秦卓明，馬秀麗，亓麗紅，黃兵，高月花，劉麗萍，黃迪海，秦春芝，徐懷英**

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省健牧生物藥業(yè)有限公司，山東 濟(jì)南 250100）

傳染性喉氣管炎（Infectious Laryngotracheitis，ILT）是由傳染性喉氣管炎病毒（Infectious Laryngotracheitis Virus，ILTV）引起雞的一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞上呼吸道，同時(shí)對眼睛、鼻竇、氣囊和肺等組織產(chǎn)生影響。典型癥狀為呼吸困難、氣喘，咳出帶血分泌物、眼結(jié)膜炎和眼簾腫脹等。剖檢可見喉部和氣管黏膜腫脹、出血等，嚴(yán)重的病例則具有較高的致死性，死亡率可高達(dá)40%以上。除了ILT的典型癥狀外，ILT還可以表現(xiàn)為溫和型，表現(xiàn)為黏液性氣管炎、鼻炎、眼結(jié)膜炎、眼流淚等輕微癥狀[1]。傳統(tǒng)認(rèn)為，該病大多數(shù)發(fā)生在成年雞和產(chǎn)蛋雞，雛雞感染率較低。但是，近年來，1月齡內(nèi)商品肉雞發(fā)生ILT的病例不斷攀升，呈現(xiàn)出新的發(fā)病和流行趨勢[2-3]。

ILT是世界上第一個(gè)利用疫苗成功控制的家禽疫病，變異頻率相對較低。盡管如此，ILTV屬于DNA病毒，對外界抵抗力較強(qiáng)，蛋、種雞等廣泛的疫苗接種，使得ILTV野毒株普遍存在，通常每隔3~5年就流行一次[4-5]。

中國ILT最早發(fā)生在貴陽（1959）。自20世紀(jì)80年代以來，該病伴隨著我國養(yǎng)雞業(yè)的蓬勃發(fā)展，已逐漸成為我國重要的地方流行性疫病。過去ILT的發(fā)病主要是以已開產(chǎn)的蛋雞和種雞為主，雛雞和育成雞較少發(fā)生。但自2018年以來，該病在我國江蘇、山東等地的商品肉雞流行普遍[6]，造成了極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料和方法

1.1 發(fā)病背景

2018~2021年，山東臨沂、濰坊、棗莊等地以及江蘇連云港、徐州等地的規(guī)?；唐冯u場、蛋雞場等陸續(xù)發(fā)生了一種以嚴(yán)重呼吸困難、咳血、氣管黏膜出血和充血的雞病。主要危害20~50日齡的白羽商品肉雞和地方品種雞，以30~35日齡居多。白羽肉雞的發(fā)病較多，且多數(shù)未經(jīng)免疫。雞群一旦感染，則傳播速度較快，感染率在80%以上，死亡率在5%~30%，嚴(yán)重的死亡率可高達(dá)45%，幾乎無藥可治，嚴(yán)重影響雞群的生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效益。

1.2 病料處理

剖檢具有典型癥狀的發(fā)病雞或死亡雞，取其氣管黏膜或刮取黏膜黏液作為病料。病料剪碎后按1：3的比例加入滅菌的PBS溶液，反復(fù)凍融3次后，離心取上清，然后加入青、鏈霉素(2 000 U/mL) 置4 ℃冰箱過夜處理， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑、材料和儀器

Simply P病毒DNA/RNA共提取試劑盒，購自杭州博日科技有限公司；DNA膠回收試劑盒，購自天根生物科技有限公司；2×Premix Taq、DL2000bp DNA Marker，購自寶生物（北京）有限公司；PCR儀，購自Thermo Fisher公司；9~10日齡SPF雞胚由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供。

1.4 SPF雞胚接種

將無菌檢驗(yàn)合格的病料經(jīng)絨毛尿囊膜（CAM）途徑接種10日齡SPF雞胚，每日照蛋，舍棄48 h內(nèi)非特異性死亡雞胚，觀察至120 h，死亡胚和120 h活胚及時(shí)放置4 ℃冰箱并保存過夜。在生物安全柜內(nèi)，觀察CAM和雞胚病變。同時(shí)將CAM剪碎研磨，加入PBS稀釋，反復(fù)凍融3次，離心取上清，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∩倭繕悠诽崛『怂?，進(jìn)行ILTV鑒定。

1.5 病原核酸鑒定

以ILTV 的ICP4基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)ILTV的鑒定用引物，建立相應(yīng)的反應(yīng)條件[7]。

1.6 gB基因序列測定

參考GenBank中ILTV經(jīng)典株的結(jié)構(gòu)蛋白gB基因序列，利用Prime preimer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)：5’-TTCGTCTTCGCTTTCTTCTGCC-3’，R：5’-CGCGGTCCTGTATGCAATCC-3’，引物由華大基因合成。

