曹海丹，邱璐，趙麗佳，徐文，王敏，李汶倩，李帥

長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長春 130012

神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）和血凝素（hema?gglutinin，HA）均為流感病毒表面的關(guān)鍵抗原，其中，HA 是目前流感疫苗開發(fā)所用的主要抗原。但在流感研究領(lǐng)域，早有學(xué)者呼吁以NA為流感疫苗抗原進行針對性開發(fā)［1?5］。2018年，CHEN 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，針對NA 產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答，相比針對HA 產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，能更有效地保護人體不受流感侵害［7?8］。但現(xiàn)有流感疫苗接種人體后誘發(fā)NA的免疫應(yīng)答（即抗體數(shù)量）效率遠低于自然感染人群，因此，研究者呼吁針對NA 優(yōu)化抗原表位，設(shè)計開發(fā)NA 免疫應(yīng)答效率更高的流感疫苗［2，9?10］。

針對NA 的流感應(yīng)對策略在我國同樣適用。根據(jù)中國國家流感中心發(fā)布的2020年第29 周第605期中國流感監(jiān)測周報，自2019年10月以來，耐藥性監(jiān)測顯示，所有甲型H1N1 和A（H3N2）亞型流感毒株均對烷胺類藥物耐藥；所有A（H3N2）和B 型流感毒株均對NA 抑制劑敏感［11］。除1株甲型H1N1毒株對NA 抑制劑的敏感性高度降低，其余甲型H1N1 毒株均對NA 抑制劑敏感。而且，相比HA 的高度變異特性，NA 的變異程度要明顯降低［12?13］。據(jù)此推測，NA 所引起的特異性免疫應(yīng)答，很可能幫助人體抵御絕大多數(shù)流感病毒毒株的侵害，從而起到廣譜抗流感作用。因此，流感疫苗中NA 的有效抗原含量（活性）對疫苗抗流感效果有較大影響［14］。

近年來，我國流感疫苗生產(chǎn)工藝和質(zhì)量均有大幅優(yōu)化，疫苗保質(zhì)期也長達18 個月。但在基層衛(wèi)生工作實踐中，遇各種自然或人為突發(fā)情況，疫苗保存條件可能無法保證，因此，疫苗的溫度穩(wěn)定性是關(guān)鍵指標(biāo)。已有研究者檢測了疫苗中HA 抗原在不同溫度條件下的穩(wěn)定性［15?17］，但我國學(xué)者對國產(chǎn)疫苗NA的溫度穩(wěn)定性研究較少。

本研究結(jié)合衛(wèi)生實踐中可能遇到的溫度變化條件，開展了3 種型別流感疫苗NA 含量的溫度穩(wěn)定性測試，監(jiān)測了疫苗單價原液樣品在常規(guī)冷藏條件，室溫（25 ℃）、變溫（37 ℃）等條件下保存不同時間后的殘余NA 含量，以期為系統(tǒng)了解流感疫苗中NA 的穩(wěn)定性提供參考。

1 材料與方法

1.1 疫苗原液 H1N1、H3N2和B型流感疫苗單價原液為長春生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗六室制備。

1.2 主要試劑及儀器 胎球蛋白和HRP?PNA購自美國Sigma 公司；TMB 液購自北京索萊寶科技有限公司；酶標(biāo)板購自美國Thermo Fisher 公司；酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司。

1.3 樣本處理 將H1N1、H3N2和B型流感疫苗單價原液分別置4、25（室溫）、37（變溫）℃放置0.5、2、7、24、48 h，以4 ℃儲存單價原液為對照，100 ℃放置1 h作為NA 失活的陽性對照。處理后的樣品放回4 ℃，所有樣品統(tǒng)一檢測。

1.4 NA 活性測定 采用酶連凝集素法，參考本單位先前方法，略有改動［18］。將胎球蛋白用0.05 mol／L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋至25 μg／mL，加入酶標(biāo)板中，100 μL／孔，用密封膜包裹，4 ℃過夜；次日棄上清，用洗液（100 mL 0.15 mol／L pH 7.2 的磷酸鹽緩沖液加入 50 μL 吐溫 20）洗滌3 次，加入倍比稀釋的疫苗單價原液樣品，100 μL／孔，每個樣品設(shè)雙孔，最后一排前兩孔加入0.01 mol／L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）100 μL作為陰性對照，37 ℃孵育16～18 h；用洗液洗滌3次，加入HRP?PNA（用酶稀釋液稀釋至1∶500），100 μL／孔，37 ℃孵育2 h；用洗液洗滌5次，加入TMB 底物液100 μL，室溫作用15 min；加入終止液 1 mol／L 鹽酸溶液 100 μL，10 min 內(nèi)于酶標(biāo)儀波長450 nm 處測定吸光度值（A）。以待測樣品A450值 ≥陰性對照A450值的2.1 倍作為Cutoff 值，確定單價原液的酶活性。陰性對照A450值≤0.1，樣品A450均值 × 90% ≤A450值 ≤A450均值 × 110%判為試驗結(jié)果有效。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件Graphpad Prism v 8.0 對3種疫苗在不同溫度下儲存的NA活性數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較使用雙尾t?test檢驗，以變化倍數(shù)超過1.2 或小于0.8 為有差異，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NA 熱變性的系統(tǒng)驗證 經(jīng)100 ℃極端高溫處理疫苗原液后，H1N1、H3N2、B 型流感疫苗中 NA 活性均明顯降低，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為23.482、35.750 和 43.299，P分別為 1.95 E?05、3.65 E?06和1.70 E?06），見圖1。表明本研究所用檢測系統(tǒng)可檢測到溫度導(dǎo)致的NA活性變化。

