純。滇黃芩植物樣品于2019 年8 月采自云南省大理州洱源縣，經(jīng)大理大學(xué)藥物研究所肖朝江博士鑒定為滇黃芩（Scutellaria amoenaC.H.Wright）。

1.2 滇黃芩化學(xué)成分分析 ①滇黃芩提取物的制備[4]：取滇黃芩10 g，粉碎后分別以85%乙醇200 ml 冷浸提取3 次，24 h/次，再以超聲提取2 次，30 min/次，合并提取液，減壓濃縮，凍干，即得滇黃芩提取物凍干粉；②供試品溶液的制備：精密稱定滇黃芩提取物3.0 mg，置具塞錐形瓶中，加入色譜甲醇20 ml，超聲（功率250 W，頻率53 kHz）提取20 min，放冷，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；③色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～4 min，5%～16%A；4～13 min，16%～48%A；13～20 min，47%～64%A；20～27 min，64%～89% A；27～30 min，89%～100%A；30～32 min，100%～5%A；32～33 min，5%A)，流速0.4 ml/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量3 μl；④質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子2 種模式進(jìn)行檢測。質(zhì)譜數(shù)據(jù)格式為Continuum，霧化氣（N2）流速為800 L/h，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣溫度600 ℃，毛細(xì)管電壓2.5 kV。錐孔電壓（sampling cone）40 V，補(bǔ)償電壓（source offset）80 V，氣簾氣流速（cone gas flows）為50 L/h，質(zhì)量掃描范圍為100～1200 m/z，內(nèi)參校準(zhǔn)液亮氨酸-腦啡肽（554.2615 m/z）作為相對分子質(zhì)量實(shí)時(shí)校正。

1.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.3.1 滇黃芩抗菌作用靶點(diǎn)的預(yù)測 通過中藥藥理學(xué)技術(shù)平臺（TCMSP 數(shù)據(jù)庫）對UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)鑒定的滇黃芩化合物檢索查詢，同時(shí)在“Related Targets”頁面中將上述化合物編號導(dǎo)入，得到滇黃芩化學(xué)成分的靶標(biāo)蛋白。將獲得的化合物靶點(diǎn)信息導(dǎo)入U(xiǎn)niport 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），借助STRING（https://string-db.org/）中Multiple proteins 搜索功能以及UniProt（http://www.uniprot.org/）中UniProtKB 搜索功能，輸入蛋白質(zhì)名稱，物種選擇為“Homo sapiens”，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，下載結(jié)果。在GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中檢索抗菌相關(guān)靶點(diǎn)，將結(jié)果導(dǎo)入Excel，與滇黃芩成分靶點(diǎn)一同導(dǎo)入Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）中進(jìn)行映射，記錄二者的交集部分，繪制韋恩圖。

1.3.2 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述篩選所得到潛在靶點(diǎn)輸入STRING 數(shù)據(jù)庫，限制物種為“Homo sapiens”，置信度為中等0.04，得到PPI 核心網(wǎng)絡(luò)，并將結(jié)果以TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1，導(dǎo)出相應(yīng)的拓?fù)鋮?shù)值，得到PPI 圖。

1.3.3 GO 功能與模塊分析、KEGG 富集通路分析 將篩選出的滇黃芩抗菌的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/），限制物種條件為“Homo sapiens”，閾值P＜0.05，采取基因本體論（GO）功能和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，再用Graph－Pad Prism 7 和在線繪圖網(wǎng)站imageGP（http://www.ehbio.com/ImageGP/index）將結(jié)果可視化。

1.3.4 滇黃芩“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用Cytoscape 3.6.1（https://cytoscape.org/）軟件，構(gòu)建滇黃芩活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，分析化合物和靶點(diǎn)間的度（degree）值關(guān)系，其中節(jié)點(diǎn)代表化學(xué)成分、靶點(diǎn)和信號通路，邊用來連接化學(xué)成分、靶點(diǎn)和信號通路。