按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書，提取樣品的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩CR反應(yīng)體系為：2×Premix Taq 25 μL，待檢DNA模板2 μL，上下游引物（10 mmol/L）各2 μL，最后用RNA-free H2O補(bǔ)足反應(yīng)體系至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；進(jìn)入94 ℃變性35 s， 58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 180 s，共進(jìn)行33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，選取2 660 bp目的條帶回收后，連接pMD18-T 載體，轉(zhuǎn)化DH5α，接種LB 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，挑取菌落進(jìn)行PCR 鑒定。將陽性菌落接種LB 液體培養(yǎng)基增菌，送華大基因進(jìn)行測序。

1.7 同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank中選擇國內(nèi)外的ILTV代表毒株gB核苷酸序列，利用Lasergen 7.1和MEGA5.1軟件，比較其核苷酸同源性，并采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建支原體的系統(tǒng)發(fā)育樹，探討不同ILTV分離株及其與疫苗株間的遺傳距離和系統(tǒng)演化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 臨床概況

2.1.1 流行病學(xué) 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所禽病診斷中心的檢測數(shù)據(jù)表明，雞ILT在2018年以后呈現(xiàn)逐年增加趨勢。2018年送檢病例24例，2021年增加到103例。在送檢的疑似ILT的278份病例中，ILT的PCR陽性檢出率高達(dá)40%，如圖1。

圖1 ILT疑似送檢樣品數(shù)、陽性數(shù)以及PCR陽性檢出率

2.1.2 典型案例 自2018年10月以來，臨床報(bào)導(dǎo)ILT的病例逐漸增多，先是地方品種雞發(fā)病。隨后，在2020年5月~2021年4月，商品肉雞發(fā)生ILT達(dá)到高峰。表1顯示的是2018~2021年間幾次典型的ILT疫情發(fā)生概況。調(diào)查顯示，首先發(fā)生ILT疫情的商品肉雞主要集中在魯南和江蘇連云港等地，該地區(qū)蛋雞和麻雞飼養(yǎng)密度大，且大都曾經(jīng)免疫過ILTV活疫苗。相反，同地域的大部分商品肉雞當(dāng)時(shí)免疫率較低。其中，2019年，魯南地區(qū)喉痘疫苗（基因工程疫苗）的免疫率僅為30%；2020年免疫率為50%；2021年，免疫接種率攀升至90%。2021年7月后，該地區(qū)商品肉雞的ILT發(fā)病率陸續(xù)降至冰點(diǎn)。2022年1~9月份，未見ILT發(fā)病病例。由此可見，疫苗免疫在ILT疫情的防控方面發(fā)揮了決定性作用。

表1 典型的發(fā)病案例及其發(fā)病概況

2.2 病原分離

篩選25份不同地域、不同日齡的PCR檢測ILTV陽性雞群病料，按常規(guī)通過絨毛尿囊膜（CAM）途徑接種SPF雞胚。剖檢雞胚發(fā)現(xiàn)：有23份病料接種的SPF胚，其絨毛尿囊膜明顯增厚，接種部位出現(xiàn)典型的痘斑；且接種雞胚與SPF雞胚對照組相比，雞胚明顯發(fā)育較小，部分雞胚胚體出血，呈現(xiàn)出典型的ILT雞胚病變。

2.3 PCR核酸鑒定

取發(fā)生病變的CAM進(jìn)行處理，利用ILTV鑒定用引物PCR擴(kuò)增其ICP4基因，結(jié)果有23份有病變的雞胚分離物，其ILTV核酸PCR擴(kuò)增呈陽性。相反，沒有觀察到病變的2份樣品，其ILTV核酸檢測為陰性

選取10份ILTV核酸檢測為陽性的樣品進(jìn)行凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2。PCR產(chǎn)物片段大小約為570 bp，結(jié)果符合預(yù)期。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，SD.JQ2020等分離株ICP4基因與美國ILTV經(jīng)典雞胚疫苗株（CEO）、中國ILTV經(jīng)典強(qiáng)毒王崗株（WG）和澳大利亞CL9毒株的同源性均為100%，證實(shí)SD.JQ2020等分離株為ILTV。

圖2 ILTV ICP4基因PCR擴(kuò)增特異性鑒定結(jié)果

2.4 序列同源性分析

對ILTV 的結(jié)構(gòu)蛋白gB基因的測序測定表明，其片段長度為2 652 bp。核苷酸同源性比較顯示，SD.JQ2020等分離株之間gB基因同源性為99.7%~100%；與我國廣泛使用的疫苗株K317株同源性為99.6%~100%，呈現(xiàn)出較高的同源性；與美國ILTV經(jīng)典疫苗株CEO和TCO等同源性為99.6%~100%，也具有較高的同源性；與意大利、韓國等ILTV分離株同源性為99.6%~100%；與我國ILTV經(jīng)典強(qiáng)毒王崗株（WG）及澳大利亞A20和VI-99等同源性為99.5%~99.8%；但與α皰疹病毒亞科馬立克病毒屬M(fèi)DV（JF742597）的同源性僅為33.9%。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹

系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）表明，SD.JQ2020等分離毒株與ILTV CEO疫苗株、我國活疫苗K317株等處于同一分支，顯示出較近的親緣關(guān)系；而與我國ILTV經(jīng)典強(qiáng)毒王崗株（WG）、4株澳大利亞ILTV分離株遺傳距離較遠(yuǎn)，處在兩個(gè)遺傳演化關(guān)系相對較遠(yuǎn)的分支。這表明，目前商品肉雞ILTV流行株與我國目前常用的ILTV疫苗株遺傳關(guān)系相對較近。

