楊曉偉,陸 婧，王凱民，莊鴻琨，田宇森，李俊鋒，朱盈名，劉 霞，張立武，趙光偉, *

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2.南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，江蘇 南京，210095;3 貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng)550008；4.重慶三杰眾鑫生物工程有限公司，重慶 榮昌 402460)

禽呼腸孤病毒(avian reovirus,ARV)是呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬的成員。鴨源呼腸孤病毒是其中的一種，目前主要有2種基因型，一種是番鴨呼腸孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)，主要引起番鴨、半番鴨肝臟、脾臟壞死，腎臟出血等病理變化，俗稱“花肝病”或“肝白點(diǎn)病”；另一種則是引起麻鴨、番鴨、北京鴨、櫻桃谷鴨等多品種鴨以脾臟斑塊樣壞死為特征的“脾壞死病”，該病的病原為新型鴨呼腸孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)，可通過(guò)垂直和水平2種方式傳播，發(fā)病鴨病死率達(dá)到5%～50%，日齡越小病死率越高，無(wú)明顯的季節(jié)性，已經(jīng)成為我國(guó)近年來(lái)最嚴(yán)重的鴨病毒性傳染病之一[1]。

NDRV與其他禽源呼腸孤病毒均為呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬的成員，為分節(jié)段的雙鏈RNA病毒[2]。病毒粒子無(wú)囊膜，約為70 nm，呈24面體對(duì)稱，具有雙層衣殼結(jié)構(gòu)，病毒基因組由10個(gè)基因組片段組成，根據(jù)基因組在PGAE電泳中的遷移率不同，可分為3個(gè)長(zhǎng)片段(L1、L2、L3)，3個(gè)中片段(M1、M2、M3)和4個(gè)小片段(S1、S2、S3、S4)[3]。除了S1片段以外其他的基因片段均只含有1個(gè)開放閱讀框，分別編碼1種蛋白，L組編碼λ蛋白(λ1、λ2、λ3)，M組編碼μ蛋白(μ1、μ2、μ3)，S組S2、S3、S4分別編碼σA、σB、 σNS蛋白，S1基因片段具有多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)，包含3個(gè)重疊的開放閱讀框并編碼σC、P10、P17蛋白[4]。NDRV S1片段的多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)與MDRV差異較大，且MDRV的p10和σC蛋白由最小的基因組節(jié)段S4編碼，并且不編碼p17蛋白，因此NDRV 在基因組序列上與其他禽源呼腸孤病毒存在較大差異[5]。

近年來(lái)，我國(guó)川渝地區(qū)鴨場(chǎng)中多發(fā)以肝臟、脾臟出血、壞死為主要特征的傳染性疾病，病死率達(dá)30%，其特征與NDRV病相似。因此，為明確該病的致病原及其分子特征，本試驗(yàn)對(duì)四川省隆昌地區(qū)的患病鴨進(jìn)行了病毒的分離、鑒定與全基因組的測(cè)定分析，以期為該病的防控提供必要的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒的分離無(wú)菌采集四川省隆昌某鴨場(chǎng)5只具有典型脾臟壞死的花邊鴨病料(肝臟和脾臟)，剪碎混勻，加入無(wú)菌PBS液研磨為勻漿液，于-20℃ 和4℃反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心15 min 取上清液，用孔徑為0.22 μm的一次性濾芯過(guò)濾除菌，將濾液經(jīng)尿囊腔按0.2 mL/枚接種11日齡SPF鴨胚8枚，同時(shí)設(shè)置8枚作為對(duì)照組注射等量無(wú)菌生理鹽水，用蠟封孔，37℃靜置孵育。將接種病料后24～120 h內(nèi)死亡的鴨胚和對(duì)照組鴨胚于4℃冷藏2 h后收集尿囊液，將收集的尿囊液按1∶10的比例加入氯仿后12 000 r/min離心取上清，同樣用0.22 μm濾芯過(guò)濾除菌后分裝于-80℃保存，將其命名為F1代。將F1代尿囊液按照同樣的方法接種于一批新的SPF鴨胚，依次傳代(標(biāo)記為Fn)，直到感染鴨胚出現(xiàn)規(guī)律性死亡，剖解死亡鴨胚并記錄病理變化。

