馬力，李冠軍，張學成，范蓓，馬小偉，王志剛

華蘭生物工程股份有限公司研發(fā)中心，河南 新鄉(xiāng) 453003

血液制品是以健康人混合血漿為原料，經(jīng)不同的分離純化工藝制備的生物制品。血液制品的生物安全一直是監(jiān)管部門、生產(chǎn)企業(yè)和社會關注的重點。靜注人免疫球蛋白（intravenous human immunoglobulin，IVIG）作為血液制品的主要成員，在臨床應用廣泛。

目前，IVIG 采用的病毒滅活／去除方法通常有低pH 孵放滅活、巴氏滅活、辛酸滅活、S／D 滅活和納米除病毒過濾等方法［1?5］。不同的病毒滅活／去除方法其作用原理不同，低pH 孵放依靠pH 值、溫度以及孵放時間可有效實現(xiàn)對脂包膜病毒滅活；巴氏滅活需加入大量的蛋白保護劑在高溫條件下實現(xiàn)對脂包膜病毒的滅活，高溫條件滅活病毒的同時不可避免地會對蛋白造成破壞，使蛋白變性；辛酸滅活和S／D 滅活通過加入滅活劑破壞病毒脂包膜實現(xiàn)病毒滅活，滅活劑的加入會造成最終產(chǎn)品的滅活劑殘留；納米除病毒過濾依據(jù)過濾孔徑實現(xiàn)病毒的截留，可有效去除脂包膜和非脂包病毒，且易于保持蛋白質的天然活性。納米除病毒過濾作為一種新型的病毒去除方法已廣泛應用于血液制品行業(yè)［6?9］。

納米除病毒過濾器的材質主要有聚醚砜、再生纖維素和聚偏氟乙烯。納米除病毒過濾方式分為切向流過濾和死端過濾兩種方式。過濾器材質、過濾方式以及預過濾系統(tǒng)均會影響蛋白過濾效果［10?11］。本研究旨在探討不同預過濾器及其納米過濾器組成的納米過濾系統(tǒng)對IVIG 過濾效果的影響，以篩選最佳納米過濾系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 IVIG 為本公司采用層析工藝制備。

1.2 主要儀器 納米過濾器A 和預過濾器Y1 購自德國默克密理博公司；納米過濾器B 和C 購自日本旭化成株式會社；納米過濾器D、E 和預過濾器Y2、Y3、Y4 購自德國賽多利斯公司；預過濾器Y5 購自美國3M公司。

1.3 納米過濾器的篩選 取IVIG 原液，分別采用不同的納米過濾器（工作方式見表1），按照相應的產(chǎn)品說明書過濾壓力進行除病毒過濾，記錄過濾時間和過濾體積，并按下式計算衰減速率和過濾蛋白量，以過濾速度衰減至10%為過濾終點，篩選最佳納米過濾器。

表1 不同納米過濾器工作方式Tab.1 Working modes of various nanofilters

衰減速率（%）=相鄰時間點過濾速度／過濾初始速度；

過濾蛋白量（kg／m2）=過濾體積×蛋白質濃度

1.4 預過濾器的篩選 取IVIG 原液，選擇1.3 項篩選的納米過濾器，分別采用不同預過濾器（工作方式見表2）串聯(lián)納米過濾器，按照相應說明書進行除病毒過濾，記錄過濾時間和過濾體積，并計算衰減速率和過濾蛋白量，篩選最佳納米過濾組合系統(tǒng)。

表2 不同預過濾器的工作方式Tab.2 Working modes of various prefilters

1.5 結果分析 分別以過濾蛋白量和過濾衰減速率為縱坐標，過濾時間為橫坐標繪制趨勢圖，評價納米過濾效果。試驗均進行3 次，結果采用3 次數(shù)據(jù)平均值。

2 結果

2.1 納米過濾器的篩選 不同納米過濾器過濾效果差異明顯。過濾蛋白量：納米過濾器C > E > A >D > B，見圖1；過濾衰減速率：C < E < B < D < A，見圖2。納米過濾器A 和D 單位時間內過濾通量相對于其他過濾器較高，但過濾衰減速率也最快；納米過濾器C、B 和E 過濾衰減速率優(yōu)于其他過濾器，且納米過濾器C 過濾蛋白量最高。表明切向流過濾模式的過濾衰減速率均優(yōu)于死端過濾模式；納米過濾器B 由于過濾壓力低于其他納米過濾器，其過濾蛋白量較低。依據(jù)不同納米過濾器過濾特點和成本，選擇C為最佳納米過濾器。

