沈燁， 王子懿， 汪文平， 許文榮

(1. 江蘇大學(xué)附屬澳洋醫(yī)院普外科，江蘇 蘇州 215600； 2. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

常見(jiàn)消化道腫瘤包括食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等，根據(jù)2022中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)[1-2]，結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、食管癌分別位列中國(guó)癌癥發(fā)病率的第2、3、4、6位，同時(shí)在中國(guó)癌癥死亡率中分列前5位，嚴(yán)重威脅著人類健康。因此，早診斷、早干預(yù)、早治療是消化道腫瘤個(gè)體化治療的迫切需求。

目前，小細(xì)胞外囊泡(small extracellular vesicles，sEV)正成為腫瘤診療臨床轉(zhuǎn)化研究的熱點(diǎn)。直徑<200 nm且具有脂質(zhì)雙分子層的sEV主要成分中包含外泌體(exosomes)，在體液中豐度較高，內(nèi)部富集蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和各類核酸分子及代謝物，這些分子具有來(lái)源細(xì)胞的特異性，因此，分析臨床樣本中sEV的種群大小、數(shù)量、理化成分變化等，將有助于闡明其來(lái)源腫瘤細(xì)胞的表型及其生物學(xué)作用，反映腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[3-4]。此外，sEV攜載特異性分子的藥物遞送系統(tǒng)有助于解決腫瘤治療中的特異性和靶向性問(wèn)題，從而提高生物利用度、減少抗癌藥物的毒性次級(jí)效應(yīng)，表現(xiàn)出更佳的腫瘤靶向干預(yù)和增強(qiáng)藥物治療的效果[5]。

1 sEV與消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制

腫瘤來(lái)源的sEV參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲遷移、促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞特性和腫瘤微環(huán)境、影響腫瘤耐藥等消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程[6]。例如，肝癌細(xì)胞衍生的sEV可被脂肪細(xì)胞主動(dòng)內(nèi)化，誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥表型，并在小鼠異種移植模型中觀察到腫瘤sEV處理的脂肪細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，增加血管生成，并招募更多的巨噬細(xì)胞[7]。肝癌細(xì)胞分泌的sEV中miR-103通過(guò)靶向多個(gè)內(nèi)皮連接蛋白增加血管通透性，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[8]。腫瘤來(lái)源的外泌體miR-1247-3p直接靶向β-1,4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅲ，激活整合素β1-NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞活化，促進(jìn)肝癌的肺轉(zhuǎn)移[9]。

在胃癌細(xì)胞模型和小鼠腹膜腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)，胃癌患者惡性腹腔積液sEV可促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化信號(hào)通路[10]。在表達(dá)上調(diào)的胃癌患者血漿外泌體circRNA分子中，ciRS-133表達(dá)與棕色脂肪水平呈正相關(guān)，細(xì)胞來(lái)源外泌體可傳遞ciRS-133至前脂肪細(xì)胞，通過(guò)海綿miRNA-133上調(diào)PRDM16表達(dá)從而促進(jìn)棕色樣細(xì)胞分化，參與胃癌惡病質(zhì)[11]。

一項(xiàng)女性食管癌研究報(bào)道[12]，干細(xì)胞樣細(xì)胞分泌的sEV中性別依賴的lncRNA FMR1-AS1通過(guò)激活TLR7-NFκB-c-Myc信號(hào)通路來(lái)維持干細(xì)胞樣細(xì)胞動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)FMR1-AS1介導(dǎo)的食管癌細(xì)胞重編程作用。

順鉑和紫杉醇可通過(guò)激活泛素特異性蛋白酶7/異質(zhì)核核糖核蛋白A1軸促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌sEV-miR-522，抑制花生四烯酸鹽脂氧合酶15，最終導(dǎo)致胃癌產(chǎn)生獲得性化療耐藥[13]。lncRNA前列腺雄激素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本1(PART1)通過(guò)調(diào)節(jié)miR-129/Bcl-2信號(hào)通路促進(jìn)食管癌吉非替尼耐藥，并通過(guò)sEV傳播吉非替尼耐藥性[14]。

