張秀麗，張志剛 綜述，趙勤儉 審校

廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361102

疫苗接種是預(yù)防、控制和根除傳染病的最有利措施。自20世紀(jì)30年代起，硫柳汞一直被用作疫苗的防腐劑，通過(guò)預(yù)防有害微生物污染所致的潛在危害，從而有助于疫苗的安全生產(chǎn)和使用［1?2］。硫柳汞對(duì)于某些疫苗可能有滅活劑或類似佐劑的效果［3?6］，也可通過(guò)減少疫苗生產(chǎn)過(guò)程中過(guò)氧化物的產(chǎn)生，從而提高制劑的穩(wěn)定性［7?8］。作為疫苗的防腐劑，硫柳汞應(yīng)與疫苗抗原相容，但研究表明，硫柳汞可能與抗原發(fā)生反應(yīng)。在某些情況下，這可能限制疫苗的開(kāi)發(fā)和抗原的體外免疫學(xué)評(píng)價(jià)［9?10］。1956年，DAVISSON等［11］報(bào)道，硫柳汞降低了脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗（inac?tivated poliovirus vaccine，IPV）的免疫原性，提示開(kāi)發(fā)百白破疫苗（diphtheria?tetanus?pertussis，DTP）和IPV聯(lián)合疫苗存在硫柳汞兼容性問(wèn)題［9］。近年來(lái)，隨著分析技術(shù)和手段的不斷進(jìn)步，有關(guān)硫柳汞對(duì)其他疫苗抗原性和免疫原性的影響陸續(xù)被報(bào)道。

1 硫柳汞

硫柳汞（C9H9HgNaO2S）化學(xué)名為硫代水楊酸乙基汞鈉，是一種含49.55%汞（以重量計(jì)）的有機(jī)化合物。硫柳汞不存在于自然界中，是一種人造汞化合物，由禮來(lái)公司于1927年研發(fā)作為一種高水溶性的防腐劑［12］。20 世紀(jì) 90年代，人們擔(dān)憂硫柳汞的神經(jīng)毒性及其與兒童自閉癥的相關(guān)性，但尚無(wú)有效的科學(xué)數(shù)據(jù)表明其中的因果關(guān)系［13］。目前，大多數(shù)國(guó)家已將硫柳汞從單劑量疫苗中移除，但其仍廣泛存在于多劑量疫苗中。120 多個(gè)國(guó)家每年使用含硫柳汞的疫苗，為約8 400萬(wàn)兒童接種，可挽救至少1 400萬(wàn)人的生命［14?15］。相比于單劑量疫苗，多劑量疫苗的每劑量制造成本較低，產(chǎn)生的醫(yī)療廢物總量更少，更適合冷鏈短缺或儲(chǔ)存能力有限的條件下使用［16］。當(dāng)發(fā)生疾病大流行時(shí)，多劑量疫苗有助于更快擴(kuò)大免疫范圍、控制疾病。出于安全性考慮，多劑量疫苗一般含有硫柳汞作為防腐劑，雖然2?苯氧乙醇（2?phenoxy?ethanol，2?PE）和苯酚已被用作一些疫苗的防腐劑，但其殺菌效果不如硫柳汞，目前尚無(wú)更好的化合物可在疫苗中完全取代硫柳汞［17］。在含硫柳汞的疫苗中，硫柳汞的通常用量為0.001% ~ 0.01%（w／v），其中汞的含量為每劑 12.5 ~ 25 μg［18］。有機(jī)汞主要包括甲基汞和乙基汞，甲基汞是一種環(huán)境來(lái)源的神經(jīng)毒素；與甲基汞不同，硫柳汞的代謝產(chǎn)物之一是乙基汞。當(dāng)硫柳汞作為疫苗制劑的一部分注射到人體時(shí)，其代謝產(chǎn)物之一的乙基汞能夠逃脫人體的天然防御機(jī)制，迅速代謝轉(zhuǎn)換成無(wú)機(jī)汞，不會(huì)長(zhǎng)期滯留［19］。世界衛(wèi)生組織建議在全球免疫規(guī)劃中使用含硫柳汞的疫苗，相關(guān)安全性研究也表明，使用此類產(chǎn)品的好處遠(yuǎn)超過(guò)任何理論上的毒性風(fēng)險(xiǎn)［13，20?21］。硫柳汞導(dǎo)致的免疫后不良事件主要是由于分子中的硫代水楊酸部分引起的硫柳汞過(guò)敏，但通常是輕微的反應(yīng)，如注射部位紅腫［22］。在硫柳汞對(duì)抗原活性影響方面，相比于多克隆抗體血清，基于單克隆抗體的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)更易發(fā)現(xiàn)硫柳汞對(duì)抗原性和免疫原性的損害作用，更有助于其作用機(jī)制的研究。