1.2 病原的RT-PCR鑒定參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]，根據(jù)NDRV S1基因序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成1對(duì)特異性引物，上游F：5′-TGAGACGCCTGACTACGA-TT-3′，下游R：5′-ATGCTTGGAGTGAGACGA-CT-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為380 bp，引物由華大基因科技公司合成。取1.1保存的組織勻漿液和尿囊液，分別用EasyPure Viral DNA/ RNA提取試劑盒(ER201-01，北京全式金)提取其總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按如下體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25.0 μL)：模板3 μL，10 pmol/L上、下游引物各1.0 μL，Premix Taq 12.5 μL，無(wú)菌ddH2O 7.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 45 s，共33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存，將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)后回收目的片段，送華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 全基因組序列的測(cè)定病毒全基因組的測(cè)定由上海凌恩生物科技有限公司完成。其主要步驟為：取1.1中保存的尿囊液提取總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度，使其D260/D280值在1.8～2.0之間以制備測(cè)序文庫(kù)。以1 μg 總 RNA起始量建庫(kù)，首先使用Illumina的TruseqTMRNA sample prep Kit專用片段化緩沖溶液將RNA片段化，接著用隨機(jī)寡核苷酸合成第1條鏈后混合DNA聚合酶Ⅰ和RNase H合成雙鏈cDNA。然后通過(guò)核酸外切酶/聚合酶將cDNA突出端補(bǔ)平，并在3′端連接上index接頭，使用Illumina聚合酶鏈反應(yīng)引物混合物在15個(gè)循環(huán)的聚合酶鏈反應(yīng)中選擇性富集兩端連接有銜接分子的DNA片段，于2%的瓊脂糖膠回收長(zhǎng)度約150 bp的目的條帶,然后利用TBS380(picogreen)對(duì)回收的基因片段進(jìn)行定量，在cBot Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS上進(jìn)行橋式擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增得到的片段在Illunima novaseq 6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行300個(gè)循環(huán)測(cè)序獲得原始NGS數(shù)據(jù)。過(guò)濾低質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)，利用DNAStar軟件對(duì)過(guò)濾后的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝。將最終測(cè)序得到的基因序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 同源性和遺傳進(jìn)化分析利用DNAStar軟件和NCBI網(wǎng)站中BLAST功能對(duì)測(cè)序完成的病毒基因組進(jìn)行同源性的分析比對(duì)；利用MEGA X軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹(bootstrap值500)，分別構(gòu)建10個(gè)基因組片段的禽類呼腸孤病毒的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析分離株在遺傳進(jìn)化樹上與其他禽類呼腸孤病毒之間的差異。

1.5 分離毒株對(duì)鴨胚的致病性試驗(yàn)取1.1中最新一代尿囊液，按10倍梯度進(jìn)行系列稀釋，取10-4，10-5，10-6和10-74個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種5枚9～11日齡SPF鴨胚，每枚絨毛尿囊腔接種0.2 mL，37℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察120 h，根據(jù)Reed-Muench法，計(jì)算分離毒的ELD50。

1.6 分離毒株對(duì)雛鴨的致病性試驗(yàn)20只7日齡健康花邊鴨隨機(jī)分成攻毒組和陰性對(duì)照組，每組10只。攻毒組：取1.1中保存的最新一代尿囊液，按照0.3 mL(2×ELD50)/只劑量肌肉注射10只健康花邊鴨；陰性對(duì)照組：每只肌肉注射0.3 mL無(wú)菌生理鹽水。攻毒后連續(xù)觀察10 d，記錄鴨發(fā)病和死亡的情況。取發(fā)病鴨脾臟和肝臟進(jìn)行組織切片，HE染色后觀察其組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離病料接種后的鴨胚在第6代時(shí)出現(xiàn)規(guī)律性死亡，死亡高峰期集中在72 h左右。F6代鴨胚全部死亡，死亡鴨胚主要表現(xiàn)為胚體出血，尤以腿和內(nèi)臟器官最明顯(圖1A、B)，部分胚體明顯發(fā)育不良(圖1B、E)。肝臟、脾臟、頭部出血明顯(圖1C、D)。腿部嚴(yán)重出血(圖1E)。對(duì)照組均未出現(xiàn)異常癥狀(圖1F)。

