楊志勇,劉維娜

西安國際醫(yī)學中心醫(yī)院重癥醫(yī)學科,陜西西安 710100

膿毒癥是機體對感染的反應失調導致危及生命的器官功能障礙性疾病，通常伴隨嚴重創(chuàng)傷、燒傷、休克和大手術，臨床表現(xiàn)為炎癥介質大量釋放到外周血中，該病是重癥監(jiān)護室(ICU)的常見病[1]。嚴重膿毒癥或膿毒性休克導致的病死率預計為28%～50%[2]，其原因之一是膿毒癥的臨床癥狀不典型，若根據(jù)微生物培養(yǎng)及藥敏結果指導臨床使用抗菌藥物，會延誤患者病情，進而增加死亡風險。因此，尋找膿毒癥進展的生物標志物對于膿毒癥的診斷、治療及預后至關重要。有多個研究證實長鏈非編碼RNA(lncRNA)與膿毒癥的進程密切相關，其調控機制也有了一些報道[3-6]。長鏈非編碼RNA-腫瘤壞死因子相關異種核糖核蛋白(lncRNA THRIL)可通過調控腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達及活性而參與炎性反應[7-8]，但其在膿毒癥中的作用如何報道較少，故本研究探討膿毒癥患者血清lncRNA THRIL的表達情況及其與膿毒癥嚴重程度的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年9月至2021年9月在本院ICU治療的膿毒癥患者作為試驗組。納入標準：(1)符合2016年美國重癥醫(yī)學會與歐洲重癥醫(yī)學會聯(lián)合發(fā)布的《膿毒癥的定義與診斷標準》[9]；(2)年齡≥18歲，<75歲。排除標準：(1)年齡<18歲者；(2)自身免疫缺陷綜合征患者或近半年使用免疫抑制劑者；(3)合并惡性腫瘤者；(4)妊娠期或哺乳期女性；(5)嚴重肝腎功能障礙者；(6)惡性血液病或血液傳染病者。試驗組共入組117例：其中男60例，女57例；年齡29～71歲，平均(59.29±12.28)歲；一般膿毒癥33例，嚴重膿毒癥46例，膿毒性休克38例；按照急性生理學與慢性健康狀況評分Ⅱ(APACHEⅡ評分)，該評分系統(tǒng)包括年齡、格拉斯哥昏迷評分(GCS)、生理指標及有無嚴重器官系統(tǒng)功能不全及免疫損害等，將患者分為輕度30例，中51例，重度36例。收集同期在本院體檢的健康志愿者共78例作為對照組。對照組中男38例，女40例；年齡28～72歲，平均(60.31±10.37)歲。兩組受試者年齡(t=1.291，P=0.087)、性別構成(χ2=0.123，P=0.726)比較，差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。兩組受試者均簽署知情同意書，且本研究經本院倫理委員批準。

1.2方法 采集受試者清晨空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min離心15 min，立即采用Trizol試劑(Takara，日本)提取血清總RNA，通過分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的水平和純度，當純度處于1.8～2.1時可進行反轉錄試驗。取1 μg總RNA以Random Primer &Oligo DT為引物反轉錄為cDNA(ribo SCRIPTTM Reverse Transcription kit，廣州瑞博生物技術有限公司)；采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測lncRNA THRIL表達，嚴格按照SYBR Green PCR試劑盒(ribo SCRIPTTM lncRNA qRT-PCR Starter Kit，廣州瑞博生物技術有限公司)說明書操作。引物序：lncRNA THRIL上游引物5’-AACTTCACAGGAACACTACACAAGA-3’，下游引物5’-TAGGCAACA GAGAGCAAGACTTCATC-3’；內參為GAPDH，上游引物5’-GGCTAGTCGTAGCATCG-3’，下游引物5’-TGGCATGCCCGATCGATC-3’。擴增程序：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行40個循環(huán)，每次試驗設置5個復孔，反應結束后采用2-ΔΔCt計算lncRNA THRIL的相對表達水平。

2 結 果

2.1試驗組和對照組lncRNA THRIL表達差異 對lncRNA THRIL進行正態(tài)性檢驗，兩組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)性分布(P=0.200，0.051)。試驗組患者lncRNA THRIL的相對表達量為2.61±0.82，對照組的相對表達量為1.33±0.47，試驗組患者lncRNA THRIL相對表達量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=-13.627，P<0.05)。

