姜文廷，王嘉賓，石雪建，萬 博，杜永坤，蔣大偉，姬鵬超，張改平

(河南農業(yè)大學 國家動物免疫學國際聯(lián)合研究中心，河南 鄭州 450002)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由ASFV感染引起的高度致病性、傳染性疾病，可感染各年齡段的家豬和野豬，家豬感染高致病性毒株突發(fā)高熱后即死亡，致死率高達100%，是世界動物衛(wèi)生組織法定報告的通報性疾病[1-3]。

ASFV是一種大型雙鏈DNA病毒，基因組大小170～193 kb，由中心保守區(qū)和兩端可變區(qū)組成，具有151～167個開放閱讀框，編碼50多種結構蛋白[4]，是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員[5]，主要感染家豬、野豬和軟蜱蟲，是目前發(fā)現(xiàn)的僅有的以昆蟲為傳播媒介的DNA病毒[6]。

CD2v蛋白由EP402R(8DR)基因編碼，是位于ASFV粒子的外囊膜上的特征性糖基化蛋白，介導病毒粒子和感染細胞的血吸附，在病毒感染的晚期表達活躍[7-8]。EP402R基因在ASFV感染細胞中表達，可以檢測到105～110 kDa的糖基化全長形式[9]。全長表達的CD2v蛋白分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質區(qū)。胞外區(qū)由1個信號肽和2個IgG樣結構域組成，與T細胞黏附分子CD2同源，在結構和功能上具有相似性，能夠與豬紅細胞表面的受體結合，參與病毒在體內的運輸?？缒^(qū)為單次跨膜結構，胞質區(qū)末端有兩簇富含脯氨酸的重復序列，不同菌株間該重復序列的長度不同，可作為一種遺傳標記來示蹤病毒的傳播[10]。該序列可以介導蛋白通過內吞作用進入細胞，被認為是一種細胞穿透肽(cell penetrating peptide，CPP)，具有潛在的應用價值[11]。

本研究利用生物信息學方法對CD2v蛋白氨基酸序列進行分析，截取其胞外區(qū)序列并利用真核表達系統(tǒng)進行表達，蛋白經純化后免疫家兔制備多克隆抗體，為CD2v蛋白功能的進一步研究奠定基礎，也可用于野毒株與CD2v基因缺失毒株鑒別診斷方法的建立。

1 材料與方法

1.1 細胞、菌株和質粒293 F細胞和pcDNA3.1(+)載體由本實驗室保存；JM109感受態(tài)細胞購自上海唯地生物技術有限公司；CD2v胞外區(qū)基因根據(jù)真核表達系統(tǒng)進行密碼子優(yōu)化后連入pUC57載體，重組質粒由GeneScript公司合成，命名為ASFV-CD2v-pUC57。

1.2 實驗動物清潔級新西蘭雌性大白兔，體質量2.5 kg，購自鄭州鼎國生物技術有限公司。

1.3 主要試劑Q5?熱啟動高保真DNA聚合酶、NheⅠ/EcoRⅠ 限制性核酸內切酶均購自NEB公司；EasyPure?Plasmid MiniPrep Kit、EasyPure?PCR Purification Kit均購自北京全式金生物技術有限公司；SMM 293-TⅡExpression Medium、Sinofection轉染試劑均購自義翹神州生物技術有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑、胎牛血清、Opti-MEM?Ⅰ減血清培養(yǎng)基均購自Thermo公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購自上海源培生物科技股份有限公司；AEC酶底物試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；HisTrap Excel購自Cytiva公司。

1.4 主要儀器基因擴增儀購自AnalytikJena公司；多功能凝膠成像系統(tǒng)、超靈敏多功能成像儀購自Bio-RAD公司；冷凍離心機購自Eppendorf公司；倒置熒光顯微鏡購自Olympus Corporation公司；振蕩培養(yǎng)箱購自INFORS公司等。

1.5 方法

1.5.1CD2v蛋白氨基酸序列的生物信息學分析 參照NCBI公布的China/2018/AnhuiXCGQ基因序列(登錄號:MK128995.1)，對ASFV EP402R基因序列進行分析，跨膜結構預測使用在線軟件服務器TMHMM-2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)；疏水性預測使用在線軟件服務器ProtScale(https://web.expasy.org/protscale)；信號肽預測使用SignalP-4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)。

1.5.2CD2v胞外區(qū)蛋白氨基酸序列比對分析 參照從NCBI下載的國內各地區(qū)(登錄號：MN172368.1、MN393476.1、MK333180.1、MK333181.1、MK-645909.1、MN393477.1、MT496893.1、MK940252.1)及國外流行株(登錄號：NC_044947.1、NC_044959.2、NC_044958.1、NC_001659.2、NC_044943.1)的ASFV EP402R全基因序列，使用在線工具TMHMM-2.0進行跨膜區(qū)預測，截取胞外區(qū)氨基酸序列與截短的目的片段使用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對。

