徐傳訓(xùn)

（聊城大學(xué)，山東 聊城 252000）

木霉菌屬于真菌門，半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，木霉屬[1]，它主要存在于土壤中，是土壤中重要的微生物群落[2]。對(duì)木霉菌株進(jìn)行改良、選育不但能使其在農(nóng)藥、肥料等不利條件下更好地生存，而且可提高木霉菌株的生防能力，也是目前的研究熱點(diǎn)之一[3]。木霉菌在土壤的定殖過程中會(huì)受到很多因素的影響，比如土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、土壤微生物和培養(yǎng)天數(shù)等，其中土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)天數(shù)是限制木霉菌定殖的主要因素[4-7]。針對(duì)此問題，根據(jù)月季土壤的理化性質(zhì)下對(duì)兩種木霉菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響，篩選出生防效力及定殖能力較高的菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)

供試菌種為長(zhǎng)枝木霉（T.longissima）SMF2和哈茨木霉（T.harzianum）T39。采用PDA培養(yǎng)，在基于25±1 ℃的條件培養(yǎng)。

1.2 培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定

培養(yǎng)液為PD培養(yǎng)液，時(shí)間處理以3天為起始，每2天為一個(gè)周期，培養(yǎng)到第15天，培養(yǎng)天數(shù)分別是3、5、7、9、11、13、15。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：新鮮的馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然狀態(tài)進(jìn)行配制。

固體培養(yǎng)基：測(cè)定土樣0.3 g、蒸餾水30 mL、瓊脂0.6 g進(jìn)行配制。

液體培養(yǎng)基：蒸餾水100 mL、土樣1 g進(jìn)行配制。

PDA培養(yǎng)基接上木霉菌的菌餅后，放在恒溫培養(yǎng)箱中在25±1 ℃并且要求黑暗條件和光照條件各12 h的條件下培養(yǎng)3天備用。

1.4 儀器

JM-A10002電子天平、PHS-3C型pH計(jì)、OLYMPUS生物顯微鏡BX51、MSL-3750高溫蒸汽滅菌鍋、BS-2E震蕩培養(yǎng)箱、SPX-50B全自動(dòng)智能型生化培養(yǎng)箱、RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、B-220恒溫水浴鍋、SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái)、CMAX PLUS酶標(biāo)儀、火焰分光光度計(jì)。

1.5 供試藥品

0.136 mol/L硫酸重鉻酸鉀（K2Cr2O7-H2SO4）的標(biāo)準(zhǔn)溶液、0.2 mol/L硫酸亞鐵（FeSO4）標(biāo)準(zhǔn)溶液、鄰啡羅啉（鄰二氮菲）指示劑、1.8 mol/L氫氧化鈉（NaOH）溶液、1.2 mol/L氫氧化鈉（NaOH）溶液、2%硼酸溶液、0.01 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、定氮混合指示劑、凡士林、粉末硫酸亞鐵（FeSO4）、濃硫酸、飽和重鉻酸鉀（K2Cr2O7）溶液、40%氫氧化鈉（NaOH）溶液、2%硼酸溶液、定氮混合指示劑、0.02mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、活性炭、硫酸鉬銻抗混合顯色劑、H中性1.0 mol/L醋酸銨（NH4OAc）溶液、K標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.6 試驗(yàn)方法

1.6.1 菌種活化

將保存的哈茨木霉T39和長(zhǎng)枝木霉SMF2菌株接種到PDA平板，活化5~9天，備用。

1.6.2 菌絲及孢子變化

將已活化的菌種按直徑為5 mm的小菌塊分別接種于不同土壤培養(yǎng)基中，然后置于28 ℃培養(yǎng)箱里避光培養(yǎng)。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每12 h觀察并測(cè)量菌絲生長(zhǎng)情況。菌絲生長(zhǎng)的速度（mm/d）=（菌落的直徑-菌種塊直徑）/菌落生長(zhǎng)的時(shí)間，結(jié)果取平均值。

將菌種制成孢子懸浮液，在液體培養(yǎng)基接菌后的第3天、第5天、第7天、第9天、第11天分別把接菌的土樣用濾紙過濾并放入烘箱內(nèi)烘干，同時(shí)對(duì)濾液中的孢子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并選出木霉菌繁殖最快的天數(shù)。