A～E.均為攻毒組鴨胚(A可見頭部，內(nèi)臟器官出血；B和E中鴨胚發(fā)育受阻，腿部出血嚴(yán)重；C和D中鴨胚脾臟嚴(yán)重出血)；F.為未接毒的陰性對(duì)照，發(fā)育正常

2.2 病原的RT-PCR鑒定對(duì)勻漿液和尿囊液進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出約為380 bp的目的條帶 (圖2)，與預(yù)期大小相符。將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示該病毒為NDRV，將其命名為SL株。

M.DL2000 DNA Marker;1.病料樣本檢測(cè)結(jié)果;2.F6代尿囊液檢測(cè)結(jié)果

2.3 分離毒株SL株全基因組的測(cè)序結(jié)果測(cè)序結(jié)果顯示，SL株基因組全長(zhǎng)23 580 bp，G+C含量為49.62%，共由10個(gè)基因組片段組成，分別為S1～S4，其中S1 1 534 bp、S2 1 351 bp、S3 1 186 bp、S4 1 175 bp；M1～M3片段中M1 2 249 bp、M2 2 141 bp、M3 2 022 bp；L1～L3片段中L1 3 919 bp、L2 3 827 bp、L3 4 176 bp。將測(cè)序得到的全基因組序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，其登錄號(hào)分別為MW196679～MW196688。其中S1基因?yàn)槎囗樂(lè)醋?含有3個(gè)重疊的ORF閱讀框，分別編碼3種蛋白(σC、P10、P17)，其他片段各含1個(gè)完整的ORF，編碼1種蛋白，SL株的所有節(jié)段與其他禽類呼腸孤病毒都具有相同的5′-GCUUUUU…UCAUC-3′末端保守序列(表1)。

表1 SL株基因組信息

2.4 全基因序列的同源性和遺傳進(jìn)化分析結(jié)果將測(cè)序得到含有10個(gè)基因節(jié)段的全基因組序列用DNAStar軟件和NCBI的BLAST功能分別進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示：SL株與NDRV、MDRV、GRV (03G株)、ARV的同源性分別為87.20%～99.48%，80.09%～98.77%，87.38%～95.90%和70.04%～91.15%，與NDRV毒株的同源性最高，與ARV毒株的同源性最低。其中與S1、S4、L2、L3等4個(gè)片段同源性最高的均是NDRV的GX-Y7株(分別為99.48%，99.23%，98.76%，98.44%)，與S2、S3、M3等3個(gè)片段同源性最高的均是NDRV的XT18株(分別為99.38%，99.15%，98.98%)。與M2片段同源性最高的是NDRV的SY株(98.55%)，與M1片段同源性最高的是NDRV的HN5D株(98.00%)。只有L1片段與MDRV的SH12株同源性最高(98.19%)。在與所有參考毒株的比對(duì)結(jié)果中，GX-Y7株和XT18株與SL株同源性最高，相比之下，SL株與ARV的同源性最高僅為91.15%。

A～C.L基因片段(L1～L3)的系統(tǒng)進(jìn)化樹;D～F.M基因片段(M1～M3)的系統(tǒng)進(jìn)化樹;G～J.S基因片段(S1～S4)的系統(tǒng)進(jìn)化樹。紅色圓點(diǎn)標(biāo)記的為本試驗(yàn)分離毒株SL株