1.5.3引物設計與擴增 以ASFV-CD2v-pUC57為模板，用SnapGene 4.1.9軟件設計特異性引物，上游引物F：5′-GCTAGCATGATCATCCTGATC-TTC-3′；下游引物R：5′-GAATTCTCACATCATCACCATCACCACGTACAGCTTAAAGAA-3′(下劃線分別為Nhe Ⅰ、EcoR Ⅰ 酶切位點和6×His標簽)，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應程序：98℃ 30 s；98℃ 10 s，58.5℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)；72℃延伸8 min，4℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用EasyPure?PCR Purification Kit按照說明書方法回收。

1.5.4表達載體構建 將回收的PCR產物與pcDNA3.1(+)載體分別進行雙酶切，37℃酶切4 h，跑膠鑒定正確后回收。將回收的載體和目的片段酶切產物進行連接，16℃連接2 h后轉化JM109感受態(tài)細胞，將菌液涂布于Amp抗性的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單克隆進行菌液PCR鑒定(陰性對照模板設為LB)和雙酶切鑒定(陰性對照為未酶切的質粒)。將初步鑒定正確的克隆送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.5.5蛋白的表達與鑒定 293 F細胞在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至細胞密度為2.5×106/mL，活率大于95%。將重組質粒與Senofection配制成轉染復合物轉染細胞，同時轉染pcDNA3.1(+)空載體設為陰性對照，轉染24 h后開始按比例添加補料，每隔24 h添加1次，并收集細胞檢測蛋白表達情況。抽取1 mL轉染細胞，500×g離心5 min，上清用0.22 μm濾膜過濾后置于冰上，細胞用預冷PBS清洗3遍后加細胞裂解液裂解。將培養(yǎng)上清和裂解上清進行SDS-PAGE電泳，轉印至PVDF膜，分別以His單抗和ASFV陽性血清、ASFV陰性血清作為一抗鑒定目的蛋白的表達。

1.5.6CD2v胞外區(qū)蛋白的純化 收集轉染后5 d的細胞上清，經0.22 μm濾膜過濾，用Ni-NTA層析柱進行親和層析，收集洗脫下的目的蛋白，經透析濃縮和除鹽后測定蛋白質量濃度為2.1 g/L，抽取30 μg 蛋白用PBS稀釋后進行SDS-PAGE檢測。

1.5.7CD2v蛋白與ASFV陽性血清的反應 通過間接ELISA方法測定抗體效價。具體方法：用CBS(pH9.6)稀釋CD2v蛋白至1 mg/L，每孔100 μL 于4℃條件下包被過夜，洗板后加脫脂奶進行封閉。加入倍比稀釋的ASFV陽性血清，每孔100 μL，ASFV陰性血清設為陰性對照，每組3個復孔，37℃孵育1 h；加入1∶5 000稀釋的HRP-羊抗豬IgG二抗，37℃孵育1 h；加入TMB雙組分顯色液進行顯色，讀取D450 nm，使用GraphPad Prism 8.0.2軟件取平均值進行分析并作圖，以陽性∶陰性(P/N)≥ 2.1結果判定為陽性。

1.5.8多克隆抗體的制備 將體質量2.5 kg健康雌兔在新環(huán)境中穩(wěn)定適應1周，通過耳緣靜脈采血2 mL，分離血清于-20℃條件下保存，標記為兔陰性血清。初次免疫將蛋白用PBS稀釋后與弗氏完全佐劑按體積比為1∶1混合進行乳化，每只家兔背部多點皮下注射免疫100 μg。分別在第3，5，7周進行二免、三免和四免。三免后7～10 d通過耳緣靜脈采血分離血清，Western blot鑒定陽性后于四免后第10天通過大腿動脈放血制備抗血清，分裝后于-80℃ 存放。

1.5.9多克隆抗體的效價測定 采用間接ELISA方法測定多克隆抗體與CD2v蛋白的結合效價，參照方法1.5.7。

1.5.10多克隆抗體的Western blot鑒定 將純化的CD2v胞外區(qū)蛋白用PBS稀釋后按每泳道2 μg蛋白制樣，參照1.5.5方法進行Western blot檢測。

1.5.11多克隆抗體的IPMA鑒定 將PK-15細胞接種于24孔板，待細胞密度長至70%時轉染重組質粒，并轉染空載體設為陰性對照；轉染6～8 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，用PBS洗去殘余培養(yǎng)基，固定細胞并進行封閉，加入1∶2 000稀釋的多克隆抗體37℃孵育1 h；TBST洗5遍后，加入HRP-羊抗兔二抗IgG，37℃孵育1 h；加入AEC顯色液室溫顯色15 min，用自來水清洗終止反應于倒置顯微鏡下觀察。

