汪若璜,徐冰清,柴芳玉,孔靜文,杜曉云,姜彥

(青島大學,山東 青島 266071 1 醫(yī)學部； 2 附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科)

鼻咽癌屬于高度惡性的頭頸部腫瘤，早期診斷困難且缺乏特異性的檢測指標[1]。放射治療是非轉(zhuǎn)移鼻咽癌的主要治療手段[2]，但放射抵抗的出現(xiàn)會引起局部復發(fā)以及遠處轉(zhuǎn)移，導致治療失敗[3-4]。因此尋找新的治療靶點以改善病人的預后具有重要的意義。microRNAs(miRNAs)可以通過互補序列與靶標mRNA分子結(jié)合從而抑制mRNA的翻譯[5]。miRNAs作為遺傳調(diào)節(jié)因子，在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要[6-10]。研究表明，miR-1185-5p在鼻咽癌中存在差異表達，但其作用尚未闡明[11]。磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白β (PITPNB) 3′-非編碼區(qū)(UTR)內(nèi)存在與miR-1185-5p堿基互補配對的序列，推測miR-1185-5p可能對PITPNB具有調(diào)控作用。本研究探討miR-1185-5p對鼻咽癌細胞增殖和遷移的調(diào)控作用，并以PITPNB為靶點探討其下游機制，旨在為鼻咽癌的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫檢索及PITPNB與miR-1185-5p結(jié)合位點的預測

檢索癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中43組配對的頭頸部鱗狀細胞癌樣本及其癌旁正常樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)，應用“ggplot2”R包分析其中miR-1185-5p和PITPNB的差異表達，應用“survminer”R包分析PITPNB表達與病人總生存率間的關(guān)系；應用TargetScan(http://www.targetscan.org/)預測miR-1185-5p與PITPNB之間的結(jié)合位點。

1.2 細胞培養(yǎng)

應用含體積分數(shù)0.10胎牛血清(以色列BI公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(大連美侖公司)，37 ℃條件下，在含體積分數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)鼻咽癌CNE-2細胞(上海通派公司)。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

應用T4 DNA Ligase(南京諾唯贊公司生產(chǎn))將人PITPNB(NM_001284277)的cDNA克隆至pPB-CAG-pgk-hph(湖南豐暉公司)轉(zhuǎn)座子載體，構(gòu)建PITPNB過表達質(zhì)粒(OE-PITPNB)，以轉(zhuǎn)座子載體作為空載對照質(zhì)粒(Control)。PITPNB的3′UTR被合成并插入pGL6熒光素酶報告載體(北京碧云天公司)，用以構(gòu)建PITPNB野生型共表達載體(PITPNB-WT)。將PITPNB的3′UTR(UAUCCUC)與miR-1185-5p的結(jié)合位點突變?yōu)锳UAGGAG，并插入pGL6熒光素酶報告載體，用以構(gòu)建PITPNB突變型共表達載體(PITPNB-MUT)。將CNE-2細胞接種至相應孔板，當細胞融合至70%～90%時轉(zhuǎn)染。miRNAs與質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染時間及用量參考PEI(美國Polysciences公司)轉(zhuǎn)染試劑說明書。

1.4 RT-PCR方法檢測miR-1185-5p和PITPNB mRNA的表達

應用RNA isolater(南京諾唯贊公司)提取細胞總RNA，應用EvoM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(湖南艾科瑞公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR Green Pro Taq HS(湖南艾科瑞公司)試劑盒進行RT-PCR擴增，根據(jù)試劑盒說明書設置反應的體系及條件。將CNE-2細胞分為4組，分別轉(zhuǎn)染mimic NC、miR-1185-5p mimic、inhibitor NC和miR-1185-5p inhibitor，48 h后應用RT-PCR方法分別檢測各組miR-1185-5p以及PITPNBmRNA的表達水平。再將CNE-2細胞分為2組，分別轉(zhuǎn)染空載對照質(zhì)粒(Control)和OE-PITPNB，24 h后應用RT-PCR方法檢測各組PITPNBmRNA表達。以U6為內(nèi)參檢測miR-1185-5p的相對表達量，以GAPDH為內(nèi)參檢測PITPNBmRNA的相對表達量。RT-PCR引物及其序列見表1。

表1 RT-PCR引物及其序列

1.5 CCK-8實驗

將CNE-2細胞以每孔4 000個的密度接種于96孔板，細胞分組及處理同1.4，按照試劑盒說明書要求加入CCK-8試劑(上海翌圣公司)，37 ℃孵育30 min后應用酶標儀檢測450 nm波長下的吸光度值。每組均設置4個復孔。

1.6 劃痕實驗

將CNE-2細胞接種至6孔板，當細胞融合至70%時，按1.4方法進行分組及轉(zhuǎn)染，48 h后使用200 μL無菌槍頭劃痕，PBS潤洗細胞后加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液再置于培養(yǎng)箱中，從0 h開始每隔12 h在倒置顯微鏡下采集圖像，應用Image J軟件分析圖像。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測

