李書林， 廖藝琳， 周子杰， 肖鄭偉， 蘇凌波，李俊杰， 藍(lán)青， 陳名迪， 郭徽靈， 顏來鵬， 湯發(fā)強(qiáng)

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350001； 2. 福建省立醫(yī)院骨一科，福建 福州 350001； 3. 福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350001； 4. 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350001)

骨肉瘤是目前最常見的原發(fā)性惡性骨癌，起源于惡性間充質(zhì)細(xì)胞[1]。骨肉瘤患者治療以往主要依靠手術(shù)切除，存活率僅為20%；隨著化療和放療技術(shù)的引入，患者長期存活率達(dá)65%～70%[2]。然而，由于腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，伴有肺轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者5年存活率僅有20%左右[3-4]。因此，深入探究骨肉瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制對提高骨肉瘤的療效具有重要意義。

微小RNA(microRNA, miRNA)是一組內(nèi)源性非編碼的小核糖核酸，廣泛分布于真核細(xì)胞中，其與靶基因的3′-UTR結(jié)合參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，超過30%蛋白表達(dá)受miRNA調(diào)節(jié)[6]。miRNA異常表達(dá)或突變與多種癌癥相關(guān)，并可充當(dāng)腫瘤標(biāo)志物或癌基因[7-8]。miR-4306參與調(diào)控多種惡性腫瘤的生物學(xué)行為，如宮頸癌[9]、乳腺癌[10]和甲狀腺乳頭狀癌[11]等。亦有研究報(bào)道，miR-4306可通過血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子A(VEGFA)抑制ERK1/2/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制人單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞遷移[12]。目前，關(guān)于miR-4306在骨肉瘤中的作用尚不明確。因此，本研究擬探討miR-4306在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其對骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的影響和潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

DMEM購自美國Gibco公司；胎牛血清購自德國PAN Biotech公司；miR-4306模擬物(miR-4306 mimics)和模擬物陰性對照(mimics NC)購自上海市吉?jiǎng)P生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega生物公司；BCA蛋白定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液均購自北京索萊寶科技有限公司；ECL發(fā)光試劑購自美國Thermo公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、qRT-PCR試劑盒均購自美國Invitrogen公司；Transwell小室及24孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司；β-肌動(dòng)蛋白、富含AT序列特異性結(jié)合蛋白2(specail AT-rich sequence-binding protein 2, SATB2)、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)志蛋白N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)IgG一抗以及HRP標(biāo)記的IgG二抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及miR-4306相對表達(dá)水平檢測

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人成骨細(xì)胞hFOB 1.19和骨肉瘤細(xì)胞Saos-2、MNNG/HOS CI #5用含10%胎牛血清的DMEM，于37 ℃含有5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-4306相對表達(dá)水平 采用傳統(tǒng)Trizol法提取人源成骨細(xì)胞hFOB 1.19和骨肉瘤細(xì)胞Saos-2、MNNG/HOS CI #5中總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取cDNA等試劑按照試劑盒說明書配置20 μL反應(yīng)體系：cDNA 2.0 μL、qPCR SYBR?Green Master Mix 10.0 μL、滅菌蒸餾水7.0 μL和上、下游引物各0.5 μL。qRT-PCR反應(yīng)步驟：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR引物序列如下：miR-4306上游為5′-CGCGCGTGGAGAGAAAG-3′，下游為5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-5′；內(nèi)參U6上游為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。最后根據(jù)2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析。

1.3 細(xì)胞分組、轉(zhuǎn)染及相關(guān)指標(biāo)檢測

1.3.1 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞分為miR-4306 mimics組和mimics NC組。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)50%～70%時(shí)，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書將miR-4306 mimics及陰性對照稀釋至5 mmol/L，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染約6 h后更換為含10%胎牛血清的新鮮DMEM，進(jìn)一步培養(yǎng)24～48 h。用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果，具體方法同“1.2.2”，確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后將細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 取“1.3.1”轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)24 h；接種于96孔板，分別在0、24、48、72 h向每孔細(xì)胞中加入100 μL 10% CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h。用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測450 nm處各孔光密度(D)值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.3.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力 取“1.3.1”轉(zhuǎn)染細(xì)胞，胰酶消化，完全培養(yǎng)基重懸，制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)；將細(xì)胞接種于6孔板中，800個(gè)/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入含10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)基，搖勻后輕放于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每隔3 d換液一次并觀察細(xì)胞狀態(tài)，顯微鏡下觀察克隆大小；待孔中大多數(shù)單個(gè)克隆中細(xì)胞數(shù)>50時(shí)，棄上清液，PBS洗滌細(xì)胞1次；每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，4 ℃固定60 min；PBS洗滌細(xì)胞1次。通過計(jì)數(shù)得出克隆形成率，對細(xì)胞的增殖能力作定量分析。

