張珊， 毛朝明， 董利陽(yáng)， 劉佳夢(mèng)， 鄭婷婷， 高學(xué)榮， 徐小衛(wèi)， 羅鑫凱， 汪雪峰

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)是一類以橋本甲狀腺炎為代表的內(nèi)分泌系統(tǒng)常見病，是臨床上最常見的自身免疫性疾病(約占30%)[1-2]。全球AIT的患病率為1%～2%，我國(guó)AIT患病率超過(guò)10%，并呈現(xiàn)逐年上升態(tài)勢(shì)[3]。AIT的主要病理特征是甲狀腺組織內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(以Th1為主)、甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)破壞和甲狀腺自身抗體如甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)產(chǎn)生[4-5]。AIT是導(dǎo)致甲狀腺功能減退的主要疾病，臨床目前仍無(wú)有效干預(yù)手段[6]。

大量研究證實(shí)，蠕蟲感染對(duì)自身免疫性疾病存在抑制作用，據(jù)此而衍生的蟲源產(chǎn)品成為當(dāng)前治療自身免疫性疾病的候選藥庫(kù)[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲源多肽SJMHE1可顯著改善小鼠急慢性結(jié)腸炎和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎[8-9]，展現(xiàn)出潛在的自身免疫性疾病的治療功效。本研究旨在探究SJMHE1對(duì)AIT小鼠的作用并初步揭示其作用機(jī)制，為AIT的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)雌性C57BL/6小鼠25只，6～8周齡，體重(18±2)g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。所有動(dòng)物在12/12 h光暗循環(huán)和40%～60%相對(duì)濕度環(huán)境下飼養(yǎng)，并在實(shí)驗(yàn)前對(duì)環(huán)境條件進(jìn)行3～4 d的適應(yīng)。本研究依照江蘇大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)指南協(xié)議進(jìn)行。

1.2 主要試劑

豬甲狀腺球蛋白(porcine thyroglobulin,pTg)，弗氏完全佐劑(complete Freund′s adjuvant,CFA)以及弗氏不完全佐劑(incomplete Freund′s adjuvant,IFA)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；日本血吸蟲源多肽SJMHE1由Top-peptide(中國(guó)上海)合成和純化；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Genecopoeia公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；ELISA試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建立小鼠AIT模型 將15只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、AIT組、AIT+SJMHE1組，每組5只。為誘導(dǎo)小鼠AIT，將100 μg pTg乳化于等量的CFA中，并于第0天皮下注射于小鼠體內(nèi)(對(duì)照組除外)。初次免疫2周后，給予該批小鼠相同劑量的pTg，并以1 ∶1的比例乳化于IFA中。為誘導(dǎo)AIT，小鼠全程用500 mg/L高碘水喂養(yǎng)。在造模前第7天，造模0、14 d給AIT-SJMHE1組小鼠皮下注射10 μg SJMHE1(與IFA制成100 μL乳化劑)。于第28天安樂(lè)死所有小鼠，采集血樣和甲狀腺組織樣本，用于后續(xù)檢測(cè)。

1.3.2 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察小鼠甲狀腺組織病理變化 每只小鼠使用5個(gè)不連續(xù)的冠狀切片來(lái)觀察甲狀腺組織病理改變。安樂(lè)死小鼠后，沿頸部正中剪開皮膚，將肌肉分離以顯露甲狀腺。用眼科剪刀摘除腺體，并用4%甲醛固定，石蠟包埋，制備4 μm厚的切片，隨后進(jìn)行HE染色。甲狀腺炎癥評(píng)分基于甲狀腺浸潤(rùn)的百分比，0分：沒(méi)有浸潤(rùn)；1分：1個(gè)或2個(gè)卵泡周圍有炎性細(xì)胞的積聚；2分：存在達(dá)到卵泡大小的1個(gè)或2個(gè)炎性細(xì)胞灶；3分：10%～40%的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；4分：>40%的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.3.3 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)小鼠血清TgAb 將收集的小鼠血樣室溫放置30 min，待血樣凝集后以1 000×g離心10 min以去除沉淀物，即刻檢測(cè)，或者分裝于-20 ℃以下凍存。采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀(Maglumi 4000 Plus)檢測(cè)小鼠血清中TgAb的含量。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠甲狀腺和脾臟中IFN-γ和IL-10mRNA表達(dá) 用RNAiso Plus(TaKaRa公司)提取甲狀腺組織和脾臟RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄1 μg的總RNA得到cDNA。按照制造商的說(shuō)明，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。引物由美國(guó)Genecopoeia公司設(shè)計(jì)合成。引物序列分別如下：β-肌動(dòng)蛋白上游引物為5′-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游引物為5′-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3′；IFN-γ上游引物為5′-CGGGACACAATGAAGCCTA-3′，下游引物為5′-CTTGCTGATTATGCCATT-3′；IL-10上游引物為5′-GACCAG-CTGAAGTGACTA-3′，下游引物為5′-GATAAGGCTCAACCGTTA-3′。PCR反應(yīng)體系組成如下：TB Green Premix ExTaqⅡ 10 μL、上下游引物各0.8 μL、DNA模板2 μL、滅菌水6.4 μL；兩步法PCR擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃退火5 s，60 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析。