圖1 3 種型別流感疫苗單價原液經(jīng)100 ℃處理后的NA活性Fig.1 NA activities of monovalent bulks of three types of influenza vaccines after storage at 100 ℃

2.2 3 種疫苗在常見升溫條件下的NA 活性變化H1N1 型疫苗中的NA 活性在4 ℃條件下無顯著變化，而在25 和37 ℃下，NA 活性均隨處理時間的延長而顯著下降；相比之下，在48 h處理范圍內(nèi)，H3N2和B 型疫苗中的NA 活性均無明顯下降。見圖2、表1~表3。表明在本研究條件下，H3N2 和B 型疫苗中的NA比H1N1型疫苗更為穩(wěn)定。

表1 H1N1型疫苗不同處理條件下的NA活性變化Tab.1 Change of NA activity of H1N1 vaccine at different temperatures for various hours

表3 B型疫苗不同處理條件下的NA活性變化Tab.3 Change of NA activity of B vaccine at different temperatures for various hours

圖2 3種疫苗中NA活性在不同溫度下隨處理時間的變化Fig.2 Changes of NA activities of three influenza vaccines at different temperatures with time for storage

表2 H3N2型疫苗不同處理條件下的NA活性變化Tab.2 Change of NA activity of H3N2 vaccine at different temperatures for various hours

3 討論

流感病毒A 和B 型是引發(fā)季節(jié)性流感的主要病毒亞型，其中以甲1型（H1N1）、甲3型（H3N2）和B型為主。流感疫苗注射入人體內(nèi)，引發(fā)免疫系統(tǒng)針對HA 或 NA 抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生中和型抗體［19?21］。因此，疫苗中的HA、NA 含量或活性對疫苗的免疫效果有直接影響。

目前我國流感疫苗出廠檢測質(zhì)檢過程中，主要針對HA 含量和穩(wěn)定性進行檢測，而對NA 含量及穩(wěn)定性尚未形成行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［22］；生產(chǎn)疫苗過程中，也少有機構(gòu)或企業(yè)針對 NA 進行特異性設(shè)計［23?24］。對于流感疫苗中NA在不同溫度下的穩(wěn)定性研究，經(jīng)文獻檢索僅發(fā)現(xiàn)1 篇［25］；而針對國產(chǎn)疫苗，尚無類似的系統(tǒng)研究。因此，本研究對流感疫苗單價原液中NA活性的溫度穩(wěn)定性進行了初步的系統(tǒng)探索，結(jié)果顯示，甲3（A，H3N2）和乙型（B）流感疫苗中的NA 抗原含量具有很好的溫度穩(wěn)定性，37 ℃熱處理48 h 后仍無明顯降低；相比之下，甲1 型（A，H1N1）流感疫苗中的NA 含量在25 和37 ℃處理條件下均表現(xiàn)出隨溫度下降的趨勢。本研究為系統(tǒng)了解流感疫苗中NA 的穩(wěn)定性提供了參考，有助于日后開發(fā)和制定相關(guān)工藝標(biāo)準(zhǔn)，亦可幫助基層衛(wèi)生人員合理評估疫苗保質(zhì)期，節(jié)約衛(wèi)生成本?；谝延薪Y(jié)果，在流感高發(fā)季節(jié)組合配比多價疫苗時，可嘗試根據(jù)當(dāng)季流行毒株型別，適當(dāng)調(diào)整對應(yīng)單價疫苗病毒的比例，從而保證即便遇到異常儲存情況也能保證足夠的活性免疫原含量。后續(xù)將利用小鼠等動物模型，研究不同貨架保存期或不同溫度處理條件下疫苗所誘導(dǎo)的流感病毒NA抗體滴度，以進一步升級改善流感疫苗功效。