1.3.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 取“1.3.1”轉(zhuǎn)染細(xì)胞，消化后離心棄培養(yǎng)液，用PBS洗1～2遍，用無血清培養(yǎng)基重懸；調(diào)整各組細(xì)胞數(shù)量至1×105個(gè)/mL，取細(xì)胞懸液100 μL加入Transwell小室上表面，下室加入600 μL含20% 胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h；用棉簽擦去上室細(xì)胞，下室細(xì)胞用PBS沖洗；4%多聚甲醛固定30 min；用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min。最終，每組在顯微鏡下隨機(jī)選取視野拍照，觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲 將Martrigel基質(zhì)膠置于4 ℃至完全融化，用無血清培養(yǎng)基以1 ∶8于冰上稀釋Martrigel標(biāo)準(zhǔn)膠，取50 μL 稀釋的Martrigel膠包被Transwell上室，4 ℃風(fēng)干，37 ℃使其徹底凝固。

實(shí)驗(yàn)組：對實(shí)驗(yàn)組疑似乳腺癌患者實(shí)施MRI檢查，患者在這段過程中保持仰臥體位，對冠狀位、矢狀位和橫斷位先進(jìn)行常規(guī)掃描，再進(jìn)行增強(qiáng)掃描，將對比劑注入患者肘靜脈。將掃描參數(shù)設(shè)置為層厚1.2毫米，掃描6次，每次間隔20秒，掃描時(shí)長60秒，在掃描過程中發(fā)現(xiàn)病灶要通過患者靜脈注射每千克體重0.1mmol的對比劑，掃描時(shí)長為6min20s。

取“1.3.1”轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每組1×105個(gè)/mL細(xì)胞(100 μL)接種于Transwell上室，再將Transwell小室放入含10% 胎牛血清培養(yǎng)基的24孔板中培養(yǎng)24～48 h；取出Transwell小室，用棉簽擦拭小室內(nèi)部細(xì)胞及殘余的 Matrigel膠，PBS清洗3次；4%多聚甲醛固定30 min；0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min；鏡檢計(jì)數(shù)并分析作圖。

1.3.6 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測細(xì)胞內(nèi)SATB2及EMT相關(guān)蛋白表達(dá) 取“1.3.1”轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入含PMSF的蛋白裂解液，冰上靜置20 min，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min；取上清液400 μL于EP管，按BCA試劑盒說明書操作，測定蛋白濃度；按1 ∶5比例加入5×上樣緩沖液，金屬浴中95 ℃孵育10 min。每孔上樣30 μg蛋白，行10% SDS-PAGE，80 V 30 min，120 V 60 min；恒壓100 V 90 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗SATB2、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白和VEGF(均1 ∶1 000稀釋)以及內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(1 ∶5 000稀釋)，搖床4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，10 min/次；加入二抗(1 ∶2 000稀釋)，室溫孵育1.5 h；TBST洗膜3次，10 min/次；ECL顯色。用Image J分析條帶灰度值，確定樣品中目的蛋白表達(dá)相對含量。