2 sEV在消化道腫瘤診斷中的應(yīng)用

目前臨床常規(guī)采用的腫瘤篩查與診斷指標(biāo)仍為血清中蛋白類分子，其特異性及敏感性均不高[15]，但蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得血液外泌體中腫瘤蛋白類標(biāo)志物的特異性和敏感性均可達(dá)到90%以上[16]。而隨著分離檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，sEV中的各種遺傳信息作為診斷標(biāo)志物越來(lái)越受到關(guān)注[17]，在生物信息學(xué)技術(shù)的輔助分析下不斷挖掘sEV中富集的miRNA、lncRNA、circRNA、tsRNA等高特異性和敏感性的標(biāo)志物(表1)，且檢測(cè)方法也不斷優(yōu)化。

表1 消化道腫瘤中sEV分子標(biāo)志物與臨床診斷相關(guān)性

2.1 蛋白類標(biāo)志物

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種消化道腫瘤sEV來(lái)源的蛋白類分子標(biāo)志物。例如，sEV中的S100A4通過(guò)激活STAT3磷酸化上調(diào)骨橋蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移，這表明S100A4可作為肝癌轉(zhuǎn)移的預(yù)后標(biāo)志物[34]。結(jié)腸癌患者血清sEV中熱休克蛋白40家族蛋白DNAJB8高表達(dá)，除與較低的總生存期和無(wú)病生存期相關(guān)以外，還可作為奧沙利鉑耐藥的標(biāo)志物[35]。

血清sEV中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican 1，GPC1)可以有效鑒別早期胰腺癌與良性胰腺疾病[35]。Li等[36]利用分層表面增強(qiáng)拉曼散射底物和快速富集策略磁珠@外泌體@SERS檢測(cè)探針構(gòu)建了一個(gè)高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)，并基于外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析選擇富亮氨酸α2糖蛋白1(leucine-rich α2-glycoprotein 1,LRG1)+外泌體(LRG1-Exos)和GPC1+外泌體(GPC1-Exos)為標(biāo)志物組合，直接定量檢測(cè)臨床樣本中的特異性外泌體，結(jié)果顯示胰腺癌的診斷效率顯著提高，曲線下面積(area under curve,AUC)為0.95。

2.2 miRNA分子標(biāo)志物

miRNA是腫瘤sEV相關(guān)研究報(bào)道中常見(jiàn)的標(biāo)志物。例如，結(jié)直腸癌患者血清sEV中miR-17-92a高表達(dá)與復(fù)發(fā)相關(guān)，miR-19a高表達(dá)則與預(yù)后差相關(guān)[25]。食管癌患者組織和血清sEV中miR-339-5p低表達(dá)，且與放療敏感性相關(guān)，故可預(yù)測(cè)局部晚期食管癌術(shù)前放療的病理反應(yīng)[19]。

越來(lái)越多的研究報(bào)道將這些特異性標(biāo)志物檢測(cè)方法與計(jì)算機(jī)功能進(jìn)行合理組合，可獲得更優(yōu)異的診斷效能。例如，一項(xiàng)胰導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)多中心研究挖掘并設(shè)計(jì)了8個(gè)sEV-miRNA的檢測(cè)Panel，可診斷PDAC各個(gè)階段，尤其是對(duì)Ⅰ和Ⅱ期PDAC的診斷效率較高(AUC達(dá)0.93)[31]。

2.3 lncRNA分子標(biāo)志物

lncRNA主要通過(guò)影響腫瘤增殖、遷移、耐藥、促進(jìn)血管生成等方式參與調(diào)控[6]，因此，消化道腫瘤sEV內(nèi)的lncRNA分子同樣具有重要的診斷應(yīng)用價(jià)值。例如，血漿sEV內(nèi)lncRNA-GC1作為胃癌早期檢測(cè)指標(biāo)具有較高的診斷效能(AUC達(dá)0.90)[37]。食管癌患者血清sEV中l(wèi)ncRNA PART1的表達(dá)水平可用于吉非替尼療效的評(píng)估指標(biāo)[14]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞sEV內(nèi)lncRNA CRNDE表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞來(lái)源的sEV轉(zhuǎn)移到胃癌細(xì)胞中，促進(jìn)PTEN泛素化，降低了順鉑敏感性，故可作為順鉑耐藥的預(yù)測(cè)標(biāo)志物[23]。