2 硫柳汞對(duì)滅活疫苗抗原活性的影響

硫柳汞作為滅活疫苗和重組蛋白疫苗的防腐劑。在人體中，硫柳汞代謝產(chǎn)物乙基汞易與細(xì)胞成分中的硫基結(jié)合，但當(dāng)半胱氨酸（cysteine，Cys）上的巰基（?SH）為蛋白質(zhì)分子的活性位點(diǎn)或重要功能位點(diǎn)時(shí)，這種相互結(jié)合作用很可能使酶、細(xì)胞器、離子通道、膜等失去正常功能［23］。疫苗制劑中也存在硫柳汞與抗原中Cys的巰基相互作用的現(xiàn)象，這可能影響抗原結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性，降低疫苗抗原性和免疫原性，使疫苗效力下降。

2.1 硫柳汞對(duì)IPV 的影響 IPV 是一種包含脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ型（Mahoney 株）、Ⅱ型（MEF?1 株）、Ⅲ型（Saukett株）抗原的三價(jià)疫苗［24］。在含0.01%（w／v）硫柳汞、4 ℃儲(chǔ)存條件下，3 種脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原的穩(wěn)定性均明顯降低，其中Ⅰ型IPV 抗原性和免疫原性均出現(xiàn)明顯降低現(xiàn)象［25］。硫柳汞可加深高溫對(duì)IPV 免疫原性和抗原性的破壞作用。在37 ℃儲(chǔ)存條件下，與對(duì)照組相比，含硫柳汞的IPV 組小鼠產(chǎn)生的中和抗體滴度明顯較低［11］，3 種 IPV 的抗原性喪失速率均增大，這種損害作用在Ⅰ型IPV 抗原上最為明顯［25］。IPV 與硫柳汞在 37 ℃混合 5 min 后，Ⅱ型 IPV抗原的一株單克隆抗體7Ab 結(jié)合活性降低約16 倍，但針對(duì)Ⅱ型IPV 抗原上另一株單克隆抗體9Ab 或小鼠多抗血清的結(jié)合活性未見(jiàn)明顯變化［25］。表明硫柳汞可能對(duì)IPV抗原的部分構(gòu)象產(chǎn)生影響，且這種影響可能具有表位特異性。但在0.005%~0.01%濃度范圍內(nèi)，硫柳汞對(duì)IPV抗原性的損害作用具有劑量依賴性，而對(duì)IPV的免疫原性影響無(wú)明顯差異。L?半胱氨酸與含硫柳汞的IPV混合后，可減少硫柳汞對(duì)IPV抗原性的負(fù)面影響［26?27］，表明L?半胱氨酸可作為硫柳汞的消除劑用于疫苗生產(chǎn)或制劑中。在DTP?IPV 組合疫苗中，通過(guò)將這兩種疫苗隔離在同一注射器單獨(dú)腔室中的方法，解決了IPV 抗原和硫柳汞的兼容性問(wèn)題［28］。另一種方法是在DTP?IPV 組合疫苗中使用不影響IPV效力的2?PE或芐索氯銨作為防腐劑［9，29］。

2.2 硫柳汞對(duì)流感病毒疫苗的影響 硫柳汞是多劑量流感疫苗中必要的防腐劑，可防止多劑量疫苗瓶在打開(kāi)過(guò)程中可能發(fā)生的潛在微生物污染［30］。但硫柳汞水解產(chǎn)物乙基汞能夠與流感病毒疫苗的活性成分—血凝素結(jié)合［31］。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，乙基汞和血凝素形成的結(jié)合物可能在小鼠體內(nèi)誘發(fā)汞相關(guān)免疫反應(yīng)，降低流感病毒疫苗的免疫效力［32］。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，硫柳汞可抑制流感病毒疫苗的CD4+T 細(xì)胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致初始記憶T細(xì)胞凋亡和體外誘導(dǎo)T細(xì)胞活化失敗，出現(xiàn)ELIspot 實(shí)驗(yàn)假陽(yáng)性結(jié)果，高估疫苗效力［33?34］。