1.3.5 ELISA檢測(cè)小鼠血清中IFN-γ和IL-10的含量 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，采用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-10的含量。檢測(cè)樣本避免反復(fù)凍融，在檢測(cè)前將樣本緩慢地恢復(fù)至室溫，輕柔地混勻。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FITC-SJMHE1在小鼠甲狀腺組織及脾臟的定位情況 另外選取10只未經(jīng)過(guò)任何處理的雌性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。將熒光標(biāo)記的多肽FITC-SJMHE1于皮下注射入實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)，對(duì)照組小鼠注射等量PBS。3 d后安樂(lè)死小鼠，并收集小鼠甲狀腺和脾臟于冰上研磨；吸取研磨液至離心管，1 500 r/min離心5 min；棄上清液，加紅細(xì)胞裂解液2 mL，混勻，靜置2 min；離心去上清液，并用1 mL緩沖液重懸；用牛鮑計(jì)數(shù)板于鏡下計(jì)數(shù)，吸取105個(gè)細(xì)胞至含300 μL緩沖液的流式管中，用100 μL多聚甲醛固定后，用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)FITC-SJMHE1在甲狀腺和脾臟中的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SJMHE1對(duì)AIT小鼠甲狀腺組織學(xué)及血清TgAb水平的影響

與對(duì)照組相比，AIT小鼠甲狀腺濾泡大小不均、結(jié)構(gòu)破壞明顯且周邊有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與AIT組相比，SJMHE1減輕了AIT小鼠甲狀腺濾泡的破壞及濾泡間淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。甲狀腺組織炎癥評(píng)分顯示3組小鼠間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.73，P<0.01)，AIT組小鼠甲狀腺組織炎癥評(píng)分較對(duì)照組顯著上升(P<0.01)，而SJMHE1的處理則顯著下調(diào)了AIT組小鼠的炎癥評(píng)分(P<0.01)?；瘜W(xué)發(fā)光結(jié)果顯示，AIT組小鼠血清TgAb水平明顯高于對(duì)照組，SJMHE1則顯著降低了AIT小鼠血清TgAb水平(P<0.01)。見圖1。

A：甲狀腺組織病理變化(HE染色,×400)；B：甲狀腺組織病理炎癥評(píng)分；C：血清TgAb水平

2.2 SJMHE1對(duì)AIT小鼠甲狀腺組織中IFN-γ和IL-10 mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)

與對(duì)照組相比，AIT組小鼠甲狀腺組織IFN-γ和IL-10mRNA的表達(dá)明顯升高(P均<0.01)；與AIT組相比，AIT+SJMHE1組IFN-γmRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而IL-10mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 SJMHE1降低AIT小鼠甲狀腺組織中

2.3 SJMHE1對(duì)AIT小鼠脾臟組織中IFN-γ和IL-10 mRNA表達(dá)量的調(diào)節(jié)

與對(duì)照組相比，AIT組小鼠脾臟中IFN-γmRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)，而IL-10mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)；與AIT組相比，SJMHE1處理顯著降低AIT小鼠脾臟中IFN-γmRNA表達(dá)，而上調(diào)IL-10mRNA表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3。

圖3 SJMHE1降低AIT小鼠脾臟中

2.4 SJMHE1對(duì)AIT小鼠血清中IFN-γ和IL-10含量的調(diào)節(jié)

與對(duì)照組相比，AIT組小鼠血清中IFN-γ和IL-10含量均顯著升高(P均<0.01)。與AIT組相比，SJMHE1干預(yù)后小鼠血清中IFN-γ含量顯著下降(P<0.01)，而IL-10含量顯著升高(P<0.05)。見圖4。