2.4 circRNA分子標(biāo)志物

近年來(lái)，circRNA分子因其穩(wěn)定的生物學(xué)特性和在體液中較高的豐度成為腫瘤標(biāo)志物的研究熱點(diǎn)。肝癌患者血清sEV中circTMEM181與抗PD-1耐藥相關(guān)，通過(guò)上調(diào)巨噬細(xì)胞中CD39的表達(dá)，進(jìn)而協(xié)同肝癌細(xì)胞中CD73激活細(xì)胞外ATP-腺苷通路，促進(jìn)免疫抑制和抗PD-1耐藥性[30]。胃癌患者組織和血清sEV內(nèi)circSHKBP1高表達(dá)與TNM晚期和低生存率相關(guān)，通過(guò)miR-582-3p/HUR/VEGF路徑抑制HSP90降解，從而促進(jìn)胃癌進(jìn)展，胃癌術(shù)后sEV內(nèi)circSHKBP1低表達(dá)，故可用于胃癌診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物[24]。

目前已有學(xué)者在開(kāi)發(fā)系統(tǒng)而全面的生物標(biāo)志物液體活檢方法用于腫瘤早期檢測(cè)，Roy等[38]構(gòu)建了血清8種circRNA生物標(biāo)志物組合，其特異性和敏感性均優(yōu)于經(jīng)典的胃癌診斷標(biāo)志物，不僅能夠早期檢測(cè)胃癌患者，而且可以與其他胃腸道腫瘤進(jìn)行鑒別。

2.5 tsRNA分子標(biāo)志物

隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的應(yīng)用，轉(zhuǎn)移RNA(transfer RNA,tRNA)衍生的小RNA(tsRNAs)被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控基因沉默、RNA穩(wěn)定性、逆轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯等過(guò)程，與細(xì)胞增殖、凋亡等相關(guān)。食管癌患者唾液sEV中特異性富集tRNA-GlyGCC-5，不僅具備診斷和預(yù)后標(biāo)志物的潛力，而且能用于評(píng)估患者從輔助治療中獲益的可能性[21]。肝癌患者血漿sEV中4種tsRNA(tRNA-ValTAC-3、tRNA-GlyTCC-5、tRNA-ValAAC-5和tRNA-GluCTC-5)水平顯著升高，可作為肝癌診斷標(biāo)志物[39]。

3 sEV在消化道腫瘤治療中的應(yīng)用

目前，天然或者工程化修飾的sEV正被廣泛用于治療難治性腫瘤，這是因?yàn)閟EV可能富集與免疫治療、靶向治療、放化療等耐藥相關(guān)的特異性分子，將其作為靶點(diǎn)則可能會(huì)增強(qiáng)療效。另一方面，sEV具有作為納米載體可介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞的特性[40]，故而對(duì)其工程化攜載特異性分子以期優(yōu)化靶向性，從而改善預(yù)后(圖1)。

圖1 sEV應(yīng)用于臨床治療常見(jiàn)策略

3.1 sEV與靶向治療策略

迄今，靶向治療策略主要有3類設(shè)計(jì)：① 采用siRNA或過(guò)表達(dá)直接靶向作用于sEV中特異性分子，阻斷腫瘤生長(zhǎng)；② 利用間充質(zhì)干細(xì)胞作為藥物遞送系統(tǒng)的生物材料，攜載特異性分子或藥物，提高靶向性，增加腫瘤內(nèi)藥物有效濃度；③ 利用腫瘤組織來(lái)源的sEV對(duì)其親本細(xì)胞具有內(nèi)在的趨向性，改變腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境刺激sEV分泌，提高親緣細(xì)胞對(duì)sEV的攝取率，并對(duì)重編程sEV進(jìn)行工程化，從而改善療效。

circRNA-SORE通過(guò)sEV轉(zhuǎn)運(yùn)在肝癌細(xì)胞中傳播索拉非尼耐藥性，Xu等[41]對(duì)不同的肝癌小鼠模型注射siRNA沉默circRNA-SORE，發(fā)現(xiàn)可以顯著抑制索拉非尼的耐藥性，為緩解晚期肝癌患者索拉非尼耐藥提供了潛在策略。

Zhou等[42]認(rèn)為胰導(dǎo)管腺癌免疫治療的關(guān)鍵在于誘導(dǎo)更多的瘤內(nèi)效應(yīng)免疫細(xì)胞及逆轉(zhuǎn)免疫抑制，故設(shè)計(jì)了一種基于外泌體的雙傳遞生物系統(tǒng)，使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞sEV負(fù)載半乳糖凝集素-9siRNA并在表面飾以?shī)W沙利鉑前藥，構(gòu)建成一個(gè)免疫原性細(xì)胞死亡觸發(fā)器。在該傳遞系統(tǒng)作用下，破壞半乳糖凝集素-9/dectin1軸，逆轉(zhuǎn)M2樣腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的腫瘤免疫抑制作用，募集細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和下調(diào)Treg細(xì)胞，誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，從而增強(qiáng)PDAC免疫治療的效果。