將CNE-2細胞接種于12孔板中的4個孔，分別轉(zhuǎn)染mimic NC+PITPNB-WT+海腎熒光報告載體(北京碧云天公司生產(chǎn))、miR-1185-5p mimic+PITPNB-WT+海腎熒光報告載體、mimic NC+PITPNB-MUT+海腎熒光報告載體、miR-1185-5p mimic+PITPNB-MUT+海腎熒光報告載體。轉(zhuǎn)染48 h后裂解細胞收集上清，應用Dual-Luciferase(Promega)雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 miR-1185-5p對鼻咽癌細胞增殖和遷移的影響

對TCGA數(shù)據(jù)庫中的43對頭頸鱗癌和癌旁正常組織樣本分析顯示，頭頸鱗癌組織中miR-1185-5p的表達顯著低于癌旁正常組織(t=-2.17,P<0.05)。見圖1A。RT-PCR檢測顯示，與mimic NC組細胞相比，轉(zhuǎn)染miR-1185-5p mimic可顯著上調(diào)miR-1185-5p的表達(t=96.18，P<0.001)；與inhibitor NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-1185-5p inhibitor抑制了miR-1185-5p的表達(t=4.98，P<0.05)。見圖1B。CCK-8實驗結(jié)果顯示，mimic NC組和miR-1185-5p mimic組相比較，CNE-2細胞增殖能力存在時間和組別的交互作用(F=6.079，P<0.05)，隨著培養(yǎng)時間的延長(F=246.800，P<0.001)，miR-1185-5p mimic組CNE-2細胞的增殖能力較mimic NC組降低(F=8.086，P<0.05)。同樣，inhibitor NC組和miR-1185-5p inhibitor組亦存在時間和組別交互作用(F=12.360，P<0.01)，隨著培養(yǎng)時間延長(F=121.600，P<0.001)，miR-1185-5p inhibitor組細胞增殖能力較inhibitor NC組細胞增高(F=11.160，P<0.01)。見圖1C。劃痕實驗結(jié)果顯示， miR-1185-5p mimic組CNE-2細胞的遷移能力較mimic NC組降低(t=12.83，P<0.05)，而miR-1185-5p inhibitor組CNE-2細胞的遷移能力較inhibitor NC組升高(t=12.78,P<0.05)。見圖1D、E。

A：TCGA數(shù)據(jù)庫中miR-1185-5p的相對表達；B：轉(zhuǎn)染mimic NC、miR-1185-5p mimic、inhibitor NC和miR-1185-5p inhibitor后miR-1185-5p的相對表達；C：miR-1185-5p對CNE-2細胞增殖的影響；D、E：miR-1185-5p對CNE-2細胞遷移的影響。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。圖1 miR-1185-5p對鼻咽癌CNE-2細胞增殖和遷移的調(diào)控作用

2.2 miR-1185-5p靶基因的預測

TargetScan數(shù)據(jù)庫分析顯示，miR-1185-5p與PITPNB的3′UTR之間存在結(jié)合位點(圖2A)。應用TCGA數(shù)據(jù)庫分析表明，PITPNB在頭頸鱗癌組織中高表達(Z=70，P<0.001)。見圖2B。生存分析顯示，PITPNB高表達的頭頸部鱗狀細胞癌病人的總生存率較低(χ2=6.05，P<0.05)。見圖2C。

A：PITPNB的3′UTR內(nèi)miR-1185-5p結(jié)合位點示意圖；B：TCGA數(shù)據(jù)庫中PITPNB mRNA的相對表達；C：不同PITPNB表達水平的頭頸部鱗狀細胞癌病人的生存分析。***P<0.001。

2.3 PITPNB對鼻咽癌細胞增殖和遷移的影響

與Control組相比，轉(zhuǎn)染OE-PITPNB后鼻咽癌CNE-2細胞PITPNB的表達升高(t=6.55，P<0.01)。見圖3A。CCK-8實驗顯示，CNE-2細胞的增殖能力存在時間和組別的交互作用(F=12.000，P<0.01)，當培養(yǎng)時間至24 h時(F=126.300，P<0.001)，OE-PITPNB組CNE-2細胞的增殖能力較Control組顯著提高(F=18.010，P<0.01)。見圖3B。劃痕實驗顯示，當培養(yǎng)時間至48 h時，Control組細胞遷移率為(51.86±0.82)%，OE-PITPNB組細胞遷移率為(70.41±0.56)%，OE-PITPNB組CNE-2細胞的遷移能力較Control組增強(t=13.39,P<0.05)。見圖3C。

A：兩組CNE-2細胞中PITPNB mRNA的相對表達；B：PITPNB對CNE-2細胞增殖的影響；C：PITPNB對CNE-2細胞遷移的影響。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。圖3 PITPNB對鼻咽癌CNE-2細胞增殖和遷移的調(diào)控作用