將測(cè)序得到的10個(gè)全基因組序列利用MEGA X軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹，bootstrap設(shè)置為500，分別構(gòu)建禽類呼腸孤病毒的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析SL株全基因序列在遺傳進(jìn)化樹上與其他禽類呼腸孤病毒之間的差異。結(jié)果顯示，參與比對(duì)的所有禽類呼腸孤病毒的基因組序列主要分為2個(gè)大類的進(jìn)化支，即ARV主干支和MDRV、NDRV共同構(gòu)成的主干支。在所有遺傳進(jìn)化樹中，SL株的10個(gè)基因節(jié)段均位于MDRV和NDRV構(gòu)成的主干支中，除了M1和L1片段的進(jìn)化樹里面有MDRV的DH13株和SH12株外，其他所有的基因節(jié)段均與NDRV位于同分支。在SL株的所有遺傳進(jìn)化樹中，L3、M2、 S2、 S3片段均與XT18株位于同一分支，遺傳位置關(guān)系最近(圖3C，E，H，I)。S1和S4片段則始終與GX-Y7株位于同一分支，遺傳位置最近(圖3G，J)，在L1、L2、M2片段的遺傳進(jìn)化樹中，SY株、XT18株、GX-Y7株、DH13株、SH12株與L1片段位于同一大分支(圖3A，B，E)，M2片段與SY株位于另一個(gè)同分支(圖3E)，L2片段則與GX-Y7株和XT18株位于同一分支，且與XT18株的遺傳位置最近 (圖3B)。在所有的遺傳進(jìn)化樹中，只有M1片段與MDRV源的DH13株在1個(gè)單獨(dú)的分支上，兩者遺傳位置最近，且與NDRV源的SY株的遺傳位置最近(圖3D)。

2.5 對(duì)鴨胚的致病性試驗(yàn)接種后24 h內(nèi)均無(wú)鴨胚死亡。在24～120 h內(nèi)，10-4接種組5枚鴨胚均死亡，10-5接種組共死亡3枚，10-6接種組共死亡1枚，10-7接種組無(wú)死亡。根據(jù)Reed-Muench法，分離毒SL株的ELD50為10-5.32/0.2 mL。

2.6 對(duì)雛鴨的致病性試驗(yàn)SL株感染4 d后有2只雛鴨出現(xiàn)精神沉郁、趴伏、拉黃綠色稀便，6 d后死亡4只，其中1只角弓反張(圖4A)，其余6只在觀察期內(nèi)均存活，但表現(xiàn)精神萎靡，食欲減退?？梢娖浒l(fā)病率為100%，病死率為40%。剖檢病死鴨可見肝臟出血，脾臟腫大、壞死(圖4B，C)。對(duì)照組均表現(xiàn)正常。

A.感染SL株死亡鴨；B.感染鴨的肝臟出血；C.感染鴨的脾臟腫大出血。箭頭指示角弓反張

感染發(fā)病鴨肝臟、脾臟的組織病理學(xué)觀察顯示：雛鴨肝臟細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)模糊不清，出現(xiàn)肝臟細(xì)胞腫脹、空泡變性(圖5A)，血竇彌漫性出血，局部門管區(qū)有少量淋巴細(xì)胞及異嗜粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5B)；脾臟白髓嚴(yán)重萎縮、淋巴細(xì)胞壞死，紅髓輕度淤血(圖5C)，脾臟靜脈出現(xiàn)混合性血栓(圖5D)。

A．肝臟病理切片(×400)，箭頭指示肝細(xì)胞空泡變性；B.肝臟病理切片(×100)，箭頭指示淋巴細(xì)胞及異嗜粒細(xì)胞浸潤(rùn)；C.脾臟病理切片(×400)，箭頭指示白髓萎縮，淋巴細(xì)胞壞死；D.脾臟病理切片(×100)，箭頭指示脾靜脈出現(xiàn)混合性血栓

3 討論

ARV自1954年在患有慢性呼吸道疾病的雛雞中被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，世界多個(gè)國(guó)家如美國(guó)、意大利、新西蘭、巴西、阿根廷等都有發(fā)生，呈世界性分布[6]。然而近年來(lái)，許多國(guó)家又報(bào)道了具有不同致病特點(diǎn)的ARV變異株，最為突出就是感染鴨的新型呼腸孤病毒，2011年前后該病在我國(guó)大面積暴發(fā)，其最為典型的特征是引起鴨脾臟的出血、壞死，俗稱“脾壞死病”，病死率35%～40%[7]，與以往ARV、MDRV所引起的癥狀有較大差異，嚴(yán)重威脅著家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本試驗(yàn)中四川隆昌地區(qū)發(fā)病鴨的臨床癥狀與以往報(bào)道的新型呼腸孤病毒感染病例非常相似，鑒于川渝地區(qū)是我國(guó)水禽養(yǎng)殖較為密集的地區(qū)，疾病發(fā)生造成的損失較大，因此本試驗(yàn)對(duì)該地區(qū)典型病例進(jìn)行了病毒的分離、鑒定及致病性研究。