Xu等[43]基于無(wú)銅的點(diǎn)擊化學(xué)方法對(duì)分離的外泌體進(jìn)行熒光標(biāo)記，這不僅為點(diǎn)擊化學(xué)和sEV攝取研究提供了一種簡(jiǎn)單可靠的表面修飾方法，并可作為臨床前sEV腫瘤治療合理化設(shè)計(jì)方法的基礎(chǔ)。Gong等[44]將親水光敏劑與胃癌細(xì)胞在低pH環(huán)境下共培養(yǎng)，將所獲sEV裝載多柔比星，這種智能藥物遞送平臺(tái)不僅能提高靶向性，還能在近紅外輻射下解構(gòu)sEV，釋放化療藥物，為聯(lián)合光動(dòng)力學(xué)治療提供思路。

3.2 sEV與放化療策略

放化療作為傳統(tǒng)治療方案最大的挑戰(zhàn)是隨著腫瘤的進(jìn)展而產(chǎn)生耐藥性。近年來(lái)，在高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)sEV中富集與放化療敏感性相關(guān)的特異性分子，這為臨床增強(qiáng)放化療效果提供了新的思路。例如，食管癌患者組織和血清sEV中miR-339-5p低表達(dá)，且在食管癌細(xì)胞的放射耐藥亞群中下調(diào)，miR-339-5p通過(guò)靶向Cdc25A來(lái)介導(dǎo)放射敏感性，故可通過(guò)干預(yù)sEV中miR-339-5p水平提高放療效果[19]。結(jié)腸癌患者奧沙利鉑耐藥可能的作用機(jī)制在于sEV介導(dǎo)的DNAJB8抑制TP53的泛素化降解，導(dǎo)致MDR1上調(diào)，因此DNAJB8可作為干預(yù)奧沙利鉑耐藥的治療靶點(diǎn)[34]。

3.3 sEV與其他治療策略

除了靶向治療和放化療以外，腫瘤疫苗的研究也有進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)樹(shù)突細(xì)胞來(lái)源的外泌體(dendritic cell-derived exosomes,DEXs)形成了一種新的腫瘤免疫治療疫苗，富含甲胎蛋白的DEXs可以觸發(fā)強(qiáng)大的抗原特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，重塑肝癌小鼠的腫瘤微環(huán)境，從而為肝癌免疫治療提供了一種無(wú)細(xì)胞疫苗選擇[45]。

4 展望

盡管sEV的分離和檢測(cè)技術(shù)尚存在差異化，但基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)與生物信息學(xué)技術(shù)的應(yīng)用使得sEV中標(biāo)志物具備了早期診斷標(biāo)志物的潛力，更多研究則為臨床建立特異性檢測(cè)Panel提供了依據(jù)。此外，新的檢測(cè)技術(shù)也在不斷開(kāi)發(fā)，如ExoSD芯片技術(shù)對(duì)胃癌早期患者血清樣本的檢出率可達(dá)70%[46]。

腫瘤異質(zhì)性是臨床腫瘤診療中的挑戰(zhàn)，sEV也可能通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)腫瘤異質(zhì)性的發(fā)生[40]。因此，在選擇外泌體作為腫瘤診斷與預(yù)后監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)志物時(shí)應(yīng)考慮到腫瘤異質(zhì)性的發(fā)生機(jī)制。

天然或者工程化修飾的sEV被視為一種新的腫瘤靶向治療理想的工具，體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果在藥物遞送系統(tǒng)設(shè)計(jì)和優(yōu)化放化療方案方面均展示了良好的應(yīng)用前景，但在治療時(shí)應(yīng)考慮sEV的給藥劑量，因?yàn)椴煌膭┝靠赡軙?huì)引起不同的生物效應(yīng)，此外，機(jī)體對(duì)sEV的清除作用及其異質(zhì)性增加了確定精確應(yīng)用劑量的難度[17]。

總之，sEV作為機(jī)體自然分泌的穩(wěn)定存在的成分，富含特異性遺傳信息，可用于消化道腫瘤的篩查、診斷、預(yù)后和療效評(píng)估，在經(jīng)過(guò)特定修飾后可提高治療的靶向性，增強(qiáng)藥物的有效性，在深入研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)盡快推動(dòng)其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究。