3 硫柳汞對(duì)重組蛋白疫苗抗原活性的影響

3.1 硫柳汞對(duì)人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）疫苗的影響 不同HPV 型別的L1 分子中含有幾個(gè)在其衣殼結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用的Cys 殘基［35］。CHEN 等［36］研究發(fā)現(xiàn)，0.05% 硫柳汞處理導(dǎo)致五聯(lián)苗［HPV6／11／16／18 病毒樣顆粒（virus?like particles，VLPs）+ 戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）樣顆粒p239］中 4 種HPV VLPs 抗原相應(yīng)的特異性單克隆抗體失去結(jié)合活性，抗原性均降低。將硫柳汞處理后的五聯(lián)苗免疫小鼠，在免疫2針2周后采集血清進(jìn)行抗體結(jié)合與中和滴度檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPV18 VLPs的免疫原性下降最為明顯，該組結(jié)合滴度比對(duì)照組降低了約25 倍，血清中和假病毒的能力明顯減弱，中和滴度低于檢測(cè)閾值，其次是HPV16 VLPs。相比之下，硫柳汞對(duì)HPV6／11 VLPs 和HEV p239 的免疫原性未見(jiàn)明顯影響。HPV6／11／16／18 VLPs所含的Cys分別為11、11、12、14個(gè)，而HEV p293不含Cys，HPV18 VLPs 為五聯(lián)苗中對(duì)硫柳汞處理最敏感的型別，HPV16 VLPs 次之，由此可見(jiàn)，硫柳汞對(duì)蛋白抗原性的負(fù)面影響可能與疫苗蛋白抗原中Cys的數(shù)量存在一定的相關(guān)性。HPV16／18雙價(jià)苗的Ⅰ期臨床研究表明，將HPV16 VLPs 與硫柳汞孵育后，V5 單克隆抗體識(shí)別的結(jié)構(gòu)表位被破壞［37］。通過(guò)冷凍掃描電鏡和差示掃描熒光法也觀察到硫柳汞處理后的HPV18 VLPs結(jié)構(gòu)變化，尺寸擴(kuò)展約2%，重組病毒衣殼顯著失穩(wěn)，且這種負(fù)面影響呈硫柳汞濃度依賴性。兩種具有高中和活性HPV18特異性單克隆抗體（13H12和3C3）與硫柳汞處理后的HPV18 VLPs結(jié)合活性明顯下降。兩株抗體監(jiān)測(cè)HPV18抗原性損失的動(dòng)力學(xué)雖均遵循雙相指數(shù)衰減模型，但兩模型間有顯著性差異。表明免疫反應(yīng)性損失可能具有表位特異性［38］。

3.2 硫柳汞對(duì)乙型肝炎疫苗的影響 接種重組乙型肝炎疫苗是預(yù)防和控制慢性乙型肝炎病毒感染的最有效策略［39］。目前，硫柳汞仍被用作乙型肝炎疫苗的防腐劑。但研究表明，在酵母生產(chǎn)的表面抗原制成的乙型肝炎疫苗中，與含硫柳汞的乙型肝炎疫苗組相比，不含防腐劑組的免疫原性較高，抗體幾何平均滴度增加約63%，體內(nèi)相對(duì)效力提高11%以上，ED50下降約41%［40］。血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率和血清保護(hù)率數(shù)據(jù)也表明，不含硫柳汞的疫苗配方具有更高的免疫原性［40］。姚偉等［41］的體外研究表明，移除硫柳汞后，在4 ℃貯存 12 個(gè)月、22 ℃貯存6 個(gè)月和37 ℃貯存4 周后，乙型肝炎疫苗（CHO 細(xì)胞）的效力和穩(wěn)定性仍符合《中國(guó)藥典》（2005版）的要求?；诹蛄瘜?duì)乙型肝炎疫苗免疫原性、體外效力和穩(wěn)定性的影響，可考慮移除或替換硫柳汞，同時(shí)，硫柳汞對(duì)乙型肝炎疫苗抗原性的影響，仍需進(jìn)一步研究。