圖1 不同納米過濾器的過濾蛋白量Fig.1 Filtered protein load of various nanofilters

圖2 不同納米過濾器的衰減速率Fig.2 Attenuation rate of various nanofilters

2.2 預過濾器的篩選 過濾蛋白量：預過濾器Y1 >Y5>Y2>Y3>Y4，見圖3；過濾衰減速率：預過濾器Y1

圖3 不同預過濾器的過濾蛋白量Fig.3 Filtered protein load of various prefilters

圖4 不同預過濾器的衰減速率Fig.4 Attenuation rate of various prefilters

3 討論

納米膜除病毒過濾已廣泛應用于血液制品中。不同的納米過濾器因其過濾器材質、過濾方式不同，過濾效果有所差異。本研究中切向流過濾方式的過濾衰減速率優(yōu)于死端過濾方式，但死端過濾方式的過濾初始通量優(yōu)于切向流過濾。這與納米過濾器結構特點相關，納米過濾器A、D，其過濾孔徑采用的是喇叭口設計（即過濾孔徑由大至?。?，可有效提高過濾初始通量。切向流納米過濾器B、C、E采用的中空纖維管壁開口設計，過濾孔徑相對均一，因此其過濾初始通量相對較低，但過濾衰減相對較慢。

采用不同的預過濾器過濾后，對后續(xù)納米過濾均產(chǎn)生了正影響。但不同預過濾器因過濾器材質、過濾方式不同，對納米過濾效果的影響程度有所差異。本研究中深層過濾過濾器對納米過濾效果提高均優(yōu)于絕對過濾過濾器。預過濾器Y1、Y2 和Y5 具備電荷吸附和深層過濾兩種機制，電荷吸附可能會對過濾料液進一步純化，提高過濾效果；預過濾器Y3 為具備電荷吸附的絕對過濾，電荷吸附可能會對過濾料液進一步純化，因此過濾效果優(yōu)于預過濾器Y4。

不同納米過濾器的材質不同，其親水性和疏水性有差異。不同料液其目標蛋白、緩沖液、穩(wěn)定劑差異可能會對不同納米過濾器表現(xiàn)出不同的相容性，進而影響過濾效果［12］。不同材質納米過濾膜的最適pH 有一定差異性，有文獻表明，不同pH 值可能會對納米過濾的物理結構產(chǎn)生一定影響［13］。不同納米過濾膜對料液最適蛋白質含量適用性不同，如納米過濾器A 依據(jù)廠家指導意見過濾蛋白濃度以不高于15 mg／mL 為宜。不同的納米過濾器適宜的蛋白質含量應依據(jù)試驗而定。為了保證蛋白穩(wěn)定性和活性，通常需加入相應的穩(wěn)定劑，不同的穩(wěn)定劑作用機理不同，也可能會影響納米過濾效果。有文獻表明，料液中穩(wěn)定劑會使病毒聚集，減緩過濾衰減速濾，提高過濾效果［14］。

不同納米過濾器因其材質、制備工藝和市場因素差異，其成本有所差異。對于生產(chǎn)企業(yè)而言，生產(chǎn)成本控制也是考慮的重要因素。因此需結合不同納米過濾系統(tǒng)的過濾效率、產(chǎn)品特點和生產(chǎn)成本控制選擇最佳的納米過濾系統(tǒng)。如納米過濾器A 的過濾衰減速率快，但單位時間過濾通量大，較適合如單抗類蛋白穩(wěn)定性較差，不易長時間過濾的產(chǎn)品；納米過濾器C 單位時間過濾通量較低，但過濾衰減速率較慢，較適于如血液制品等蛋白穩(wěn)定性好的產(chǎn)品。

綜上所述，本研究探討了不同預過濾器及不同納米過濾膜組成的納米過濾系統(tǒng)的過濾效果，為不同蛋白制劑選用納米過濾系統(tǒng)提供了理論支持。