2.2lncRNA THRIL表達水平與膿毒癥患者臨床病理參數(shù)的關系 lncRNA THRIL表達水平與患者年齡、性別無關(P>0.05)，lncRNA THRIL在不同膿毒癥嚴重程度患者及由APACHEⅡ評分判斷不同嚴重程度患者中表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，膿毒性休克及APACHEⅡ評分判斷為重度的患者lncRNA THRIL表達水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)膿毒癥患者血清lncRNA THRIL表達水平

2.3ROC曲線評估lncRNA THRIL對膿毒癥患者預后的預測價值 試驗組膿毒癥患者中共43例死亡，74例生存，采用ROC曲線評估lncRNA THRIL對膿毒癥患者預后的預測價值，結果表明lncRNA THRIL可以作為膿毒癥患者預后的潛在分子標志物(P<0.001)。其預測膿毒癥患者預后的曲線下面積(AUC)為0.839，95%CI為0.764～0.915，約登指數(shù)為0.692，靈敏度、特異度分別為87.8%、81.4%。見圖1。

圖1 lncRNA THRIL預測膿毒癥患者預后的ROC曲線

3 討 論

lncRNA參與機體免疫反應已被越來越多地揭示，其免疫調節(jié)作用也已在各種免疫細胞，如單核細胞和樹突狀細胞中得到證實[10]。此外，在調節(jié)型T細胞(Th)1、Th2和Th17的分化過程中，不同的lncRNA也表現(xiàn)出不同的作用，這進一步說明了lncRNA與炎性反應和炎癥因子表達密切相關[11-12]。LncRNA在膿毒癥中的作用也逐漸被報道，ZHAN等[13]通過盲腸結扎和穿刺建立膿毒性腦病大鼠模型，注射shRNA-LncRNA-5657治療大鼠，結果發(fā)現(xiàn)治療后抑制了大鼠海馬神經元變性和降低壞死水平，降低了水通道蛋白4(AQP4)、肝素酶(HPSE)和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的免疫反應性，并降低了TNF-α的水平。這些發(fā)現(xiàn)表明，lncRNA-5657的表達可以顯著減輕膿毒性腦病期間的炎性反應，并誘導對該疾病的保護作用。袁超等[14]探討了lncRNA MEG3在膿毒癥患者中的表達情況及意義，結果發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3在膿毒癥患者血漿中高表達，并且其表達水平與膿毒癥的嚴重程度有一定相關性，可以作為膿毒癥預后的預測因子。lncRNA與膿毒癥進展的機制包括：作用miRNA的“分子海綿”，與miRNA形成分子海綿，進一步影響炎癥細胞因子TNF-α、白細胞介素等的表達[6,14]；或通過細胞信號通路而影響炎癥因子水平[15-16]。

lncRNA THRIL通過調控TNF-α水平參與體內的炎性反應和免疫應答，XU等[17]通過臨床試驗發(fā)現(xiàn)THRIL高表達與骨肉瘤組織和血清樣本中TNF-α水平升高有關。另外lncRNA THRIL過表達與心肌細胞損傷和心功能不全有關[18]。還有研究表明在膿毒癥小鼠模型中，抑制lncRNA THRIL可減少炎癥細胞數(shù)量和促炎細胞因子的產生[19]。本研究探討lncRNA THRIL在膿毒癥患者血清中的表達情況，并進一步探討其與膿毒癥嚴重程度的關系及對膿毒癥預后的預測價值。結果顯示，與對照者相比，lncRNA THRIL在膿毒癥患者血清高表達，并且其表達水平與膿毒癥的嚴重程度有一定關系。lncRNA THRIL預測膿毒癥患者預后的AUC為0.839，靈敏度、特異度分別為87.8%、81.4%。以上結果表明lncRNA THRIL與膿毒癥的嚴重程度有關，并對膿毒癥預后有一定預測價值。該結果與LIU等[20]的結果有一定的一致性，該研究者發(fā)現(xiàn)lncRNA THRIL在膿毒癥患者中表達上調，lncRNA THRIL的過表達導致TNF-α的水平增加是脂多糖(LPS)誘導的炎性反應的增強劑。

綜上所述，lncRNA THRIL表達水平與膿毒癥的嚴重程度有一定關系，并且對于ICU膿毒癥患者的預后有一定預測價值，可進一步在臨床中擴大樣本量進行研究，為膿毒癥的診斷、治療和預后提供更多的參考。