1.3.5 分子對接驗(yàn)證 選取度值較為靠前的成分及靶點(diǎn)對其進(jìn)行分子對接。在TCMSP 平臺下載活性成分結(jié)構(gòu)的mol2 格式文件，并在PBD（https://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載相應(yīng)靶點(diǎn)3D 結(jié)構(gòu)的pdb 文件，運(yùn)用AutoDock4.2.6 軟件，對靶點(diǎn)及活性成分進(jìn)行分子對接分析，并使用PyMol2.4.1 軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 滇黃芩的主要化學(xué)成分 通過UPLC-Q-TOFMS 技術(shù)分析得滇黃芩總離子流色譜圖，見圖1。采用MassLynx V4.1 軟件提取總離子流色譜圖，獲取化學(xué)成分的保留時(shí)間、質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰和碎片離子峰等信息，參考自檢數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)，推測化學(xué)成分，結(jié)果在滇黃芩中共鑒定21 個(gè)化學(xué)成分，UPLC-Q-TOF/MS 數(shù)據(jù)見表1。

表1 滇黃芩化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MS 鑒定

圖1 滇黃芩在正離子和負(fù)離子模式下的總離子流

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 滇黃芩中化合物與抗菌作用的交集基因 通過TCMSP 獲取各活性成分作用靶點(diǎn)，查詢結(jié)果包括滇黃芩122 個(gè)無重復(fù)靶點(diǎn)。通過Gene Cards 查詢獲得抗菌作用靶點(diǎn)1895 個(gè)，無重復(fù)靶點(diǎn)。由在線韋恩圖可知，滇黃芩中化合物與抗菌作用的交集基因有67 個(gè)，借助Venny 2.1.0 將結(jié)果可視化，結(jié)果見圖2。

圖2 滇黃芩中化合物及其與抗菌作用相關(guān)靶點(diǎn)的交集基因

2.2.2 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 憑借STRING和Cytoscape 3.6.1 構(gòu)建交集基因的蛋白質(zhì)相互作用（PPI），網(wǎng)絡(luò)含有72 個(gè)節(jié)點(diǎn)和2034 條邊。對網(wǎng)絡(luò)發(fā)展中所存在的各個(gè)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行研究分析，得到節(jié)點(diǎn)度值27，故以大于等于2 倍度值進(jìn)行篩選分析，得 到PTGS2、CASP9、AKT1、HSP90AA1、TP53、JUN 等為主的35 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，見圖3。

圖3 滇黃芩與抗菌蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)(PPICN)

2.2.3 生物過程和通路富集分析 DAVID 中GO 功能富集分析中獲得的GO 條目共288 個(gè)（P＜0.05），其中包括生物過程條目230 個(gè)，涉及對藥物的反應(yīng)、DNA 模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié)等；細(xì)胞組成條目17 個(gè)，涉及細(xì)胞外間隙、細(xì)胞溶質(zhì)、質(zhì)膜等；分子功能條目41 個(gè)，涉及酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。該結(jié)果中生物過程、細(xì)胞成分和分子功能分別占79.9%、5.9%和14.2%，運(yùn)用GraphPad Prism 7 對生物通路結(jié)果進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見圖4。KEGG 通路富集分析共獲得88 條信號通路（P＜0.05），涉及HIF-1、TNF、p53 和FoxO 信號通路等，選取排名靠前的通路繪制氣泡圖，結(jié)果見圖5。

圖4 滇黃芩活性成分潛在靶點(diǎn)的GO 生物學(xué)過程富集分析

圖5 滇黃芩活性成分潛在抗菌靶點(diǎn)的KEGG 代謝通路富集分析

2.2.4 滇黃芩“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 構(gòu)建主要成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，其中“菱形”代表通路，“三角形”代表抗菌作用靶點(diǎn)，“V 形”代表化學(xué)成分，該網(wǎng)絡(luò)由65 個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括10 種成分、35 個(gè)靶點(diǎn)、10 條通路和294 條邊，其中化學(xué)成分芹菜素、黃芩素、5，7，4'-三羥基-8-甲氧基黃酮等節(jié)點(diǎn)較大，表明與其相連的節(jié)點(diǎn)較多，可能是重要活性成分；另外，PTGS2、HSP90AA1、CASP9 等靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)較大，可能是重要作用靶點(diǎn)，其中HIF-1、TNF、p53 等通路可能是重要通路，見圖6。