1.6.3 土壤樣品的采集

分別在月季園用“S”形取樣法，采集0~20 cm耕層土壤樣品，風(fēng)干、研磨過篩，用于供試地土壤常規(guī)養(yǎng)分分析。

1.6.4 土壤養(yǎng)分含量測(cè)定

堿解氮的測(cè)定采用堿解擴(kuò)散法，速效鉀的測(cè)定采用醋酸銨-火焰光度計(jì)法，速效磷的測(cè)定采用碳酸氫銨法，有機(jī)質(zhì)的測(cè)定采用重鉻酸鉀法。

1.6.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用Microsoft Excel 2020軟件處理數(shù)據(jù)，采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)9.01中的Duncan法進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤對(duì)木霉菌生長(zhǎng)速率的影響

由表1可知，月季土壤對(duì)哈茨木霉和長(zhǎng)枝木霉菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

表1 生長(zhǎng)速率

2.2 土壤對(duì)木霉菌產(chǎn)孢量的影響

木霉菌的孢子量是一直在上升的，哈茨木霉的孢子量大于長(zhǎng)枝木霉的孢子量。哈茨木霉主要增加孢子量，長(zhǎng)枝木霉主要增加菌絲量。

在培養(yǎng)4天的條件下，哈茨木霉T39的產(chǎn)孢量高于長(zhǎng)枝木霉SMF2。木霉菌在土壤中第7天的孢子增長(zhǎng)率最高，其余天數(shù)的孢子增長(zhǎng)率相差不大。這就說明木霉菌在土壤中第7天達(dá)到繁殖的高峰，此時(shí)木霉菌活性最高，防治效果最好，此時(shí)也是木霉菌最佳的定殖時(shí)間。此外，兩種木霉菌相比而言，哈茨木霉T39的產(chǎn)孢量和孢子增長(zhǎng)率均高于長(zhǎng)枝木霉SMF2。

2.3 木霉菌培養(yǎng)過程中的形態(tài)特征

根據(jù)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)，月季土壤培養(yǎng)基的木霉菌絲生長(zhǎng)最快、產(chǎn)孢最多。長(zhǎng)枝木霉在PD培養(yǎng)基中以菌絲生長(zhǎng)為主，且含月季土的PD培養(yǎng)基中的菌絲量大于不含土的PD培養(yǎng)基，因此，月季土壤有利于長(zhǎng)枝木霉的生長(zhǎng)。

2.4 土壤養(yǎng)分含量與木霉菌生長(zhǎng)繁殖的關(guān)系

有機(jī)質(zhì)含量隨著木霉菌的生長(zhǎng)呈現(xiàn)下降與升高的趨勢(shì)。表明不僅植物的生長(zhǎng)需要有機(jī)質(zhì)，木霉菌的生長(zhǎng)同樣需要，所以培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)有機(jī)質(zhì)含量下降的情況。隨著時(shí)間的增加，木霉菌的數(shù)量在不斷增加。木霉菌本身就是有機(jī)質(zhì)，木霉菌繁殖得越快越多，有機(jī)質(zhì)的含量就會(huì)增多。

由于木霉菌自身的活動(dòng)增加了堿解氮的含量，導(dǎo)致堿解氮含量上升，堿解氮含量越高，木霉菌生長(zhǎng)速度越快，消耗堿解氮速度越快，有機(jī)質(zhì)的含量就會(huì)增加。

速效磷是土壤中可以被直接被利用的磷元素。長(zhǎng)枝木霉中的速效磷含量隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。但是，哈茨木霉中的速效磷隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升高，后平穩(wěn)的狀態(tài)。

速效鉀是土壤中可以被植物與微生物直接利用的鉀元素，與微生物生長(zhǎng)息息相關(guān)。隨著速效鉀含量的減少，木霉菌在生長(zhǎng)。速效鉀含量高，使得木霉菌生長(zhǎng)速度快，消耗速效鉀速度快。所以速效鉀有利于木霉菌的定殖。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

3.1.1 長(zhǎng)枝木霉SMF2生長(zhǎng)繁殖最快

哈茨木霉T39和長(zhǎng)枝木霉SMF2在兩種土壤樣本中的菌絲生長(zhǎng)狀況和產(chǎn)孢量差距很大。木霉的菌絲生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量在月季土壤明顯高于CK，月季花卉使用的有機(jī)肥較多，在加上月季的根系分泌物的作用，使木霉菌生長(zhǎng)繁殖效果最好。

結(jié)合測(cè)定土壤樣本的指標(biāo)來看，木霉菌的菌絲生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量與土壤氮磷鉀以及有機(jī)質(zhì)的含量密切相關(guān)。其次，除了培養(yǎng)72 h外，哈茨木霉T39與長(zhǎng)枝木霉SMF2相比，長(zhǎng)枝木霉SMF2的菌絲生長(zhǎng)速率均要稍高于哈茨木霉T39。