3.3 硫柳汞對(duì)輪狀病毒疫苗的影響 輪狀病毒感染是幼兒嚴(yán)重腹瀉和脫水的最常見(jiàn)原因，但可通過(guò)疫苗免疫接種來(lái)預(yù)防［43］。截至2019年11月，全球輪狀病毒疫苗的接種覆蓋率約為35%，相應(yīng)疾病負(fù)擔(dān)減少了50%以上［44］。在將含有3 種重組蛋白抗原（血清型P［4］、P［6］和P［8］）的三價(jià)重組亞單位輪狀病毒疫苗引入到兒童五聯(lián)苗（DTP、乙型流感嗜血桿菌疫苗和HBV 疫苗）的研究中發(fā)現(xiàn)，硫柳汞對(duì)3種抗原穩(wěn)定性均有明顯的破壞作用，且這種作用呈溫度依賴性，37 ℃ >25 ℃ >4 ℃。硫柳汞導(dǎo)致的P［4］和P［8］抗原結(jié)構(gòu)失穩(wěn)與兩者的抗原性降低高度相關(guān)，但在P［6］抗原上出現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)變化后，其抗原性卻未受到明顯影響［45?47］。盡管觀察到硫柳汞導(dǎo)致的抗原性改變，但這對(duì)體內(nèi)免疫原性的影響仍有待于在動(dòng)物模型中確定。

4 硫柳汞對(duì)疫苗效力影響的可能作用機(jī)制

在水溶液和生物體環(huán)境中，硫柳汞可迅速水解為乙基汞和硫代水楊酸鹽，前者易通過(guò)S?Hg 配位鍵與蛋白質(zhì)游離或表面暴露的Cys 殘基反應(yīng)形成蛋白質(zhì)?乙基汞加合物［48?50］。這種相互作用是硫柳汞抑菌作用的潛在機(jī)制［51］，同時(shí)也可能是其影響含Cys 抗原的構(gòu)象完整性和穩(wěn)定性，降低抗原性和免疫原性的原因之一，尤其是當(dāng)Cys參與構(gòu)成或臨近關(guān)鍵抗原表位時(shí)［36，38，47］。基于單克隆抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)有助于發(fā)現(xiàn)基于多克隆抗血清難以發(fā)現(xiàn)的表位特異性修飾和抗原活性損失。研究表明，硫柳汞本身也可直接通過(guò)與抗原的Cys 反應(yīng)影響疫苗效力［52］。硫柳汞對(duì)疫苗效力影響的可能作用機(jī)制見(jiàn)圖1。但硫柳汞或其水解產(chǎn)物乙基汞與疫苗抗原Cys 的巰基相互作用可能是可逆或至少部分可逆［27，47，52］。常見(jiàn)的生物化學(xué)硫醇，如Cys、N?乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽，降低硫柳汞因高巰基反應(yīng)性而導(dǎo)致的細(xì)胞毒性已被證實(shí)［53］。添加游離Cys 可在后續(xù)工序中用于疫苗抗原關(guān)鍵Cys殘基的再生，則硫柳汞對(duì)疫苗的一些不利影響可能被逆轉(zhuǎn)［38］，或在設(shè)計(jì)和優(yōu)化疫苗抗原時(shí)，可通過(guò)突變Cys，如將Cys 突變成絲氨酸，來(lái)避免Cys的巰基反應(yīng)性［47］。

圖1 硫柳汞與蛋白抗原相互作用的可能作用機(jī)制圖Fig.1 Diagram of possible mechanisms of thimerosal inter?action with protein antigens

5 小結(jié)與展望

綜上所述，疫苗常用防腐劑硫柳汞可對(duì)部分疫苗抗原產(chǎn)生負(fù)面影響，抗原上的Cys與硫柳汞或其水解產(chǎn)物乙基汞的相互作用是降低抗原活性的可能機(jī)制。因此，在疫苗防腐劑為硫柳汞，抗原Cys 側(cè)鏈上的巰基參與構(gòu)成抗原關(guān)鍵表位或臨近抗原關(guān)鍵表位時(shí)，應(yīng)充分深入研究硫柳汞對(duì)疫苗抗原性和免疫原性的影響。此外，當(dāng)疫苗制劑需要添加防腐劑而硫柳汞與抗原無(wú)法兼容時(shí)，可考慮使用2?PE、苯酚等替代，并進(jìn)行可行性研究。未來(lái)應(yīng)擴(kuò)寬硫柳汞對(duì)不同疫苗（包括獸用疫苗）抗原活性影響的研究，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入探索，為疫苗防腐劑的選擇提供理論支持。