圖6 滇黃芩活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.2.5 分子對接結(jié)果 將度值靠前的活性成分芹菜素、黃芩素、5，7，4'-三羥基-8-甲氧基黃酮與潛在活性成分中度值較為靠前的PTGS2、HSP90AA1、CASP9 以及NFKBIA 進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示所有靶點(diǎn)與分子均對接成功，見表2。結(jié)合能數(shù)值越小，則結(jié)合越穩(wěn)定，本研究選取結(jié)合最穩(wěn)定的對接結(jié)果見圖7。

表2 滇黃芩活性成分與靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

圖7 滇黃芩活性成分與靶點(diǎn)分子的對接結(jié)果

3 討論

課題組前期對滇黃芩做過抗菌活性研究[4]，但缺少對其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制的系統(tǒng)探討。UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)是分析中藥藥效的強(qiáng)有力工具，在沒有標(biāo)準(zhǔn)品的條件下，通過采用串聯(lián)質(zhì)譜分析化合物的一級和二級質(zhì)譜信息，可以大致推測其化合物結(jié)構(gòu)和類型，從而進(jìn)行定性分析。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)對滇黃芩的化學(xué)成分進(jìn)行分析，鑒定出了21 個(gè)主要化學(xué)成分，以黃酮類化合物為主，提示滇黃芩抗菌的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是黃酮類成分，這與既往研究報(bào)道相似[10-12]。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對滇黃芩的主要活性成分、作用靶點(diǎn)、相關(guān)生物信號通路等幾個(gè)方面的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了探討，并由“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖可知芹菜素、黃芩素、5，7，4'-三羥基-8-甲氧基黃酮等可能為滇黃芩抗菌的主要藥效物質(zhì)。研究表明，芹菜素與氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素聯(lián)用對MRSA菌株呈現(xiàn)協(xié)同作用[13]；黃芩素是一種具有抗腫瘤、抗菌、抗炎等功能的天然生物活性化合物，能夠抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，并通過下調(diào)NF-κB和p38 MAPK 表達(dá)水平對肺炎球菌性肺炎小鼠發(fā)揮良好的保護(hù)作用[14，15]；其余幾種節(jié)點(diǎn)較大的重要活性成分文獻(xiàn)報(bào)道較少，其藥效及作用機(jī)制需進(jìn)一步研究證明。

滇黃芩抗菌靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)顯示，PTGS2、TP53、AKT1、CASP9、HSP90AA1、JUN 等35 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)在滇黃芩抗菌中發(fā)揮重要作用。有研究表明[16]，中藥主要通過PTGS2 參與紅素結(jié)合和控制雙加氧酶活性，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，提高促炎介質(zhì)水平治療布魯氏菌病。當(dāng)發(fā)生幽門螺旋桿菌引發(fā)的胃炎感染時(shí)，可引起抑癌基因TP53 下調(diào)，并且持續(xù)的炎癥導(dǎo)致TP53 突變與胃癌的發(fā)展緊密相關(guān)[17，18]。AKT1 與多種細(xì)菌感染途徑有關(guān)，如銅綠假單胞菌感染可通過抑制Akt1/mTOR 通路誘導(dǎo)自噬體形成[19]。GO 生物學(xué)過程富集分析顯示，滇黃芩抗菌主要涉及藥物反應(yīng)、蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的陽性調(diào)控等生物過程。由KEGG 通路富集網(wǎng)絡(luò)分析顯示，HIF-1、TNF、p53 和FoxO 等信號通路可能是滇黃芩抗菌的關(guān)鍵通路。TNF 是一類具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，能夠與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長、分化凋亡及誘發(fā)炎癥等生物學(xué)效應(yīng)，參與抗細(xì)菌和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程[20]。HIF-1 通路的激活可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌的殺菌作用[21]。

綜上所述，本研究初步揭示了滇黃芩抗菌的關(guān)鍵藥效物質(zhì)為芹菜素、黃芩素、5，7，4'-三羥基-8-甲氧基黃酮，其抗菌的作用機(jī)制與HIF-1、TNF、p53、FoxO 通路相關(guān)，為后續(xù)該藥材的合理開發(fā)、質(zhì)量控制、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究提供了理論依據(jù)。