鴨胚傳代是經(jīng)典的毒株分離手段之一，通過(guò)連續(xù)傳代讓病毒逐漸適應(yīng)鴨胚產(chǎn)生規(guī)律性死亡，從而達(dá)到分離病毒的目的。試驗(yàn)采用此方法成功分離到毒株，經(jīng)鑒定證實(shí)是新型呼腸孤病毒。通過(guò)對(duì)鴨胚和雛鴨的致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該毒株的毒力較強(qiáng)，對(duì)鴨胚的ELD50為10-5.32/0.2 mL，與陳宗艷等[8]報(bào)道的TH11毒株相比，兩者毒力相當(dāng)。雛鴨的致病性試驗(yàn)?zāi)軌驈?fù)制出典型的臨床癥狀，用2倍ELD50劑量攻毒能導(dǎo)致40%的病死率，提示該毒株應(yīng)屬于強(qiáng)毒株。雛鴨感染后肝臟、脾臟的組織病理學(xué)變化也充分驗(yàn)證了這一點(diǎn)，其中肝臟細(xì)胞表現(xiàn)為腫脹、空泡變性，脾臟白髓嚴(yán)重萎縮、淋巴細(xì)胞壞死，其病理變化與之前報(bào)道[9]一致，符合強(qiáng)毒的病理特征。目前已將該毒株提交武漢大學(xué)保藏中心保藏，毒種保藏號(hào)CCTCC(NO.V201970)，以期為后續(xù)的生物制品開發(fā)提供前期基礎(chǔ)。

SL株全基因組測(cè)序顯示該病毒與ARV、NDRV基因組結(jié)構(gòu)相似，均由10個(gè)片段組成，在每個(gè)片段的起始端和末端都具有禽正呼腸孤病毒特有的5′-GCUUUUU…UCAUC-3′保守序列。10個(gè)基因組片段分別編碼λA(L1)、λB(L2)、λC(L3)、μA(M1)、μB(M2)、μC(M3)、σA(S2)、σB(S3)、σNS(S4)、σC、P10、P17(S1)，根據(jù)SL株S1編碼3個(gè)蛋白，與MDRV 僅編碼σC和P10 2個(gè)蛋白不同，說(shuō)明SL株是區(qū)別于以往MDRV的1種新型呼腸孤病毒。

對(duì)SL株的10個(gè)基因組片段進(jìn)行同源性分析顯示，該毒株與NDRV的同源性最高(87.02%～99.48%)，親緣關(guān)系最近，而與ARV的同源性最低(91.15%～70.04%)，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，SL株與MDRV和NDRV構(gòu)成一個(gè)主干支，而ARV另為一個(gè)獨(dú)立的干支。在MDRV和NDRV構(gòu)成的主干支里，SL株與GX-Y7和XT18兩個(gè)NDRV毒株具有較近的親緣關(guān)系，進(jìn)一步說(shuō)明SL株為一新型呼腸孤病毒。同時(shí)發(fā)現(xiàn)SL株中M1片段和L1片段與SH12和DH13兩個(gè)MDRV毒株也具有較高的進(jìn)化地位，推測(cè)SL株或許存在MDRV和NDRV基因重組現(xiàn)象，這在禽源呼腸孤病毒中并不少見，其原因應(yīng)與RNA 聚合酶缺乏矯正功能，因而分節(jié)段的RNA 病毒容易發(fā)生基因重組和抗原變異，與王劭等[10]得出的結(jié)論一致。

綜上，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)臨床樣本的分離鑒定和SL毒株全基因組的測(cè)定以及致病性研究，確定新型呼腸孤病毒為致病原，該病毒與以往MDRV、ARV有較大差異。本試驗(yàn)結(jié)果可為鴨呼腸孤病毒病的防控及其特異性生物制品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。