1.5.12多克隆抗體的IFA鑒定 參照1.5.11方法，將PK-15細胞接種于細胞爬片，轉染36 h后固定，一抗為1∶2 000稀釋的多克隆抗體，二抗為1∶500稀釋的FITC-羊抗鼠IgG，避光干燥后于倒置熒光顯微鏡下觀察結果。

2 結果

2.1 CD2v蛋白氨基酸序列的生物信息學分析EP402R基因經生物信息學軟件預測其跨膜區(qū)(圖1A)及疏水性(圖1B)及信號肽(圖1C)，預測結果顯示：胞外區(qū)為1～206 aa，跨膜區(qū)為207～229 aa，胞內區(qū)為230～360 aa，信號肽1～22 aa。

圖1 CD2v蛋白的跨膜區(qū)(A)、疏水性(B)及信號肽(C)分析結果

2.2 CD2v胞外區(qū)蛋白的氨基酸序列比對分析將截短的CD2v胞外區(qū)序列與選取的13株ASFV流行株的CD2v胞外區(qū)序列用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對，序列相似性為84.16%(圖2)，其中與8株國內流行性株相似性高達100.00%，與5株國外流行株相似性為79.64%，在國外流行株中與典型高致病性流行株Georgia 2007/1(登錄號：NC_044959.2)序列相似度高達100.00%。

圖2 CD2v胞外區(qū)蛋白的氨基酸序列比對結果

2.3 CD2v胞外區(qū)蛋白重組質粒的構建以ASFV-CD2v-pUC57為模板設計特異性引物進行擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳，得到約為651 bp大小的特異性條帶(圖3A)，與預期大小相符；挑選的陽性克隆經菌液PCR鑒定，特異性條帶大小約為651 bp，與預期相符(圖3B)；重組質粒經雙酶切鑒定，可見載體和目的片段(圖3C)；測序結果顯示目的基因插入位置正確，無缺失和移碼突變。

A.CD2v胞外區(qū)基因PCR擴增結果(M.Trans 5K Marker；1.PCR擴增；2.陰性對照)；B.重組質粒菌液PCR鑒定結果(M.Trans 5K Marker；3.菌液PCR；4.陰性對照)；C.重組質粒雙酶切鑒定結果(M.Trans 5K Marker；5.雙酶切；6.陰性對照)

2.4 CD2v胞外區(qū)蛋白的表達鑒定收集轉染細胞的培養(yǎng)基，利用His單抗和ASFV陽性血清進行Western blot鑒定。結果顯示，CD2v胞外區(qū)蛋白能夠與His單抗(圖4A)和ASFV陽性血清(圖4B)發(fā)生特異性反應，蛋白的相對分子質量大小為63～89 kDa，蛋白發(fā)生糖基化，呈彌散狀條帶。為檢測CD2v胞外區(qū)蛋白的表達規(guī)律，收集轉染后1～8 d的細胞上清用His單抗進行檢測，結果顯示目的蛋白在轉染后第2天開始大量表達，至轉染后第8天，表達量逐漸增高，檢測期間沒有顯示出其他非特異性蛋白的表達(圖4C)。

A.CD2v胞外區(qū)重組蛋白與His單抗反應的Western blot檢測(M.蛋白Marker；1.細胞上清;2.陰性對照)；B.CD2v胞外區(qū)重組蛋白與ASFV陽性血清反應的Western blot檢測(M.蛋白Marker；1.細胞上清;2.陰性對照)；C.轉染后1～8 d CD2v胞外區(qū)重組蛋白在293 F細胞中的表達鑒定(M.蛋白Marker；1～8.1～8 d細胞上清；9.陰性對照)

2.5 CD2v胞外區(qū)重組蛋白的純化收集轉染后的培養(yǎng)基上清進行親和層析純化，純化后的CD2v胞外區(qū)蛋白經SDS-PAGE電泳鑒定，可見大小為63～89 kDa的彌散條帶，目的條帶較為單一，與圖4A相符，表明CD2v胞外區(qū)蛋白親和層析純化效果良好(圖5)。

M.蛋白Marker；1.純化后；2.純化前

2.6 CD2v蛋白與ASFV陽性血清的抗原性反應利用間接ELISA方法檢測CD2v蛋白與ASFV陽性血清的反應，讀取D450 nm，取平均值進行分析，以陽性∶陰性(P/N)≥ 2.1結果判定為陽性。結果顯示ASFV陽性血清抗體效價為1∶32 000(圖6)。