3.1.2月季土壤樣本中不同營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)木霉菌定殖的作用

不同的土壤營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)木霉菌定殖的影響不同。土壤樣本中土壤的有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效鉀的含量高，綜合起來看這就是兩種木霉菌在月季土壤中菌絲生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量高的原因。

3.1.3 木霉菌定殖能力與土壤處理有密切的關(guān)系

土壤處理對(duì)木霉菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響不同。氮磷鉀含量的變化對(duì)木霉菌絲生長(zhǎng)略有影響但對(duì)產(chǎn)孢的影響不明顯。

堿解氮是土壤中可以被植物與微生物直接利用的氮元素，所以培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)堿解氮含量下降的情況。但是，隨著堿解氮含量的減少，木霉菌在生長(zhǎng)。隨著時(shí)間的增加，木霉菌的數(shù)量在不斷增加。由于木霉菌自身的活動(dòng)增加了堿解氮的含量，使得堿解氮含量上升，堿解氮含量越高，木霉菌生長(zhǎng)速度越快，消耗堿解氮速度越快，所以在木霉菌定殖過程中，增施氮肥，有利于木霉菌的定殖。

3.1.4 處理天數(shù)對(duì)木霉菌定殖能力的影響

真菌的生長(zhǎng)繁殖也需要充足的有機(jī)質(zhì)。本試驗(yàn)中木霉菌分別在第3天、5天、7天、9天、11天處理了土壤樣本，均得出了隨著處理天數(shù)的增加，土壤中的有機(jī)質(zhì)逐漸減少的結(jié)論。此外，對(duì)于不同木霉菌對(duì)有機(jī)質(zhì)的消耗而言，在月季土壤中長(zhǎng)枝木霉SMF2高于哈茨木霉T39，說明在木霉菌定殖的過程中需要不斷消耗土壤中的有機(jī)質(zhì)，有機(jī)質(zhì)的含量多少直接影響了木霉菌的定殖能力。

3.2 討論

木霉菌在土壤環(huán)境的改良、土壤肥力的提高方面越來越受到國(guó)內(nèi)外專家的重視，木霉菌尤其在影響土壤理化性質(zhì)方面表現(xiàn)突出。孫冬梅等[8]研究發(fā)現(xiàn)黃綠木霉處理土壤后，土壤的養(yǎng)分含量相比未處理的時(shí)候有所增加，改善了土壤理化性質(zhì)，增加了根際微生物的數(shù)量。在施用木霉菌制劑的土壤中，土壤的全氮含量、碳氮比均比用化肥處理的土壤中高，且木霉菌的濃度越高處理的效果越明顯。

土壤的肥力由理化性質(zhì)、土壤的酶活性、微生物的數(shù)量等因素共同決定，研究表明，木霉菌處理后的土壤里細(xì)菌和放線菌的數(shù)量也有所增加，某些放線菌具有固氮的作用，從而使土壤中的氮素不斷增加，有利于滿足作物對(duì)氮素的需求[9]。施肥是農(nóng)作物生產(chǎn)中的必要措施，氮磷鉀肥是作物生長(zhǎng)中不可缺少的肥料，合理施肥有利于作物生長(zhǎng)，也有利于作物根際包括生防菌在內(nèi)的有益微生物生長(zhǎng)。

試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，木霉生防菌受肥料種類及其劑量的影響，酸性肥料和適當(dāng)?shù)牡租浄逝浔扔欣谀久咕z生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，并有可能有利于木霉菌的根際定殖。

3.3 展望

木霉菌因在土壤微生物防治、抗生素的科學(xué)研究以及生物酶等諸多方面的應(yīng)用有著十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值，近年來受到廣泛的社會(huì)關(guān)注。木霉菌生防制劑可以增強(qiáng)植物的抗逆性，促進(jìn)對(duì)土壤養(yǎng)分的有效吸收利用，加速對(duì)土壤中一些有害物質(zhì)的有效分解。并且木霉菌植株生長(zhǎng)的速度快，可大規(guī)模生產(chǎn)，對(duì)土壤環(huán)境也無任何污染。目前木霉菌生防制劑得到了推廣和綜合利用，木霉菌生防制劑既可以有效防止土傳病害又可以有效改善植株根際的微環(huán)境，有利于其他有益菌的生長(zhǎng)繁殖[10]。木霉菌的生防制劑與生物肥料具有投資少、產(chǎn)量高、綠色無公害三重優(yōu)點(diǎn)，是未來藥劑和肥料發(fā)展的重要方向。