2.4 miR-1185-5p靶向PITPNB對其表達影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與mimic NC組相比，miR-1185-5p mimic組PITPNBmRNA的表達顯著降低(t=53.40，P<0.001)，而miR-1185-5p inhibitor組PITPNBmRNA的表達較inhibitor NC組升高(t=5.49，P<0.05)。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，與mimic NC組相比，miR-1185-5p mimic組PITPNB-WT熒光素酶的活性降低(t=8.05，P<0.01)，而PITPNB-MUT熒光素酶活性差異無顯著性(t=1.65，P>0.05)。見圖4。

3 討 論

鼻咽癌是一種與EB病毒感染有關(guān)的惡性腫瘤，占頭頸部鱗癌的70%以上[12-13]。由于鼻咽癌早期缺乏明顯的臨床體征，超過70%的病人初診即已經(jīng)屬于晚期。同步放化療是晚期鼻咽癌的標準治療方法[14]。雖然放療和綜合化療策略的進步使原發(fā)性鼻咽癌病人的預后有了很大的改善，但鼻咽癌的復發(fā)率仍高達82%[15-17]，復發(fā)后的再治療是臨床上存在的難題。EB病毒抗體血清學檢測是目前臨床上廣泛應用的鼻咽癌篩查方法，但由于存在較高的假陽性率，陽性人群需反復隨訪，造成檢查成本增高，給病人帶來嚴重的心理負擔。因此，尋找新的生物標志物和治療靶點至關(guān)重要。

miRNAs是一種小型非編碼RNA，通過識別同源序列和干擾轉(zhuǎn)錄、翻譯或表觀遺傳過程來調(diào)節(jié)基因表達[5]。miRNAs可參與多種細胞的生物學過程并發(fā)揮作用，包括細胞周期調(diào)節(jié)、應激反應、炎癥、分化、增殖、侵襲和凋亡等[18-22]。研究表明，miRNAs功能失調(diào)可導致包括鼻咽癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生[23-24]。因此，識別miRNAs、靶標及其調(diào)控網(wǎng)絡對于闡明miRNAs的正常生物學過程及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用至關(guān)重要[25]。相關(guān)研究表明，miR-1185在不同腫瘤中均低表達，其中miR-1185在結(jié)直腸癌細胞中表達下調(diào)，并在mTOR通路中發(fā)揮作用[26]；在人類乳癌中miR-1185也呈低表達，且與病人預后負相關(guān)[27]。本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中43對頭頸部鱗狀細胞癌和癌旁正常組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比較，頭頸部鱗狀細胞癌組織miR-1185-5p低表達，提示miR-1185-5p可能作為腫瘤抑制因子在頭頸部鱗狀細胞癌中發(fā)揮作用。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-1185-5p mimic和miR-1185-5p inhibitor分別升高和抑制miR-1185-5p在鼻咽癌CNE-2細胞中的表達，通過CCK-8實驗和劃痕實驗探討miR-1185-5p在CNE-2細胞中的作用機制。結(jié)果顯示，上調(diào)miR-1185-5p表達抑制了CNE-2細胞的增殖和遷移，而抑制miR-1185-5p表達對CNE-2細胞的增殖和遷移具有促進作用。提示miR-1185-5p作為抑癌因子參與鼻咽癌的生物學過程。

PITPNB可以催化磷脂酰肌醇和磷脂酰膽堿在細胞膜間的轉(zhuǎn)移，這種轉(zhuǎn)運活性是包被蛋白復合體Ⅰ介導的從高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的逆行轉(zhuǎn)運所必需的。目前，PITPNB在腫瘤中作用的研究還未廣泛開展。本文生物信息學分析顯示，PITPNB在頭頸部鱗狀細胞癌中高表達，且高表達PITPNB的病人預后較差；進一步探究PITPNB對CNE-2細胞生物學功能的影響，結(jié)果顯示PITPNB可以促進CNE-2細胞的增殖和遷移；而TargetScan分析顯示，miR-1185-5p與PITPNB 3′UTR之間存在結(jié)合位點，推測miR-1185-5p與PITPNB之間可能存在靶向調(diào)控關(guān)系。本文應用雙熒光素酶報告基因檢測技術(shù)，首次在鼻咽癌CNE-2細胞中驗證了miR-1185-5p與PITPNB之間的靶向結(jié)合關(guān)系。因此，PITPNB可能作為miR-1185-5p的下游靶點之一在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

綜上，在鼻咽癌CNE-2細胞中，miR-1185-5p可通過靶向調(diào)控PITPNB的表達進而調(diào)節(jié)CNE-2細胞的增殖和遷移，從而抑制鼻咽癌的進展。這為鼻咽癌的治療提供了新的靶標分子，為miR-1185-5p及PITPNB在鼻咽癌中作用的后續(xù)研究提供了生物學基礎(chǔ)。然而，本研究僅局限于細胞實驗，需動物實驗進一步驗證，并探索可能的上下游機制，為后續(xù)臨床轉(zhuǎn)化提供理論基礎(chǔ)。