圖6 CD2v蛋白與ASFV陽性血清的反應

2.7 多克隆抗體的抗體效價測定利用間接ELISA方法測定多克隆抗體的效價，兔抗血清和兔陰性血清分別倍比稀釋后加入作為一抗，顯色終止后讀取D450 nm，以陽性∶陰性(P/N)≥ 2.1結果判定為陽性。結果兔抗血清效價為1∶1 024 000(圖7)。

圖7 多克隆抗體的抗體效價測定結果

2.8 多克隆抗體的Western blot鑒定以1∶2 000稀釋的兔多克隆抗體作為一抗，兔陰性血清為陰性對照，對CD2v胞外區(qū)蛋白進行檢測，檢測到大小與預期相符的蛋白條帶(圖8A)，陰性對照組中沒有檢測到目的蛋白(圖8B)。表明制備的多克隆抗體特異性良好，能夠用于CD2v胞外區(qū)蛋白的Western blot檢測。

A.兔多克隆抗體；B.兔陰性血清。M.蛋白Marker；1.CD2v蛋白

2.9 多克隆抗體的IPMA鑒定將重組質粒轉染PK-15細胞(圖9A)，同時轉染空載體質粒設為陰性對照(圖9B)，轉染后24 h將細胞固定，加入1∶500稀釋的兔多克隆抗體作為一抗，在顯微鏡下可觀察到明顯的染色細胞。表明制備的多克隆抗體能夠用于CD2v蛋白的IPMA檢測。

A.轉染CD2v胞外區(qū)重組質粒的PK-15細胞；B.轉染空載質粒的PK-15細胞

2.10 多克隆抗體的IFA鑒定將重組質粒轉染PK-15細胞(圖10A)，設陰性對照同2.9(圖10B)，以1∶500稀釋的兔多克隆抗體作為一抗，在熒光顯微鏡下可觀察到明顯的染色細胞。表明制備的多克隆抗體可用于CD2v蛋白的IFA檢測。

A.轉染CD2v胞外區(qū)重組質粒的PK-15細胞；B.轉染空載質粒的PK-15細胞

3 討論

ASF疫情于1921年在肯尼亞首次被報道[12]，隨后歐洲、南美洲、亞洲的多個國家均先后暴發(fā)了ASF疫情。雖然ASF不是一種人畜共患疾病[13]，但ASF疫情的暴發(fā)在全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經濟損失，對ASFV感染機體的免疫保護機制認識不足，導致ASF疫苗的研究有很大的局限性。

滅活疫苗作為初次被嘗試研發(fā)的疫苗，免疫機體后沒有表現(xiàn)出明顯的免疫保護效果，后來通過試驗發(fā)現(xiàn)即使加以高效佐劑也不能產生有效的免疫保護[14]。針對ASFV的毒力基因和逃逸相關基因研發(fā)的核酸疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗、基因缺失疫苗以及分離出的減毒活疫苗，都沒有或部分表現(xiàn)免疫保護效果[14-19]，因此目前的控制措施主要依賴于檢測和捕殺受感染的動物。一些自然分離的ASFV弱毒株表現(xiàn)為血吸附現(xiàn)象的缺失[20-22]，或CD2v基因的突變[23]，研究發(fā)現(xiàn)通過缺失CD2v基因產生的ASFV 弱毒株取得了良好的免疫保護效果[24]，盡管減毒活疫苗的開發(fā)面臨著許多問題與挑戰(zhàn)，但仍被認為是實現(xiàn)交叉保護的理想工具[25]。一旦ASFV減毒活疫苗開發(fā)成功，將被廣泛應用于ASF疫情的防控，因此需要來區(qū)分野生型和缺失疫苗株感染[26]，且由于CD2v缺失株和野生型在毒力和致病性方面的表現(xiàn)差異，一種有效的檢測方法也可以用來輔助評估ASF疫情的發(fā)展趨勢，采取更有效的防治措施以減少損失。

制備高質量和高效價的CD2v蛋白多克隆抗體是研究CD2v蛋白功能的基礎。本研究選擇了ASFV CD2v蛋白的胞外結構域，以其自身信號肽作為分泌信號，使其在培養(yǎng)細胞中分泌表達，表達的蛋白大小為63～89 kDa，與真核表達的一些糖基化蛋白具有相似的特征[27-29]，可能是蛋白在細胞中糖基化程度的不同導致了蛋白相對分子質量不均一。ELISA檢測該糖基化蛋白與ASFV陽性血清反應效價可達1∶32 000，在1 000倍稀釋后D450 nm仍可達到1.0。制備的兔抗ASFV CD2v胞外區(qū)蛋白多克隆抗體，能夠識別細胞中表達的CD2v蛋白，可用于CD2v蛋白的 ELISA、Western blot、IPMA和IFA檢測，具有很強的特異性和親和力，為進一步研究CD2v蛋白的功能和ASFV鑒別診斷方法的建立奠定了基礎。