圖3 ILTV毒株gB基因系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

3.1 成功從可疑ILT病料中分離出23株ILTV病毒株，確證了本次發(fā)生在商品肉雞、地方品種雞和蛋雞上的疫情為ILT。對ILTV 的結(jié)構(gòu)蛋白gB基因的核苷酸同源性比較顯示，SD.JQ2020等分離株與我國目前在蛋雞、種雞和麻雞等廣泛使用的疫苗株K317株高度同源。這表明，此次疫情與臨床大量使用ILTV疫苗免疫高度相關(guān)[8-9]。無獨(dú)有偶，2008年美國商品肉雞發(fā)生的ILT，也與CEO疫苗免疫高度相關(guān)[10-11]。

3.2 針對魯南地區(qū)的ILT疫情溯源發(fā)現(xiàn)，此次ILT疫情的發(fā)生與魯南和蘇北地區(qū)家禽飼養(yǎng)模式密不可分。該地區(qū)蛋雞、麻雞飼養(yǎng)數(shù)量較大，且大都經(jīng)過了ILTV活疫苗免疫。此外，魯南地區(qū)在2018年以后，商品肉雞經(jīng)歷了高速的發(fā)展期，從事養(yǎng)殖的肉雞公司增多，新建立的雞場飼養(yǎng)規(guī)模較大，配套的一條龍企業(yè)如屠宰加工企業(yè)也較多，進(jìn)而導(dǎo)致整個(gè)魯南地域家禽飼養(yǎng)密度較大，蛋雞與肉雞交互飼養(yǎng)，再加上蛋雞糞便、垃圾等清理不及時(shí)，導(dǎo)致疫苗毒擴(kuò)散。此外，值得反思的還有，非洲豬瘟帶來的意外“肉雞火爆”行情，讓大多數(shù)養(yǎng)殖者被利潤沖昏了頭腦，盲目擴(kuò)張，忽視了雞場的生物安全建設(shè)和管理。

3.3 疫苗是控制ILT發(fā)生最重要的技術(shù)手段。ILTV弱毒活疫苗包括雞胚來源疫苗（CEO）和組織來源疫苗（TCO），均屬于中等毒力，存在一定的安全隱患[12]。在4~12周齡（育成雞）免疫接種效果最佳。但一般不能對4周齡以下的雛雞接種，以免造成傷害。在實(shí)際生產(chǎn)中，個(gè)別養(yǎng)殖者忽視上述常識，對18日齡商品肉雞進(jìn)行免疫接種，結(jié)果導(dǎo)致雞群發(fā)病。比較而言，基因工程疫苗似乎更適合于商品肉雞的免疫[13]。

常用的基因工程疫苗通常包括載體疫苗和重組疫苗。王云峰等（2001）利用雞痘病毒（FPV）為載體，成功表達(dá)ILTV中國王崗株gB基因，通過動物試驗(yàn)表明該載體病毒無論對商品雞還是SPF雞的免疫保護(hù)均具有較高的保護(hù)性[14]。此外，國外有兩個(gè)成熟的商業(yè)重組ILTV疫苗，在臨床應(yīng)用較廣[15]：一是由CEVA公司生產(chǎn)（Biomune公司），其以FPV作為載體插入ILTV的gB和UL32基因，特點(diǎn)是見效快，適合于商品肉雞；二是由Intervet公司生產(chǎn)，將ILTV的gI和gD基因克隆到火雞皰疹病毒（HVT）基因[16]，特點(diǎn)是維持期長，適合于蛋種雞。上述兩種疫苗均適合于胚胎接種或1日齡雛雞接種，安全系數(shù)較高。

3.4 經(jīng)歷了2020~2021年的ILT疫情后，不同的家禽飼養(yǎng)企業(yè)加大了針對ILTV疫苗的免疫[17]。以魯南地區(qū)為例，至2021年6月份，90%以上的魯南雞場分別采用CEVA公司生產(chǎn)的喉痘疫苗進(jìn)行了ILTV的疫苗接種。同時(shí)，各公司加大了各飼養(yǎng)廠區(qū)的生物安全管理[18]。具體表現(xiàn)在：一是強(qiáng)化疫苗接種；二是將雞舍空舍時(shí)間延長10 d以上，重視空舍期間的衛(wèi)生消毒；三是合理布局新雞場，最大限度地規(guī)避與蛋雞場、麻雞場等不同雞場的生物安全距離；四是加強(qiáng)了對外來車輛的管理，禁止外來車輛進(jìn)入；五是加強(qiáng)了對雞場糞便及其污染物的處理。通過以上綜合措施的實(shí)施，2021年7月以后的ILT疫情大幅度減少。持續(xù)的跟蹤檢測顯示，2021年10月~2022年9月，魯南地區(qū)ILT的發(fā)病幾乎為零，達(dá)到了理想的控制效果。