1.4 miR-4306靶基因預(yù)測和鑒定

經(jīng)在線靶基因預(yù)測網(wǎng)站Targetscan、Starbase發(fā)現(xiàn) miR-4306與SATB2的3′-UTR端有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定靶向關(guān)系。分別將SATB2 WT和MUT熒光素酶報(bào)告載體同miR-4306 mimics、mimics NC共轉(zhuǎn)染到骨肉瘤細(xì)胞中，具體分組如下：Luc-SATB2-WT+miR-4306 mimics組、Luc-SATB2-WT+miR-4306 mimics NC組、Luc-SATB2-MUT+miR-4306 mimics組、Luc-SATB2-MUT+miR-4306 mimics NC組。24 h后收集細(xì)胞，每孔加入200 μL裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃裂解20 min，將裂解后的細(xì)胞樣品保存至-80 ℃；每組取細(xì)胞裂解液70 μL加至96孔板，每孔加熒光素酶檢測試劑100 μL，上機(jī)檢測螢火蟲熒光素酶活性；取100 μL海腎熒光素酶檢測試劑(檢測底物 ∶緩沖液=1 ∶100)加入每孔，上機(jī)檢測海腎熒光素酶活性。用蛋白免疫印跡法檢測各組細(xì)胞中SATB2蛋白表達(dá)水平，方法同“1.3.6”。

1.5 細(xì)胞分組與共轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞分組如下：miR-4306 mimics NC+LV-NC組、miR-4306 mimics NC+LV-SATB2組、miR-4306 mimics+LV-NC組和miR-4306 mimics+LV-SATB2組；構(gòu)建SATB2過表達(dá)載體(LV-SATB2)及空載組(LV-NC)，將miR-4306 和SATB2共轉(zhuǎn)染至骨肉瘤細(xì)胞株中。隨后通過CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移及侵襲，蛋白免疫印跡法檢測各組細(xì)胞中SATB2蛋白表達(dá)水平和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平，具體實(shí)驗(yàn)方法同前。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-4306在骨肉瘤細(xì)胞系中表達(dá)

結(jié)果顯示，與人成骨細(xì)胞hFOB 1.19相比，人骨肉瘤Saos-2，MNNG/HOS CI #5細(xì)胞中miR-4306表達(dá)水平明顯降低(P均<0.01)，見圖1。

*：P<0.01，與人成骨細(xì)胞hFOB 1.19相比

2.2 miR-4306過表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMT

如圖2所示，在骨肉瘤Saos-2和MNNG/HOS CI #5細(xì)胞中，miR-4306 mimics組中miR-4306表達(dá)水平顯著高于mimics NC組(t=-30.02，-108.05，P均<0.01)；與mimics NC組相比，miR-4306 mimics組24、48、72 hD值及克隆形成率均顯著降低(P<0.05或<0.01)，細(xì)胞遷移及侵襲能力均明顯降低(P<0.05或<0.01)。此外，與mimics NC組相比，miR-4306 mimics組中N-鈣黏蛋白、VEGF蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P均<0.01)，E-鈣黏蛋白表達(dá)水平明顯升高(P均<0.01)。由此表明，miR-4306 過表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMT。

2.3 SATB2是miR-4306的直接靶標(biāo)

通過在線靶基因預(yù)測網(wǎng)站Starbase, Targetscan發(fā)現(xiàn)，miR-4306與SATB2存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)；雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Luc-SATB2-WT+miR-4306 mimics NC組比，Luc-SATB2-WT+miR-4306 mimics組熒光素酶活性明顯降低(P<0.01)，而在Luc-SATB2-MUT的共轉(zhuǎn)染組中兩者熒光素酶活性未見明顯差異(圖3B)。此外，骨肉瘤細(xì)胞Saos-2和MNNG/HOS CI #5中SATB2 mRNA表達(dá)水平明顯高于人成骨細(xì)胞hFOB 1.19(t=-7.76，-5.27，P均<0.01，圖3C)；與mimics NC組相比，miR-4306 mimics組SATB2蛋白表達(dá)水平明顯降低(t=12.76，t=13.56，P均<0.01，圖3D)。由此表明，SATB2是miR-4306的下游直接靶標(biāo)，上調(diào)miR-4306可抑制骨肉瘤細(xì)胞中SATB2蛋白表達(dá)。

2.4 miR-4306通過下調(diào)SATB2表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT

結(jié)果顯示，在Saos-2和MNNG/HOS CI #5細(xì)胞中，與miR-4306 mimics NC+LV-NC組相比，miR-4306 mimics NC+LV-SATB2組D值及克隆形成率均顯著升高(P<0.05或<0.01)，細(xì)胞遷移及侵襲能力亦明顯增強(qiáng)(P<0.05或<0.01)，N-鈣黏蛋白、VEGF蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05或<0.01)，E-鈣黏蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05或<0.01)；與miR-4306 mimics+LV-NC組相比，miR-4306 mimics+LV-SATB2組D值及克隆形成率均顯著升高(P<0.01或<0.05)，細(xì)胞遷移及侵襲能力亦明顯增強(qiáng)(P<0.05或<0.01)，N-鈣黏蛋白和VEGF蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P均<0.01)，E-鈣黏蛋白表達(dá)水平明顯降低(P均<0.01)。見圖4。由此可見，LV-SATB2一定程度上可逆轉(zhuǎn)miR-4306對骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMT的影響。

3 討論

研究表明，致癌基因的異常激活和抑癌基因由于體細(xì)胞突變和表觀遺傳的失活在骨肉瘤中起著關(guān)鍵的致病作用[13]。miR-4306作為一個(gè)腫瘤調(diào)控因子，其表達(dá)水平的高低與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為相關(guān)。Zhao等[10]在對三陰性乳腺癌的研究中證實(shí)，miR-4306可發(fā)揮類似抑癌基因的作用，從而影響三陰性乳腺癌細(xì)胞的惡性生長與侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-4306在多種骨肉瘤細(xì)胞株中的表達(dá)均明顯下調(diào)，這與前期的miR-4306與腫瘤相關(guān)研究一致[9-10]。

EMT是上皮特征逐漸消失并逐漸表現(xiàn)出間質(zhì)特征的過程，其在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)以及各種腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性中均發(fā)揮重要作用[14]。研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞EMT過程中伴隨著多種標(biāo)志性蛋白表達(dá)改變，如E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和VEGF蛋白等[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-4306 mimics后，骨肉瘤細(xì)胞中E-鈣黏蛋白表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)N-鈣黏蛋白和VEGF蛋白表達(dá)水平明顯下降，提示miR-4306抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和EMT。

A：qRT-PCR檢測骨肉瘤細(xì)胞中miR-4306相對表達(dá)量；B：CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力；C：克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖；D：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移；E：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲；F：蛋白免疫印跡法檢測信號(hào)通路蛋白表達(dá)；**：P<0.01，*：P<0.05，與mimics NC組相比；#：P<0.05，##：P<0.01，與同時(shí)間點(diǎn)mimics NC組相比

A：預(yù)測miR-4306與SATB2存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)；B：雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-4306與SATB2的靶向結(jié)合位點(diǎn)；C：qRT-PCR檢測人成骨細(xì)胞hFOB 1.19以及骨肉瘤細(xì)胞Saos-2，MNNG/HOS CI #5中SATB2 mRNA相對表達(dá)水平；D：蛋白質(zhì)免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染后骨肉瘤細(xì)胞中SATB2蛋白相對表達(dá)水平；**：P<0.01，與mimics NC組相比；##：P<0.01，與人成骨細(xì)胞hFOB 1.19相比

此外，本研究采用Starbase、Targetscan等生物靶基因預(yù)測網(wǎng)站分析，并通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，SATB2是miR-4306的直接下游靶基因。SATB2是一種轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，其在中樞神經(jīng)發(fā)育、癌癥發(fā)展和預(yù)后以及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[17-18]。研究表明，SATB2可通過抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的EMT介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來防止EMT誘導(dǎo)，而SATB2基因敲除可促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞EMT和侵襲[19]。本研究結(jié)果顯示，SATB2在骨肉瘤細(xì)胞系中表達(dá)水平明顯上調(diào)；此外，通過轉(zhuǎn)染SATB2過表達(dá)載體上調(diào)SATB2表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，miR-4306對骨肉瘤細(xì)胞侵襲、遷移和EMT的抑制作用明顯減弱，提示miR-4306通過抑制SATB2表達(dá)參與調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。

綜上所述，miR-4306在骨肉瘤轉(zhuǎn)移以及惡性進(jìn)程中發(fā)揮類似抑癌基因的作用，其可能與抑制下游SATB2表達(dá)有關(guān)。本研究目前僅通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討miR-4306對骨肉瘤發(fā)生與發(fā)展的作用機(jī)制，尚缺乏臨床樣本及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，有待后續(xù)進(jìn)一步完善。