圖4 SJMHE1降低AIT小鼠血清中IFN-γ并上調(diào)IL-10含量

2.5 SJMHE1在小鼠甲狀腺及脾臟中的分布

給予小鼠FITC-SJMHE1注射后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記的SJMHE1存在于小鼠脾臟組織，而甲狀腺組織未檢測(cè)到相應(yīng)熒光標(biāo)記蛋白。見圖5。

圖5 FITC-SJMHE1在小鼠甲狀腺及脾臟中的分布

3 討論

逐年上升的患病率以及由此導(dǎo)致的甲狀腺功能破壞使得探尋AIT的新型防治策略成為研究熱點(diǎn)?！靶l(wèi)生假說(shuō)”指出，一些感染性病原體，特別是蠕蟲，有能力影響宿主的免疫系統(tǒng)，它們?cè)诟腥舅拗鞯耐瑫r(shí)亦可預(yù)防宿主自身免疫性疾病的發(fā)生，從而改善對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。這種抑制炎癥的能力既符合宿主的利益，也符合寄生蟲的利益，是數(shù)百萬(wàn)年共同進(jìn)化的結(jié)果[10]?；诖擞^點(diǎn)，“蠕蟲療法”被廣泛用于一些自身免疫性疾病的防治，例如口服豬鞭蟲可緩解炎性腸病患者的病情[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲源多肽SJMHE1在AIT小鼠發(fā)病中發(fā)揮干預(yù)作用，SJMHE1可顯著減輕AIT小鼠甲狀腺炎癥反應(yīng)并降低血清中自身抗體TgAb的水平，這在進(jìn)一步補(bǔ)充“蠕蟲產(chǎn)品”的同時(shí)亦為AIT的防治提供了新策略。

AIT是由免疫紊亂而引發(fā)的器官特異性自身免疫性疾病，也是甲狀腺最常見的病理狀態(tài)，多種細(xì)胞因子在其發(fā)病中扮演重要角色[12-13]。Th1細(xì)胞釋放的促炎因子如IFN-γ會(huì)促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞的凋亡、抑制甲狀腺激素的合成進(jìn)而引發(fā)甲狀腺功能障礙[14-15]。IL-10是一種經(jīng)典的具有抗炎特性的細(xì)胞因子，可抑制宿主針對(duì)病原體產(chǎn)生過(guò)度的免疫反應(yīng)，減輕炎癥引發(fā)的組織破壞，從而在包括AIT在內(nèi)的自身免疫性疾病中發(fā)揮抑制自身免疫反應(yīng)的重要作用[16-18]。本研究結(jié)果表明，SJMHE1可顯著降低AIT小鼠甲狀腺組織中IFN-γmRNA的表達(dá)，而上調(diào)IL-10mRNA的表達(dá)，這從分子層面提示SJMHE1可通過(guò)調(diào)節(jié)IFN-γ和IL-10來(lái)抑制免疫炎癥反應(yīng)，從而對(duì)AIT發(fā)揮一定的預(yù)防和治療作用。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SJMHE1不僅可調(diào)節(jié)過(guò)敏性哮喘小鼠肺組織中促炎和抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)，亦對(duì)脾臟中促炎及抗炎細(xì)胞因子有平衡作用[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)SJMHE1可下調(diào)AIT小鼠甲狀腺和脾臟組織中IFN-γmRNA的表達(dá)，且上調(diào)IL-10mRNA的表達(dá)，提示SJMHE1對(duì)局部或(和)全身免疫應(yīng)答有著調(diào)節(jié)作用。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步通過(guò)流式技術(shù)分析了FITC-SJMHE1在小鼠體內(nèi)的分布，發(fā)現(xiàn)SJMHE1并不能到達(dá)小鼠甲狀腺組織，然而可以到達(dá)脾臟組織，這一結(jié)果推測(cè)SJMHE1對(duì)AIT的干預(yù)并非通過(guò)對(duì)甲狀腺組織的直接作用，而是借由固有免疫器官脾臟的免疫調(diào)節(jié)來(lái)發(fā)揮功能。此外，ELISA檢測(cè)結(jié)果表明SJMHE1可下調(diào)AIT小鼠血清中IFN-γ而上調(diào)IL-10的含量。綜上結(jié)果提示，SJMHE1可能通過(guò)對(duì)脾臟IFN-γ及IL-10的調(diào)節(jié)來(lái)緩解AIT小鼠甲狀腺病理?yè)p傷。然而，SJMHE1調(diào)節(jié)IFN-γ及IL-10的具體作用機(jī)制仍需在今后的研究中進(jìn)一步闡明。